李娜,徐愷,李麗,於昊,徐錚

(南京工業(yè)大學 食品與輕工學院,江蘇 南京,211816)

2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL,CAS號：41 263-94-9)是乳糖與L-巖藻糖組成的非還原性三糖,分子式為C18H32O15,分子量488.44,結構如圖1所示。它在人乳寡糖(human milk oligosaccharide,HMO)中含量最為豐富,占比達到31%[1],在嬰幼兒的免疫力改善、腸道疾病預防、智力發(fā)育等領域效果明顯。截止目前鮮有研究證明2′-FL會給人體帶來負面影響,因而非常安全。早期2′-FL的獲得是從母乳中分離提取[2],但這種方法只適合基礎研究。為滿足商業(yè)化生產需要,Glycom A/S公司開始利用化學法合成2′-FL[3],但該方法步驟多、溶劑污染大、規(guī)?；瘧美щy,因此目前主流生產技術是更加環(huán)保且高效的微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵法以外源添加的乳糖為底物,通過微生物自身代謝途徑形成的5′-二磷酸鳥嘌呤核苷-巖藻糖二鈉鹽(guanosine 5′-diphospho-β-L-fucose sodium salt，GDP-L-巖藻糖)為前體,在巖藻糖基轉移酶的作用下合成2′-FL,已被證明具有較強的可行性。發(fā)達國家在十余年前便已開展利用微生物發(fā)酵法生產2′-FL的研究,代表性公司有丹麥Glycom A/S、德國Jennewein Biotechnologie、荷蘭Glycosyn LLC、比利時Inbiose等,最終由巴斯夫等跨國公司添加到嬰幼兒配方奶粉中銷售。據(jù)Jennewein Biotechnologie公司稱,目前2′-FL最高產量已達到180 g/L[4],并表明其生產成本在未來還具有很大的下調空間,可以大規(guī)模推廣應用。近年來,隨著國內消費者對于母乳喂養(yǎng)的觀念日益增長,各類研究機構針對2′-FL的研究逐漸增多,使我國在研發(fā)生產2′-FL方面已經具備一定實力。本文主要總結了2′-FL的生理功效以及不同制備方法的研究進展,并提出了該領域今后的研發(fā)方向,以期為2′-FL工業(yè)化生產的進步提供參考。

圖1 2′-FL的結構示意圖Fig.1 The chemical structure of 2′-FL

1 2′-FL的生理功效

近年來,國內外多個課題組對2′-FL的生理功效進行了深入研究,結果主要包括以下幾個方面：

(1)促進腸道益生菌的繁殖、抑制有害菌生長。在體外實驗中發(fā)現(xiàn),2′-(或3-)巖藻糖基乳糖的混合溶液能夠促進乳桿菌Lactobacillussp.和雙歧桿菌Bifidobacteriurmsp.的生長,且不影響Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusNRRL B-548、L.caseisubsp.caseiNRRL B-1922、L.caseisubsp.caseiAS 1.2435以及BifidobacteriumlongumNRRL B-41409等益生菌的繁殖[5]。此類益生菌大量繁殖后能夠產生豐富的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA),可以顯著降低腸道微環(huán)境的pH值并維持酸性環(huán)境來促進腸道消化酶的分泌。SCFA進一步促進了腸道內其他益生菌的生長、抑制了致病菌(包括鏈球菌、志賀氏菌、乳球菌、致病性大腸桿菌等)的繁殖；增加了腸道內鈣、鎂等礦物質的溶解,使其以離子形式存在并刺激腸道黏膜細胞生長,提高其對礦物質的吸收能力[6]。此外,雙歧桿菌的繁殖還可以促進B族維生素的合成,對蛋白質、碳水化合物、脂質代謝都起到重要作用[7]。以上實驗條件與母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒腸道情況基本一致,側面證明了2′-FL獨特的生理效果。

(2)抗病原菌粘附、促進有益菌定殖。腸道病原菌入侵人體后的第一步通常是粘附在上皮細胞、隨后開始感染組織。2′-FL與腸道上皮細胞的糖蛋白、糖鏈中的部分結構相似,因此可以誘導病原菌與其結合而不與腸道上皮細胞結合,進而阻斷其粘附、定殖過程[8]。體外實驗證明2′-FL可以抑制空腸彎曲桿菌、致病性大腸埃希氏菌、傷寒沙門菌和綠膿桿菌對人腸道細胞株Caco-2的粘附(分別減少了26%、18%、12%和17%),抑制綠膿桿菌對人呼吸道上皮細胞株A549的粘附[9],從而有助于預防腸道、呼吸道和尿路的炎癥以及傳染??；另一方面,2′-FL可以促進腸道益生菌的定殖,例如有實驗表明BifidobacteriumbifidumDNG6在含有2′-FL的實驗組中的粘附率為(9.34±0.31)%要高于含有低聚半乳糖組的實驗(6.64±0.36)%和含有葡萄糖組的實驗(7.08±0.27)%(P<0.01),發(fā)現(xiàn)了2′-FL能夠通過加強表達B.bifidumDNG6的粘附基因來提高該菌的粘附能力,從而促進其定殖[10]。

(3)對免疫系統(tǒng)進行調節(jié)、降低炎癥反應。研究表明,2′-FL可以直接通過參與細胞因子的分泌調節(jié)來影響免疫系統(tǒng)。例如2′-FL在嬰兒體內可以降低炎癥細胞因子(IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α)濃度,這與母乳喂養(yǎng)組結果基本一致,而奶粉喂養(yǎng)組則出現(xiàn)炎癥細胞因子顯著上升的情況[11]。在小鼠流感疫苗接種模型中,攝入2′-FL的小鼠脾細胞中與疫苗特異性相關的CD4+和CD8+型T細胞、γ-干擾素的產生有顯著增加,表明其改善了小鼠對接種疫苗的體液及細胞免疫反應[12]。2′-FL還能有效調節(jié)與過敏性疾病相關的腸道上皮細胞反應,選擇性的抑制抗原-抗體復合物對促炎趨化因子CCL20的釋放,進一步體現(xiàn)了其治療食物過敏和通過抑制過度的炎癥反應避免給腸道帶來二次損傷的潛力[13]。除此之外,2′-FL對右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎能起到預防作用,機理是降低條件致病菌的豐度和增加益生菌的比例,尤其是促進腸道免疫與代謝平衡的益生菌,例如Muribaculaceae、Ruminococcustorques、Lactobacillus、Bacteroides[14]。FACINELLI等[15]研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌科菌株可以在含有低聚半乳糖的環(huán)境下繁殖,但卻無法在與母乳含量相同的2′-FL環(huán)境下粘附,由于腸桿菌科細菌被認為與早產兒的壞死性小腸結腸炎相關,該結果表明2′-FL對腸桿菌科細菌具有顯著抑制作用,可以降低壞死性小腸結腸炎的風險。這些研究均展示了2′-FL可以作為一種特殊的食品成分來降低兒童或成人炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的潛力。

(4)對大腦發(fā)育有促進作用。研究人員在動物實驗中發(fā)現(xiàn),2′-FL能夠增強大鼠海馬POP-spike群體峰電位和場興奮性突觸后電位(fEPSP),有效地維持了長期信息存儲效應并大大提高了長期信息存儲效應的誘導性；在飲食中添加2′-FL有利于嚙齒動物在認知領域的提高并能夠改善學習和記憶水平[16]。因此,2′-FL在大腦發(fā)育、神經元傳遞和突觸的形成中也有一定作用,能夠刺激大腦發(fā)育和提高記憶力[17]。

綜上所述,2′-FL對嬰幼兒免疫力提高、腸道菌群調節(jié)、大腦發(fā)育等均存在有益效果,顯著改善了嬰幼兒健康、預防了疾病發(fā)生。

2 2′-FL的化學制備方法

2′-FL可以通過化學法合成獲得,Glycom A/S公司的AGOSTON等[18]開發(fā)了公斤級的合成路線,具體方法如下：(1)乳糖受體的制備。以一水乳糖為原料,保留兩個羥基功能,其余羥基以二甲縮醛形式保護,以甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)作為結晶溶劑,結晶得到化合物1。以吡啶為堿,吡喃酰氯為?；瘎?在二氯甲烷(dichloromethane,DCM)中與甲戊酰酯反應,保護6′-OH功能,進行柱層析獲得純的乳糖受體。(2)巖藻糖基供體的制備。以L-巖藻糖為原料,在“一鍋”反應中分別進行常規(guī)乙?；⒁豚绶曰痛呋摮宜狨シ磻?得到化合物2。以溴化芐為烷化劑,KOtBu為堿,在N,N-二甲基酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)中進行芐基化反應。以四氫呋喃為溶劑,結晶分離出糖基供體。(3)糖基化。選擇Lemieux方法,將糖基供體溶解在DCM中,加入5 ℃的溴將其轉化為溴蔗糖。將乳糖受體和四丁基溴化銨的DMF溶液加入到溴糖粗溶液中。攪拌后,加入甲醇,然后用60%醋酸在水中高溫裂解,從乙酸乙酯中結晶分離得到晶體,再用甲醇重結晶進一步純化。(4)目標化合物的分離。在異丙醇/甲醇/水/乙酸的混合物中進行保護基團的去除,用Pd/C和H2催化加氫脫除芐基,用MTBE甲醇沉淀法分離；最后加入異丙醇研磨,2′-FL以白色無定形固體的形式被分離得到。盡管化學合成可能具備易于放大生產、產品純度高(或雜質成分容易確定)等優(yōu)點,但是化學合成法在生產過程當中涉及有毒試劑的使用,限制了大規(guī)模應用,因此難以成為主流技術。

3 2′-FL的生物制備方法

2′-FL的生物制備方法主要包括發(fā)酵法和酶法兩種,相較于酶法需要特定的反應條件且涉及到多酶分離純化,發(fā)酵法憑借其簡便、經濟及可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)點引起了學者的廣泛關注,研究比較深入。目前2′-FL發(fā)酵法合成的途徑主要分為兩條,一條是需要使用外源L-巖藻糖的補救途徑即Salvage途徑,該途徑利用雙功能酶fkp將外源L-巖藻糖轉變?yōu)镚DP-L-巖藻糖,經巖藻糖基轉移酶將其與外源乳糖結合生成2′-FL；另一條是以葡萄糖或甘油為碳源,通過宿主進行多步代謝合成前體GDP-L-巖藻糖,最終通過表達的外源巖藻糖基轉移酶與乳糖反應獲得2′-FL,該途徑為從頭合成途徑即denovo途徑。合成途徑如圖2所示。兩種途徑都需要大量的GDP-L-巖藻糖作為產物合成前體與外源乳糖結合生產2′-FL,因此在生產菌株細胞內積累這種前體是極其關鍵的。其主要方法包括以下3種：(1)使用強啟動子或高拷貝表達策略對GDP-L-巖藻糖合成途徑進行增強,或過表達可拉酸合成途徑的陽性轉錄因子基因來實現(xiàn)(例如rcsA)；(2)敲除GDP-L-巖藻糖下游代謝的相關基因(例如wcaJ)來實現(xiàn)中間體積累；(3)對關鍵酶的限制性輔因子GTP和NADPH的合成進行調控。

(ManA-甘露糖-6-磷酸異構酶;ManB-磷酸甘露糖變位酶;ManC-α-D-甘露糖-L-磷酸鳥苷酸轉移酶;Gmd-GDP-甘露糖-6-脫氫酶;Fcl-GDP-L-巖藻糖合酶;FutC-α-1,2-巖藻糖基轉移酶;WcaJ-可拉酸生物合成酶;LacY-乳糖透過酶;LacZ-β-半乳糖苷酶;Fkp-L-巖藻激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶)圖2 2′-FL的兩條生物合成路徑Fig.2 The two biosynthetic routes of 2′-FL

3.1 發(fā)酵碳源的選擇

由于L-巖藻糖價格十分昂貴且不易獲得,使得雖然補救途徑產量更高卻缺乏實用價值,從頭合成途徑已成為目前研究的焦點。在發(fā)酵碳源的選擇上,已有文獻中較多選擇甘油；例如CHIN等[19]為降低BL21 star(DE3)水解乳糖的能力利用λ-Red重組技術改造了乳糖操縱子并在FucT2酶的N端融合了3個天冬氨酸(即D3標簽)增強其可溶性,最終在以甘油為碳源時進行發(fā)酵獲得了6.4 g/L的產物,發(fā)酵結束時菌體干重為71.1 g/L,總發(fā)酵時長為78 h,生產強度為0.118 g/(L·h)。BAUNGRTNER等[20]將2′-FL合成途徑的關鍵基因gmd、wcaG、manB、manC、futC(雙拷貝)整合到宿主染色體,用Ptac作為表達啟動子,使該菌株不需要外源質粒就可以進行基因表達,在以甘油為碳源且不添加抗生素的條件下進行高密度發(fā)酵,表達35.5 h后2′-FL的產量達到20.28 g/L,生產強度為0.57 g/(L·h),由于利用染色體整合技術得到的生產菌株不需要使用外源抗生素,因此該技術所得產品更加安全。此外,NI等[21]在大腸桿菌C41(DE3)菌株中表達了2′-FL合成相關基因manC、manB、gmd、wcaG、futC、rcsA、rcsB,并敲除了產物中間體消耗的關鍵基因wcaJ、nudK、nudD,以及半乳糖苷酶基因lacZ。所得基因工程菌在使用甘油為碳源的條件下,通過高密度發(fā)酵獲得了66.8 g/L的2′-FL,對應的菌體干重為101.24 g/L,生產強度為0.95 g/(L·h),這是目前使用甘油碳源得到的最高生產水平,該結果表明敲除支路競爭途徑、增強目標產物分支通量,有利于產物積累,并利用高密度發(fā)酵策略能夠大幅提升2′-FL的產量。

盡管葡萄糖是最為廉價的工業(yè)用碳源之一,但大腸桿菌使用它生產2′-FL的實例并不多,這可以用葡萄糖效應引起的代謝抑制來解釋[22],葡萄糖抑制了2′-FL生物合成過程中乳糖轉運基因的表達,因此很難通過葡萄糖來生產2′-FL。但也存在成功的實例,DROUILLARD等[23]通過表達futC和rcsA基因,最終獲得了14 g/L的產量,這是首次報道以葡萄糖為碳源利用從頭合成途徑合成2′-FL。HUANG等[24]在實驗中發(fā)現(xiàn)在以葡萄糖為碳源時2′-FL產量要高于甘油,他們利用質粒表達成功表達了2′-FL從頭合成途徑的相關基因以及乳糖轉運蛋白LacY,在此基礎上還敲除了lacZ、lon、wcaJ,最終成功用改良的BL21(DE3)菌株進行發(fā)酵,獲得了9.12 g/L的2′-FL。

來源于甘蔗和甜菜的蔗糖是最常見的二糖,因此在價格方面也具有工業(yè)化優(yōu)勢；Jennewein Biotechnologie公司的PARSCHAT等[25]研發(fā)了利用蔗糖為碳源高產2′-FL的菌株,該菌株共敲除6個基因,包括半乳糖苷酶基因lacZ、可拉酸合成基因wcaJ、葡萄糖轉運蛋白基因ptsG、果糖-6-磷酸代謝基因pfkA以及葡萄糖代謝基因gcd和glk；同時也通過染色體整合的方式過表達了15個基因,包括中間體GDP-L-巖藻糖合成的關鍵基因(manC、manB、gmd、wcaG),有關蔗糖轉運、水解、以及代謝的基因(cscABKR基因簇),胞內合成乳糖的代謝途徑及轉運的關鍵基因(galTpm1141、pgi、pgm、galE、lacY)以及2′-FL合成、轉運基因(wbgL、tpyB),將蔗糖分解出的葡萄糖在胞內重新合成為乳糖并參與2′-FL合成。該策略避免了與傳統(tǒng)發(fā)酵方法一般加入外源乳糖來合成2′-FL,進一步降低了成本且提高了產品質量,防止乳糖轉化為副產物(如乳果糖)帶來的不利影響。最終構建的工程菌株利用蔗糖發(fā)酵84 h產量可達60 g/L的2′-FL,表明該技術具有很高的可行性。

3.2 底盤微生物的選擇

底盤微生物選擇是2′-FL高產的關鍵因素,大多研究表明在不同大腸桿菌菌株的選擇中BL21(DE3)要優(yōu)于JM109(DE3),這是因為雖然后者在發(fā)酵過程中易產生生物膜、且乙酸產量較大,因此JM109(DE3)并不適合高密度發(fā)酵[19],利用大腸桿菌生產2′-FL的研究進展總結見表1。

表1 已報道的部分大腸桿菌合成2′-FL工藝Table 1 The reported bio-production processes of 2′-FL

枯草芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母等底盤微生物也被報道可以合成2′-FL,但目前產量均無法與大腸桿菌相比。其中產量最高的為解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica),杜邦公司的HOLLANDS等通過在其體內表達2′-FL合成途徑關鍵基因gmd、gmeR、futC(融合SUMOstar標簽),以及乳糖轉運蛋白Lac12、產物運出蛋白CDT2使得產量達到24 g/L,總生產強度為0.44 g/(L·h)[26]?？莶菅堪麠U菌作為一種食品級的模式微生物,被廣泛用于營養(yǎng)食品和重組蛋白生產的宿主。但目前并沒有在枯草芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)已知的巖藻糖降解途徑,這也是利用該菌作為底盤微生物生產2′-FL的有利條件。江南大學的劉龍課題組[27]通過在枯草芽胞桿菌中敲除lacZ基因來阻止乳糖的降解,引入LacY基因來增強底物乳糖的轉入。并在此基礎上微調輔因子GTP再生模塊基因gmd、ndk、guaA、guaC、ykfN、deoD和xpt的表達,引入回補途徑關鍵基因fkp和fucT以提高2′-FL和GDP-L-巖藻糖的產量。最終構建了1株高產2′-FL的枯草芽胞桿菌菌株,在3 L補料分批發(fā)酵罐中獲得5.01 g/L的產量。韓國YU等[28]首次報道了利用釀酒酵母生產2′-FL,他們通過在釀酒酵母中表達乳糖透過酶基因lac12以及關鍵酶基因fkp、fucT2,最終產量為0.5 g/L(120 h),但75%的2′-FL被發(fā)現(xiàn)位于胞內,僅有25%分泌到了胞外。雖然該結果表明釀酒酵母有作為2′-FL生產菌株的潛力,但由于酵母不能自主轉運乳糖、且產物大部分不能釋放到胞外等原因,使得釀酒酵母生產2′-FL的產量偏低。

酶法合成2′-FL是對發(fā)酵法的重要補充,目前尚處于探索階段。SHI等[5]篩選了不同來源的巖藻糖基轉移酶,發(fā)現(xiàn)Pedobactersp.來源的α-L-巖藻糖苷酶(PbFuc)具有合成3-FL和2′-FL的能力,當以4-硝基苯基-α-L-巖藻糖苷為底物時的轉化率達到85%,為制備有價值的功能性巖藻糖化低聚糖提供了一種新穎而有效的酶法策略。此外,LI等[29]設計了一種有前景的體外多酶級聯(lián)催化體系(MECCS),將L-巖藻糖和乳糖轉化為2′-FL。通過串聯(lián)3個酶實現(xiàn)了L-巖藻糖到2′-FL的合成路線,包括FKP、FucT、PK酶(丙酮酸激酶),其中PK酶滿足了催化過程中對ATP和GTP的需求。他們在篩選巖藻糖基轉移酶時發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)來源FucT酶(HpFucT)的催化效率(kcat/Km)最高,以乳糖為底物時達到39.28 L/(mmol·min)。最終,含有HpFucT的多酶催化體系35 h內獲得25.88 g/L的產物,生產強度為0.73 g/(L·h),這是首次利用改良的GDP-L-巖藻糖回收途徑與丙酮酸激酶結合來再生昂貴的輔因子ATP和GTP來生產2′-FL,為GDP-L-巖藻糖的生產提供了持續(xù)和充足的供應,也為關鍵中間體GDP-L-巖藻糖的積累提供了新思路。

4 2′-FL的下游分離提取

生物法制備的2′-FL必須通過嚴格的下游分離提取過程才能夠成為合格產品,因此下游分離提取極為重要?；竟に嚥襟E包括除菌、除鹽、除色素、噴霧干燥與制粒等,不僅要求徹底除菌,還要求去除可溶性蛋白、多糖、核酸、色素等其他雜質。下游分離提取成本高昂,因此如何兼顧成本與產品質量成為產業(yè)化的關鍵問題。除此之外副產物的含量也對產品分離造成了困難,活性較高的巖藻糖基轉移酶futC除了以乳糖為受體結合GDP-L-巖藻糖生成2′-FL,還會將2′-FL作為受體繼續(xù)結合GDP-L-巖藻糖生成四糖副產物——乳糖二巖藻糖(difucosyllactose,DFL)[7]。CHIN等篩選到了來自于脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)的巖藻糖基轉移酶WcfB,報道稱該酶在合成2′-FL時沒有副產物DFL生成進而有利于下游分離提取,利用表達有該酶的重組大腸桿菌可以獲得15.4 g/L的產量,生產強度為0.53 g/(L·h)[30]。由于目前主流生產企業(yè)如巴斯夫、雀巢等公司的公開專利中仍使用大腸桿菌作為生產宿主,其主要原因是生長周期短、菌種構建難度低、更有利于盈利,因此有必要對探索去除內毒素的有效方法進行深入研究,提高工藝安全性。

5 展望

據(jù)中國發(fā)展研究基金會統(tǒng)計,我國的母乳喂養(yǎng)率不足30%,遠低于國際平均水平。由于國內消費者對于母乳喂養(yǎng)的觀念的逐漸形成,母乳類添加劑產品的前景十分光明。2′-FL作為母乳中含量最高的寡糖,其生理功效已獲得了越來越多的佐證并取得廣泛關注,產品需求旺盛,因此實現(xiàn)2′-FL國產化生產具有重要的國民健康戰(zhàn)略意義。隨著基因編輯等前沿技術的不斷發(fā)展,未來針對生產菌株的食品安全性要求與日俱增,開發(fā)替代大腸桿菌的食品級底盤微生物將成為研發(fā)熱點,未來可以結合代謝工程、蛋白質工程、啟動子工程和發(fā)酵工程等多種修飾策略來進一步改良GRAS菌株作為2′-FL的生產平臺。然而在產量和生產強度上能否媲美大腸桿菌的產量還有待驗證?？紤]到工業(yè)化對生產成本的較高要求,開發(fā)以葡萄糖或廉價生物質(纖維素水解液、糖蜜、菊粉等)為碳源的2′-FL制備方法有利于增強技術路線的競爭力。同時,尋找高效的巖藻糖基轉移酶,根據(jù)蛋白質結構合理設計酶來提高2′-FL產量是一個必需的策略。此外,酶(多酶)固定化可以實現(xiàn)酶的重復利用、降低生產成本、提高產品轉化效率。目前利用固定化酶生產2′-FL的研究相對較少,因此酶固定化方法在2′-FL的酶法生產中具有良好的應用潛力。鑒于目前2′-FL的產量已達到數(shù)每升數(shù)十克以上,未來在嬰幼兒配方產品中大規(guī)模使用指日可待,將對該領域市場產生前所未有的推動作用。