馬凱恒，謝牧洪，鄭欣悅，賈彩霞，洪心悅，孫宇棟，楊桂燕

（西北農(nóng)林科技大學(xué) a.林學(xué)院；b.陜西省核桃工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

植物為適應(yīng)外界不利環(huán)境條件影響，進(jìn)化出體內(nèi)平衡機(jī)制進(jìn)行應(yīng)對。核桃Juglans regia在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，種質(zhì)資源豐富，是精準(zhǔn)脫貧、鄉(xiāng)村振興和生態(tài)建設(shè)的重要樹種[1]。隨著核桃加工技術(shù)在醫(yī)藥、化工、工藝美術(shù)等多領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)鏈的形成，優(yōu)良品種選育、抗病分子機(jī)制研究相對薄弱，已成為核桃單產(chǎn)提高及產(chǎn)量穩(wěn)定、核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的不利因素[2]。近年來，病蟲害的大面積爆發(fā)導(dǎo)致許多產(chǎn)區(qū)的核桃產(chǎn)量逐年下降，嚴(yán)重影響了地方綜合經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。我國核桃病害近30 種，危害涉及根、莖、葉、果實(shí)、嫩梢等各部位，其中以核桃炭疽病尤為突出，輕則影響產(chǎn)量和品質(zhì)，重則可致絕收、樹死[5]。但由于病害侵染核桃的機(jī)制不明，每年病害發(fā)生的具體時(shí)間把握不準(zhǔn)，不能有效地制定防治措施。因此，加強(qiáng)核桃抗病機(jī)制研究，增強(qiáng)核桃樹病害科學(xué)防治，是提高核桃產(chǎn)量和品質(zhì)的基本前提。

植株受到病原危害時(shí)，其免疫系統(tǒng)會(huì)立即做出反應(yīng)。植物免疫系統(tǒng)受各類激素信號(hào)分子調(diào)節(jié)，其中脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellin，GA）在病害防御響應(yīng)中的作用受到越來越多的關(guān)注。Javier 等[6]證實(shí)ABA 在植物免疫中的作用通過PYR1 受體介導(dǎo)。AcTPR2在獼猴桃Actinidia chinensis中對灰葡萄孢Botrytis cinerea的反應(yīng)與GA 相關(guān)[7]。病害響應(yīng)極可能引發(fā)植株的抗逆防衛(wèi)反應(yīng)，其中抗氧化酶活性變化是最常見和最基本的體現(xiàn)。如，棉花Gossypium hirsutum胚芽樣蛋白（Germin-like protein，GLP）GhABP19在調(diào)節(jié)植物對黃萎病Cyanosis和枯萎病Blight的抗性中對超氧化物歧化酶（SOD）活性的激發(fā)具有重要意義[8]。在橡膠樹Hevea brasiliensis對棕櫚疫霉菌Phytophthora palmivora誘導(dǎo)抗性中，過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性明顯增加[9]。用有益微生物（細(xì)菌和真菌）處理過的植物中可觀察到谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST基因的誘導(dǎo)或GST活性的升高，這些微生物可誘導(dǎo)對后續(xù)病原體感染的系統(tǒng)抗性反應(yīng)（ISR）[10]。在這些抗氧化酶保護(hù)酶中，GST家族基因成員眾多，功能多樣，成為林木、農(nóng)作物等抗逆育種的重要候選基因鑒定對象。

GST是具有解毒、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）等功能的二聚體酶家族，在植物基因組中包含Phi、Tau、Theta 和Zeta 等4 大亞類[11]，其中Tau類GST在植物生物與非生物逆境響應(yīng)中具有重要作用。如，羽衣甘藍(lán)Brassica oleraceaBoGSTU19和BoGSTU24能響應(yīng)低溫脅迫被上調(diào)表達(dá)，推測其與抗寒相關(guān)[12]。核桃JrGSTTau1基因的超量表達(dá)能有效提高植株應(yīng)對干旱和冷害脅迫[1,13]。大豆Glycine maxGmGSTU2-2對滲透脅迫具有高度特異性，認(rèn)為GmGSTU2-2涉及植物脅迫的廣泛催化和調(diào)節(jié)功能網(wǎng)絡(luò)[14]?？梢?，Tau 類GST 是植株應(yīng)對非生物脅迫的重要蛋白，對其進(jìn)行鑒定，有助于揭示植株的抗性響應(yīng)機(jī)制。目前，雖已從不少植株中克隆獲得了一些GST成員，但Tau 類的發(fā)掘相對不足，尤其是木本植物Tau 類GST的報(bào)道較少。在GST功能解析上，以干旱、低溫、鹽、重金屬[1,13,15-16]為主，對GST參與生物脅迫的報(bào)道較少，核桃GST 挖掘更是不夠。因此，本研究在前期對核桃GST家族成員挖掘的基礎(chǔ)上，對其中一條Tau 類GST（JrGSTU8）的基本生物信息及核桃炭疽病響應(yīng)功能進(jìn)行解析，以期為核桃抗病調(diào)控及管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

植物材料：2年生‘香玲’核桃嫁接苗。

病原材料：膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides（簡寫TJ），作者所在團(tuán)隊(duì)前期鑒定保存。

處理：分別制備濃度為1×106個(gè)·L-1的膠孢炭疽菌分生孢子液，配置100 μmol·L-1ABA 及GA 溶液。對植株分別進(jìn)行TJ、ABA、GA、TJ+ABA、TJ+GA噴灑處理。以噴水處理為對照。在處理第0（對照）、1、6、9、12 天分別取葉和莖，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。每個(gè)處理包含6 棵植株。

1.2 JrGSTU8 基因鑒定與分析

用“glutathione transferase”在‘香玲’核桃轉(zhuǎn)錄組中篩選GST基因，經(jīng)Blast 同源比對選取其中的1 條Tau 類GST（命名為JrGSTU8）進(jìn)行分析。JrGSTU8基因的開放讀碼框（ORF）用ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）確定。根據(jù)確定的ORF 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物JrGSTU8-F（5′-ATGGCTCTAAAACTGAAAGG-3′）和JrGSTU8-R（5′-CTATTTGGAGGCATCGGTAC-3′）。經(jīng)PCR 及測序確定后的JrGSTU8序列基本特征通過Expasy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）確認(rèn)。使用CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對JrGSTU8的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用BLASTP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）對同源蛋白進(jìn)行搜索；利用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用NEW PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析啟動(dòng)子順式作用元件。利用Swiss Model（https://swissmodel.expasy.org/）推測其蛋白三維結(jié)構(gòu)。

1.3 JrGSTU8 基因響應(yīng)病害的表達(dá)分析

采用CTAB 方法提取各樣品總RNA[1]。RNA 經(jīng)DNA 消化酶后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit（CWBIO，康為世紀(jì)，中國）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并經(jīng)10 倍稀釋后用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的模板。使用SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）制備qRTPCR 反應(yīng)體系，在Applied Biosystems 生產(chǎn)的StepOneTMReal-Time PCR System 進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃/30 s；94℃/12 s，60℃/45 s，72℃/45 s，45 個(gè)循環(huán)；81℃/1 s，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。JrGSTU8定量引物為DL-F（5′-TACATCGATGAGACCTGG-3′）和DL-R（5′-AATCCAATCGCCTCTCCT-3′）。內(nèi)參基因?yàn)楹颂?8S rRNA（HE574850），引物為18S-F（5′-GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT-3′）和18S-R（5′-TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3′）[13]。定量結(jié)果用2-△△Ct法[17]分析，表示為相對于內(nèi)參基因相對于對照（清水處理）的相對表達(dá)值。數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件包（SPSS，Chicago，Illinois，USA）分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。不同時(shí)間點(diǎn)與0 d 之間的表達(dá)差異用T 檢驗(yàn)分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 JrGSTU8 基因基本生物信息

JrGSTU8基因ORF 長612 bp，推導(dǎo)蛋白的分子量為23 145.57 Da，含有203 個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為6.61，具有GST-Tau 保守域（圖1），表明該蛋白屬于Tau 類GST，因此命名為JrGSTU8。BLAST 發(fā)現(xiàn)該基因與核桃基因組中的GSTU8基因（GeneBank 登錄號(hào)：XP_018849017.1）相同。經(jīng)同源搜索并進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)JrGSTU8與楊梅Morella rubra的同源蛋白MrGSTU8進(jìn)化關(guān)系較近（圖2）。Swiss Model 同源建模預(yù)測的蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖1 JrGSTU8 蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 The conserved domain of JrGSTU8 protein

圖2 JrGSTU8 與其他物種相似蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of JrGSTU8 and its homologs from other species

圖3 JrGSTU8 蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.3 3D structure of JrGSTU8 protein

2.2 JrGSTU8 基因啟動(dòng)子特性

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找核桃基因組數(shù)據(jù)，鑒定獲得其上游1 443 bp 的DNA 序列作為啟動(dòng)子并進(jìn)行順式作用元件分析，NEW PLACE 預(yù)測顯示，該啟動(dòng)子正、反向共包含307個(gè)順式作用元件位點(diǎn)，屬于80 類不同元件，其中正向54 類，包括啟動(dòng)子常有元件TATABOX，種子、根、花粉等特異組織表達(dá)相關(guān)的元件，有GA、ABA、乙烯、植物生長素等植物激素相關(guān)的元件，也有熱脅迫相關(guān)的CCAATBOX1、低溫相關(guān)的LTRE1HVBLT49、干旱相關(guān)的MYCATERD1、銅脅迫相關(guān)的CURECORECR 等非生物脅迫響應(yīng)元件，以及病害響應(yīng)相關(guān)的BIHD1OS、WBOXATNPR1、WRKY71OS、RAV1BAT 等元件（表1）。

表1 NEW PLACE 預(yù)測的JrGSTU8 啟動(dòng)子正向包含的順式作用元件Table 1 Cis-acting regulatory elements in JrGSTU8 promoter predicted by NEW PLACE in forward strand

續(xù)表1Continuation of table 1

2.3 JrGSTU8 基因響應(yīng)ABA 和GA 的表達(dá)

對試材分別進(jìn)行ABA、GA 處理。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)JrGSTU8能被ABA、GA 顯著誘導(dǎo)，且體現(xiàn)了葉、莖表達(dá)差異性。ABA 處理下，JrGSTU8在葉和莖中的表達(dá)隨脅迫時(shí)間變化表現(xiàn)出相似趨勢，在1～12 d 時(shí)的表達(dá)水平均顯著高于0 d，9 d 達(dá)到最大值，分別為0 d 的4.89、3.69倍（圖4A）。GA 處理下，JrGSTU8在葉和莖中的轉(zhuǎn)錄模式相似，在9 d 達(dá)到最大值，分別為0 d的5.51、4.30 倍（圖4B）。且ABA 和GA 處理下，JrGSTU8在葉和莖中的表達(dá)變化相似（圖4）?？梢姡琂rGSTU8基因可被ABA 和GA 誘導(dǎo)，在功能行使中可能涉及ABA 和GA 信號(hào)通路。

圖4 JrGSTU8 基因在ABA（A）和GA（B）處理下的表達(dá)水平Fig.4 The expression level of JrGSTU8 gene under ABA (A) and GA (B) treatments

2.4 JrGSTU8 基因響應(yīng)核桃炭疽病的表達(dá)

膠孢炭疽菌處理后JrGSTU8基因的轉(zhuǎn)錄水平被顯著提高，且體現(xiàn)了組織表達(dá)特異性（圖5）。在葉中，JrGSTU8基因在0～1 d 之間的表達(dá)變化不明顯，之后急劇上升，到9 d 達(dá)最大值，之后緩慢下降，1～12 d 的表達(dá)值分別為0 d 的1.18、3.19、4.32、4.09 倍。在莖中，與葉中不同的是在6、9 d 的表達(dá)相近，之后下降較快，1～12 d的表達(dá)值分別為0 d 的1.07、5.09、5.17、4.16 倍。可見，JrGSTU8基因能被核桃炭疽病正向誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 JrGSTU8 基因在膠孢炭疽菌脅迫下的表達(dá)水平Fig.5 The expression level of JrGSTU8 gene under C.gloeosporioides stress

2.5 ABA 和GA 對JrGSTU8 基因響應(yīng)炭疽病的影響

為了探明ABA 和GA 對JrGSTU8基因響應(yīng)炭疽病是否有調(diào)控作用，對核桃分別進(jìn)行TJ+ABA、TJ+GA 處理，并與單一TJ、ABA、GA 處理進(jìn)行表達(dá)水平分析，發(fā)現(xiàn)JrGSTU8基因響應(yīng)炭疽病的表達(dá)水平能被ABA 和GA 明顯提高（圖6），且表達(dá)趨勢變化與對應(yīng)單一的ABA 和GA 處理更為相似（圖4）。在TJ+ABA 脅迫下，1～12 d 葉中JrGSTU8基因的表達(dá)水平分別是炭疽菌單獨(dú)處理下的1.08、1.11、1.30、2.19、1.60 倍；莖中JrGSTU8基因的表達(dá)值在1～12 d 分別為單獨(dú)炭疽菌脅迫下的1.91、2.35、1.50、1.91、1.60 倍（圖5、圖6A）。在TJ+GA 處理下，在葉和莖中的表達(dá)差距分別在1.08～1.77、1.30～2.89 倍（圖5、圖6B）?？梢?，ABA 和GA 對JrGSTU8基因響應(yīng)核桃炭疽病具有一定調(diào)節(jié)作用。

圖6 JrGSTU8 基因在膠孢炭疽菌與ABA（A）及GA（B）共同處理下的表達(dá)水平Fig.6 The expression level of JrGSTU8 gene under TJ+ABA (A) and TJ+GA (B)

3 討 論

核桃作為我國廣大山區(qū)脫貧致富、鄉(xiāng)村振興的重要特色經(jīng)濟(jì)木本油料樹種，在提高種植戶經(jīng)濟(jì)收入、推動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展上具有重要作用。核桃經(jīng)濟(jì)效益與核桃產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)，但由于近年核桃病害發(fā)生嚴(yán)重，核桃產(chǎn)量和品質(zhì)得不到保障，嚴(yán)重影響了核桃經(jīng)濟(jì)效益。為了保證核桃產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、高質(zhì)，必須對核桃應(yīng)對不同氣候條件、病蟲等制約因子具有準(zhǔn)確把握與科學(xué)應(yīng)對措施，尤其每年核桃病害發(fā)生的變化大，可控性相對差，需對其更加關(guān)注。這就要求選育核桃抗病優(yōu)良品種，掌握核桃主要病害發(fā)生規(guī)律及防御機(jī)制。GSTs 具有多重生物學(xué)功能，在植物多重逆境響應(yīng)中具有重要作用，其中，Tau 類GST 的功能更為豐富。如毛果楊Populus trichocarpaGSTU16和GSTU45的表達(dá)能被三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotoluene）誘導(dǎo)，可能與有毒環(huán)境污染物的代謝有關(guān)[18]。水稻Oryza sativa OsGSTU30的表達(dá)能被干旱提高，OsGSTU30過表達(dá)株系對干旱耐受性強(qiáng)于野生型[19]。缺乏功能性GSTU13導(dǎo)致植株幾種真菌病原體的易感性增強(qiáng)，包括白粉菌Erysiphe pisi、膠孢炭疽病菌等[20]。因此，本研究我們克隆獲得一條Tau 類GST基因，JrGTSU8，進(jìn)行抗炭疽病響應(yīng)潛力分析。

首先，由于啟動(dòng)子起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，可預(yù)測對應(yīng)基因的功能。如，核桃JrDof3基因啟動(dòng)子中含有干旱等脅迫響應(yīng)元件，推測JrDof3可能與植物干旱等逆境響應(yīng)過程相關(guān)[21]。海蓬子Salicornia brachiataSbGSTU基因啟動(dòng)子包含病害、損傷、激素響應(yīng)及MYB、MYC 等轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別元件，調(diào)控該基因應(yīng)對滲透脅迫[22]。玉米Zea maysZmCIPK10基因啟動(dòng)子包含ABA、GA、SA 等元件，參與調(diào)控ZmCIPK10響應(yīng)NaCl、干旱等[23]。為了對JrGTSU8基因的功能進(jìn)行快速有效的預(yù)測，分析了JrGTSU8基因啟動(dòng)子及其包含的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)JrGSTU8基因上游啟動(dòng)子中有80類不同元件，包含與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的如CCAATBOX1、LTRE1HVBLT49、MYCATERD1 等各類元件，其中病害響應(yīng)及GA、ABA 信號(hào)通路相關(guān)元件較多，如BIHD1OS、WBOXATNPR1、WRKY71OS、RAV1BAT、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A、PYRIMIDINEBOXHVEPB1、CAREOSREP1（表2）。由于抗病響應(yīng)通常涉及GA 和ABA 信號(hào)通路，如，PYR1的表達(dá)受ABA 調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)抗病性[6]；水稻NAC 轉(zhuǎn)錄因子ONAC066可通過抑制ABA 信號(hào)正向調(diào)節(jié)植株的抗病性[24]；新型大豆異源基因GmDIR22的表達(dá)可被GA 誘導(dǎo)且有助于促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成并增強(qiáng)對大豆疫霉菌的抗性[25]。在病毒侵染野生大豆之前噴施GA 可以促進(jìn)植株的生長，誘導(dǎo)植株抗病反應(yīng)，降低病毒危害[26]。由此可推測，JrGSTU8基因很可能參與植物抗病響應(yīng)過程。

為探明JrGSTU8基因是否參與病害響應(yīng)，對核桃進(jìn)行ABA、GA、膠孢炭疽菌、膠孢炭疽菌+ABA、膠孢炭疽菌+GA 等處理，分析不同感染時(shí)間葉和莖的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，JrGSTU8基因可被ABA、GA 及炭疽病誘導(dǎo)表達(dá)，且體現(xiàn)了組織表達(dá)差異（圖4～5）。更為重要的是，JrGSTU8基因在同時(shí)進(jìn)行炭疽病和ABA（TJ+ABA）、炭疽病與GA（TJ+GA）處理時(shí)，其表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)炭疽病脅迫下的表達(dá)水平（圖4～6）?？梢?，ABA 和GA 存在情況下，JrGSTU8基因轉(zhuǎn)錄活性被更加顯著地誘導(dǎo)。這與其他基因響應(yīng)病害表達(dá)的情況一致。如，小麥Triticum aestivum糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaSTP6 受ABA 誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)條狀銹菌Puccinia striiformis糖吸收而增強(qiáng)植株易感性[27]。大豆GmKR3的過表達(dá)增強(qiáng)大豆病毒抗性部分通過ABA 信號(hào)實(shí)現(xiàn)[28]。組蛋白去乙?；福℉DAC）受GA 介導(dǎo)參與水稻巴卡奈病Fusarium fujikuroi的響應(yīng)[29]。棉花GhMPK11在本氏煙草植物中的過表達(dá)可以通過GA 信號(hào)通路增強(qiáng)煙草對青枯病菌Ralstonia solanacearum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani的易感性[30]。大豆GmDIR22基因的表達(dá)水平被外源GA 的增強(qiáng)而明顯提高，并提高了抵抗大豆疫霉菌的能力[26]。本研究JrGSTU8基因響應(yīng)炭疽病的表達(dá)活性被ABA和GA 顯著增強(qiáng)，表明ABA 和GA 對JrGSTU8基因的抗病響應(yīng)極可能具有積極調(diào)節(jié)作用。但本研究未在植株中表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證，ABA 和GA 對JrGSTU8基因的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步確定。在后續(xù)研究中，將構(gòu)建JrGSTU8基因植物過表達(dá)及抑制表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入木本和草本植株中獲得JrGSTU8過量表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，全面解析JrGSTU8的抗炭疽病功能。