不同性別平衡易位攜帶者胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)相關(guān)遺傳學(xué)分析

何 萍 李哲濤 王文丹 韋朔峰 嚴(yán)提珍

廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科（柳州市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），廣西柳州 545001

染色體是承載遺傳信息的特有物質(zhì)。人類體細(xì)胞的染色體數(shù)目為23對(duì)，包括22對(duì)常染色體和1對(duì)性染色體，并有特定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。一旦染色體數(shù)目或形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，稱為染色體異常。而染色體異常是導(dǎo)致不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等發(fā)生的主要原因。而染色體平衡易位是染色體結(jié)構(gòu)異常中發(fā)生率極高的一大類。染色體平衡易位攜帶者，指的是無(wú)遺傳物質(zhì)丟失的染色體結(jié)構(gòu)異常，且無(wú)臨床表型者，其發(fā)生率為1/500[1]。染色體平衡易位攜帶者，雖然其表型正常，但是在其生育過(guò)程中，由于染色體重組時(shí)可產(chǎn)生高比例的非平衡配子，而極易導(dǎo)致不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等不良生育史的發(fā)生[2]。根據(jù)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂機(jī)理，理論上，常染色體相互平衡易位攜帶者可有18種配子產(chǎn)生，羅氏易位可有6種配子產(chǎn)生，但由于易位發(fā)生的染色體組別、片段大小、位置及易位發(fā)生片段所攜帶功能基因以及攜帶者性別等不同，臨床上其能形成成熟配子、胚胎及生長(zhǎng)至不同發(fā)育階段胚胎臨床上有很大差異。

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）是輔助生殖技術(shù)與遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的，近年迅速發(fā)展起來(lái)的新型孕前診斷技術(shù)，通過(guò)體外受精（in vitro fertilization，IVF）或者卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）在胚胎植入宮腔前，對(duì)胚胎或者對(duì)卵裂球或極體行活檢，通過(guò)染色體核型分析和基因檢測(cè)而獲得無(wú)疾病表型的優(yōu)質(zhì)胚胎的輔助生殖技術(shù)。針對(duì)染色體平衡易位攜帶者，PGT的出現(xiàn)，可以阻止復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等的發(fā)生成為可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取柳州市婦幼保健院2017年1月至2021年6月行外周血染色體檢查的不孕不育夫婦進(jìn)行核型分析，篩選出平衡易位攜帶者，并對(duì)平衡易位攜帶者夫婦實(shí)施輔助生殖技術(shù)，對(duì)囊胚期胚胎采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行PGT。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色體核型分析 受檢者簽署知情同意書(shū)后采集外周血2 ml進(jìn)行常規(guī)染色體培養(yǎng)、制片后，進(jìn)行染色體G顯帶核型分析，篩選染色體平衡易位攜帶者。

1.2.2 體外受精培養(yǎng)及胚胎活檢 根據(jù)卵巢功能選擇合適的促排方案，于取卵后4 h行ICSI，授精后16～18 h檢測(cè)受精情況，胚胎培養(yǎng)至第3天評(píng)估胚胎生長(zhǎng)情況。正常授精后第3天卵裂球≥6個(gè)，碎片<20%，卵裂均勻者視為優(yōu)質(zhì)胚胎。于第5天或者第6天囊胚期進(jìn)行胚胎活檢，并取出適量滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè) 活檢細(xì)胞樣本轉(zhuǎn)移至聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）管，采用植入前胚胎染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（貝瑞和康）進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和純化，然后通過(guò)Next Seq CN500測(cè)序平臺(tái)（Illumina公司）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)科孕安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（貝瑞和康）對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并參考人類基因組hg19版本出具胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)（preimplantation genetic testing for structural rearrangements，PGT-SR）報(bào)告。質(zhì)控要求：DNA 濃度≥10 ng/μL，原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后 reads≥2.7 M，Q30 的堿基百分比≥80%，分析標(biāo)準(zhǔn)為Uniq reads≥1.5 M，對(duì)染色體進(jìn)行整倍體、微缺失及微重復(fù)的判讀，判讀范圍：23對(duì)染色體非整倍體、4 Mb及以上片段的缺失/重復(fù)、30%及以上的嵌合。

1.3 觀察指標(biāo)

通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行PGT，獲得不同性別的平衡易位攜帶者囊胚期胚胎染色體組類型和構(gòu)成情況，包括可移植胚胎（正常/平衡易位攜帶胚胎）、單純不平衡胚胎（親代染色體易位導(dǎo)致染色體重排引起的染色體非整倍體或者拷貝數(shù)變異）、散發(fā)性異常胚胎（非親代染色體易位相關(guān)的染色體非整倍體或拷貝數(shù)變異）、復(fù)雜性異常胚胎（同時(shí)包括前面兩種異常情況）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（±s）表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體平衡易位攜帶者外周血染色體核型分析

通過(guò)染色體核型分析，共篩選出113對(duì)其中一方為染色體平衡易位攜帶者的夫婦，女性攜帶者42例，男性攜帶者71例（表1）。

表1 染色體平衡易位攜帶者外周血染色體核型分析

2.2 染色體平衡易位攜帶者囊胚期胚胎高通量測(cè)序結(jié)果分析

應(yīng)用高通量測(cè)序行PGT-SR檢測(cè)，共檢測(cè)738個(gè)囊胚期胚胎，來(lái)自男性攜帶者461個(gè)，女性攜帶者277個(gè)，檢測(cè)失敗15個(gè)（來(lái)自男性攜帶者8個(gè)，女性攜帶者7個(gè)）。獲得可移植胚胎168個(gè)，其中來(lái)自男性攜帶者的126個(gè)，來(lái)自女性攜帶者的42個(gè)。男性相互平衡攜帶者獲得可移植胚胎率、單純不平衡胚胎率、散發(fā)性異常胚胎率、復(fù)雜性異常胚胎率分別為27.8% （126/453）、19.6% （64/327）、41.6% （136/327）、38.8%（127/327）；女性相互平衡攜帶者獲得可移植胚胎率、單純不平衡胚胎率、散發(fā)性異常胚胎率、復(fù)雜性異常胚胎率分別為15.5%（42/270）、25.9%（59/228）、32.9%（75/228）、41.2%（94/228）。不同親本來(lái)源的可移植胚胎率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（父源27.8%，母源 15.5%，χ2=15.253，P<0.05），單純不平衡胚胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（父源19.5%，母源25.9%，χ2=3.096，P>0.05），不同親本來(lái)源的散發(fā)性異常胚胎率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（父源41.6%，母源32.9%，χ2=4.310，P<0.05），不同親本來(lái)源的復(fù)雜性異常胚胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（父源38.9%，母源41.2%，χ2=0.320，P>0.05）（表 2）。

表2 染色體平衡易位攜帶者囊胚期胚胎高通量測(cè)序結(jié)果分析[%（n/N）]

3 討論

染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變是導(dǎo)致不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等發(fā)生的主要遺傳學(xué)病因。PGT作為新型的孕前診斷技術(shù)，針對(duì)染色體平衡易位攜帶者，在胚胎植入前篩選非整倍體異常胚胎，獲得正常或平衡易位攜帶優(yōu)質(zhì)胚胎，從而顯著減少不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等的發(fā)生。

另外，PGT的取材主要來(lái)源于卵母細(xì)胞極體、卵裂球及囊胚滋養(yǎng)外胚層。卵裂球是臨床上應(yīng)用最廣的PGT活檢來(lái)源[3]。許多來(lái)咨詢PGT的平衡易位攜帶夫婦，既希望通過(guò)PGT獲得正?；蚱胶庖孜粩y帶優(yōu)質(zhì)胚胎，又擔(dān)心活檢會(huì)對(duì)胚胎本身造成不利影響。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明在胚胎發(fā)育至第3天移走1～2個(gè)細(xì)胞并不影響胚胎的后續(xù)發(fā)育[4]，但是活檢的材料少，卵裂期胚胎存在高嵌合率[5]，為35%～40%，影響PGT的準(zhǔn)確性。囊胚滋養(yǎng)外胚層可以活檢2～10個(gè)細(xì)胞，相較于卵母細(xì)胞極體、卵裂球單細(xì)胞活檢，其能提供更多的材料，提高了PGT的準(zhǔn)確性，且不涉及發(fā)育成胎兒部分的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，從而避免了活檢對(duì)胚胎所造成的不利影響[6]。另外，囊胚期胚胎嵌合體發(fā)生率較低，許多研究表明囊胚期活檢優(yōu)于卵裂期活檢[7]。

理論上，根據(jù)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂原理，常染色體相互平衡易位攜帶者可以產(chǎn)生18種配子，1/18概率染色體完全正常，1/18概率染色體平衡易位攜帶而臨床表型無(wú)明顯異常，其余16/18均為部分單體或者三體不平衡異常配子，后者臨床表現(xiàn)通常為不育、流產(chǎn)、畸胎、死胎、及出生缺陷等。換句話說(shuō)，理論上常染色體平衡易位攜帶者可有2/18（11%）概率獲得正常子代可能，不同親本來(lái)源對(duì)正常子代獲得率沒(méi)有影響。有些研究認(rèn)為，不同親本來(lái)源獲得的實(shí)際可移植胚胎率（正常子代獲得率）可能與理論值不一致，染色體相互易位的遺傳風(fēng)險(xiǎn)與相互易位攜帶者性別相關(guān)，不同性別的攜帶者獲得可移植胚胎比例可能存在差異[8-9]。本研究結(jié)果顯示，男性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為27.8%（>11%），女性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為15.5%（>11%），不同性別的攜帶者獲得可移植胚胎比例均高于理論值。

有些研究認(rèn)為，不同親本來(lái)源的正常子代獲得率與理論概率是存在差異性的，Zhang等[10]研究相互易位親本來(lái)源對(duì)子代減數(shù)分裂染色體分離方式發(fā)現(xiàn)，男性相互易位攜帶者正常平衡胚胎率為42.71%，女性攜帶者為38.85%；Idowu等[11]研究發(fā)現(xiàn)男性平衡易位攜帶者獲得整倍體胚胎比例為25%，女性平衡易位攜帶者為26%。在本研究中，男性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為27.8%（126例），女性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為15.5%（42例），不同親本來(lái)源的獲得可移植胚胎率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），男性攜帶者獲得可移植胚胎率明顯高于女性攜帶者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Mateu-Brull等[12-13]研究相符，但與Zhang等[10]的研究結(jié)果不一致。通過(guò)分析比較發(fā)現(xiàn)，上述研究結(jié)果的非一致性主要源于研究對(duì)象選擇及研究方法的差異，Zhang等[10]將平衡易位作為整體研究對(duì)象，忽略了相互平衡易位與羅氏易位遺傳風(fēng)險(xiǎn)的背景差異，而Idowu等[11]研究方法主要采用SNP array技術(shù)，有研究表明NGS能發(fā)現(xiàn)更多拷貝數(shù)變異和低比例的嵌合體[14]，本研究應(yīng)用了NGS技術(shù)，但是沒(méi)有詳細(xì)羅列出相互平衡易位與羅氏易位的結(jié)果比較。

理論上，針對(duì)常染色體相互平衡易位攜帶者，其產(chǎn)生的部分單體或者部分三體一般源于發(fā)生相互易位的染色體。早期胚胎植入前遺傳學(xué)診斷主要采用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)親本相互易位的染色體是否異常[15-16]。然而近些年進(jìn)展性研究發(fā)現(xiàn)，配子異常不僅僅局限于出現(xiàn)相互易位的染色體，其他染色體也會(huì)發(fā)生散發(fā)性染色體非整倍體變異或拷貝數(shù)變異，或者同時(shí)包括相互易位的染色體和其他染色體。隨著NGS技術(shù)在染色體平衡易位攜帶者植入前遺傳學(xué)檢測(cè)應(yīng)用逐步廣泛，以其高分辨率、高通量、一次性檢測(cè)更多CNV、準(zhǔn)確性高、費(fèi)用少、診斷迅速，將成為PGT強(qiáng)有力的檢測(cè)手段[17-19]。本研究結(jié)果顯示，男性相互平衡易位攜帶者單純不平衡胚胎率為19.6%（64例），女性相互平衡易位攜帶者為25.9%（59例），不同親本來(lái)源的單純不平衡胚胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），女性相互平衡易位攜帶者單純不平衡胚胎率略高于男性攜帶者，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；男性相互平衡易位攜帶者散發(fā)性異常胚胎率為41.6%（136例），女性相互平衡易位攜帶者為33.9%（75例），不同親本來(lái)源的散發(fā)性異常胚胎率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），男性相互平衡易位攜帶者散發(fā)性異常胚胎率明顯高于女性攜帶者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；男性相互平衡易位攜帶者復(fù)雜性異常胚胎率為38.8%（127例），女性相互平衡易位攜帶者為41.2%（94例），不同親本來(lái)源的復(fù)雜性不平衡胚胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

綜上所述，本研究比較分析不同性別的染色體相互平衡易位攜帶者囊胚期胚胎染色體構(gòu)成情況及影響，結(jié)果表明，女性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎比例低于男性攜帶者，單純不平衡胚胎及復(fù)雜性異常胚胎比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能與研究數(shù)據(jù)相對(duì)有限相關(guān)，而散發(fā)性異常胚胎比例為男性相互平衡易位攜帶者明顯高于女性攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，染色體相互平衡易位攜帶行PGT時(shí)，遺傳咨詢應(yīng)考慮親本來(lái)源對(duì)子代胚胎產(chǎn)生的不同影響并告知患者知情。值得一提的是，不同親本來(lái)源獲得可移植胚胎比例均高于理論值，及不同性別相互平衡易位攜帶者均存在6%～30%未獲得可移植胚胎的可能[20]，也在PGT遺傳咨詢時(shí)充分考慮到并告知患者知情。本研究能夠?yàn)榕R床提供較為客觀精確的遺傳咨詢指導(dǎo)意見(jiàn)，但由于本研究的研究對(duì)象有限，仍需更大的樣本數(shù)進(jìn)行更精確的相關(guān)研究。