■李 陽 余璐璐 王海燕 嚴 峰 張廣民 蔡輝益

(1.天津博菲德科技有限公司，天津 301906；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

磷對畜禽的健康和生產(chǎn)性能具有非常重要的作用，由于單胃動物的消化道無法分泌植酸酶，因此，飼料中以植酸磷形式存在的無機磷將無法被有效利用，這樣既影響畜禽對磷的利用也造成磷資源的浪費[1]。在實際生產(chǎn)中，常規(guī)方法是過量添加無機磷來滿足畜禽對磷的需求。過量添加的無機磷會隨著糞便排出體外，對環(huán)境造成了嚴重的污染。

為了提高飼糧中植酸磷的利用率，植酸酶在飼料生產(chǎn)中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[2-3]，這是由于植物性飼料中的磷主要是植酸磷，它是由肌醇與磷酸根形成的肌醇1，2，3，4，5，6-磷酸。植酸酶又稱為肌醇六磷酸水解酶，是一種催化植酸及其鹽類水解為肌醇和磷酸鹽的一類酶，植酸酶廣泛存在于動植物組織和微生物（細菌、真菌和酵母）。目前分離出的植酸酶主要有兩種，3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和6-植酸酶（EC 3.1.3.26），前者最先水解的是肌醇3號碳原子位置的磷酸根，后者最先水解的是6號碳原子的磷酸根[4]。對于不同來源的植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用效果已有大量研究。3-植酸酶，水解植酸磷的最終產(chǎn)物為肌醇-1-磷酸[5]，該植酸酶具有較好的耐熱性（最適溫度55 ℃左右）及較寬的適應(yīng)pH（pH 2.0～6.0），是目前最具應(yīng)用前景的飼喂植酸酶之一。Simons等[6]的研究結(jié)果表明，日糧中該添加植酸酶可以顯著提高磷的利用率，最高可以提高60%左右；基于總磷和可利用磷的含量進行評估，1 000 U/kg 植酸酶使豆粕磷的利用率可提高到57%，使玉米-豆粕日糧磷的生物利用率只提高到了43%。

近年來，由于植酸酶的發(fā)酵水平日益成熟，植酸酶對飼料中植酸磷的酶解效率出現(xiàn)瓶頸，現(xiàn)有植酸酶研究水平較難滿足市場對于耐溫耐酸性能、酶解效率和畜禽生產(chǎn)的需求。試驗選用了一種新型耐溫植酸酶，該酶選自耐高溫真菌微生物，經(jīng)設(shè)計、篩選并通過植酸酶基因的整合表達與畢赤酵母液態(tài)高效發(fā)酵后獲得。本研究旨在探討其耐溫性能、耐酸性能、仿生消化酶解效率以及在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，為植酸酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新型植酸酶，選自耐高溫微生物，通過植酸酶基因的整合表達并由畢赤酵母高效發(fā)酵后獲得，來源于某試驗室。普通植酸酶，來源于國內(nèi)某飼用酶制劑廠家，本研究中所有酶活測定均參照GB/T 18634—2009。

1.2 新型植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)評價

1.2.1 耐酸性評估

精確稱取植酸酶樣品0.5 g 于容量瓶中，加入緩沖液搖勻；置于搖床振蕩30 min；振蕩結(jié)束后用緩沖液定容，取適量液體，4 000 r/min 離心5 min；然后取上清液，用不同pH的緩沖液進行適當倍數(shù)的稀釋，以相應(yīng)pH 的植酸鈉溶液為底物進行酶活力測定。以pH 為橫坐標，以相應(yīng)pH 條件下相對酶活力為縱坐標，做出pH-相對酶活力曲線圖。測得最高酶活力（即基準酶活力）時的pH即為測定植酸酶的最適pH。

不同pH條件下植酸酶相對酶活力的計算。以測定最高酶活力為基準（100%），計算其他pH條件下的相對酶活力（%）。

相對酶活力（%）=不同pH 條件下的酶活力/最高酶活力×100

1.2.2 最適溫度曲線

精確稱取植酸酶樣品于容量瓶中，加入緩沖液搖勻后于搖床振蕩30 min；4 000 r/min離心5 min；上清液稀釋至適當倍數(shù)，為待測液；取待測液，將酶活測定過程中水浴溫度分別設(shè)置為指定溫度（梯度設(shè)置分別為37、50、60、70、80、85、90、95 ℃），其他的操作與國標法相同。取稀釋倍數(shù)為10 倍的酶液1 mL 到試管中，將試管快速放入精確設(shè)定溫度的水浴中，精準計時，計時結(jié)束迅速取出，冷卻；將熱處理過的酶液適當稀釋并測定酶活力（X1）。以溫度為橫坐標，以相應(yīng)溫度條件下相對酶活力為縱坐標，做出溫度相對酶活力曲線圖。測得最高酶活力（X）時的溫度即為最適溫度。以測定最高酶活力為基準（100%），計算其他溫度條件下的相對酶活力（%）。

相對酶活力（%）=X1/X×100

1.2.3 制粒酶活留存率

用豆粕逐級稀釋植酸酶樣品，充分混合均勻后加入配合飼料，其中配合飼料按照常規(guī)配方配制。分別均勻采集制粒前，以及制粒后的樣品各5～10份，每份100 g左右，檢測制粒前酶活（X3）和制粒后酶活（X4）。

酶活力存留率（%）=X4/X3×100

1.3 植酸磷酶解效率評估

基于仿生消化系統(tǒng)的植酸酶的酶解效率評價，具體操作方法參照專利CN 107831124 A[17]。以玉米-豆粕型日糧（75%玉米+25%豆粕）為底物，試驗設(shè)置2個處理組。對照組不加植酸酶，試驗組添加高校植酸酶，添加量為1 000 U/kg底物。每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。

試驗日糧總磷含量采用國標GB/T 6437—2018法檢測。

1.4 動物試驗

選擇148 日齡（21 周齡）3 000 只健康、采食量正常、體重均勻的海蘭褐產(chǎn)蛋期蛋雞，分為5 個處理組（見表1），每組6個重復(fù)，每個重復(fù)100只雞，各組日糧見表1，試驗1 組在添加普通植酸酶的基礎(chǔ)上同時添加磷酸氫鈣，試驗2組添加普通植酸酶，試驗3、4、5組為試驗組，其中3組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加新型植酸酶同時不添加磷酸氫鈣，試驗4、5組添加新型植酸酶同時各添加2 kg/t磷酸氫鈣和4 kg/t磷酸氫鈣，便于評估該新型植酸酶對于替代飼料配方中磷酸氫鈣的效果。預(yù)試驗時間7周，正式試驗時間約20周。飼糧參照NRC（1994）雞的營養(yǎng)需要配制?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。試驗期間蛋雞自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。每天記錄每個處理組產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重及破蛋數(shù)，計算平均蛋重和產(chǎn)蛋率、破蛋率，每2周計算日采食量和料蛋比。

表1 試驗日糧

表2 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)記錄并經(jīng)Excel 軟件處理，然后SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，用one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，Duncan’s法進行各組間多重比較；結(jié)果以“平均值±標準差”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 耐酸性

以pH為橫坐標，以相應(yīng)pH條件下相對酶活力為縱坐標，做出pH-相對酶活力曲線圖。每個酶活力檢測值均為3 個平行檢測數(shù)值的平均值。試驗測得新型植酸酶最適pH 為pH 3.0，將新型植酸酶在pH 3.0的酶活作為基準酶活，檢測并計算新型植酸酶和普通植酸酶在各個pH 條件下的相對酶活，結(jié)果如圖1，可以看出新型植酸酶在pH 2～9 范圍內(nèi)相對酶活大于54.3%，pH 3～6范圍內(nèi)相對酶活大于94.6%，耐酸效果優(yōu)于普通植酸酶。

圖1 不同pH相對酶活力曲線

2.1.2 耐溫性

以溫度為橫坐標，以相應(yīng)溫度條件下相對酶活力為縱坐標，做出溫度相對酶活力曲線。試驗測得該新型植酸酶的最適溫度為85 ℃。將該新型植酸酶最適溫度時的酶活作為基準酶活，檢測并計算該新型植酸酶和普通植酸酶在各個溫度條件下的相對酶活，制作溫度相對酶活力曲線圖（圖2），可見，在溫度范圍60～95 ℃內(nèi)相對酶活>67.9%，在溫度范圍80～90 ℃內(nèi)相對酶活>87.1%，耐溫性明顯高于普通植酸酶。

圖2 溫度相對酶活力曲線

同時，該新型植酸酶的水浴耐溫性試驗結(jié)果表明，相對于普通植酸酶，該新型植酸酶水浴耐溫性在80 ℃3 min 條件下相對酶活由56.7%顯著提高至87.9%（P<0.05），在85 ℃3 min 條件下由12.5%顯著顯著提高至74.9%（P<0.05）（見圖3）。

圖3 新型植酸酶水浴耐溫評估結(jié)果

2.1.3 制粒酶活留存率

該新型植酸酶實際制粒耐溫性試驗結(jié)果表明，飼料調(diào)質(zhì)溫度85 ℃，調(diào)質(zhì)時間60 s，酶活存留率為78%。

2.2 新型植酸酶對玉米-豆粕型底物磷消化率的影響

運用單胃動物仿生消化系統(tǒng)得到磷消化率結(jié)果見表3。由表3 可見，與不加植酸酶的基礎(chǔ)日糧組相比，添加該新型效植酸酶對玉米豆粕型日糧中磷的酶解效率顯著（P=0.001）提高，酶解效率由32.9%提高至82.5%，提高了150.76%，效果明顯優(yōu)于普通植酸酶。

表3 新型植酸酶對玉米豆粕型日糧磷消化率的影響

2.3 該新型植酸酶對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

蛋雞的生產(chǎn)性能結(jié)果見表4。表4 可見，與普通植酸酶組（試驗2組）相比，在飼糧中添加磷酸氫鈣后（試驗1組）可顯著提高產(chǎn)蛋率、平均蛋重和日均采食量。而與試驗1 組相比，添加該新型植酸酶的3 個處理組（試驗3組，試驗4組，試驗5組）的產(chǎn)蛋率分別顯著提高了0.14%（P=0.001）、0.47%（P=0.05）、1.04%（P=0.012），試驗5組產(chǎn)蛋率最高，為92.27%；與1組相比，試驗5 組的平均蛋重顯著增加0.59%（P=0.008），平均蛋重較試驗1組增加0.37 g/枚；添加該新型植酸酶的試驗3 組、4 組和5 組的日均采食量顯著（P=0.005、0.01、0.003）高于試驗1組；同時，與試驗1組相比，添加了該新型植酸酶的3、4 組和5 組均對破蛋率無顯著影響。

表4 新型植酸酶對蛋雞的生產(chǎn)性能影響

3 討論

3.1 新型植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)

不同來源的植酸酶表現(xiàn)出的酶學(xué)性質(zhì)存在較大差異，目前市場上應(yīng)用的飼用植酸酶大多來源于微生物。對于微生物來源的植酸酶來說，其菌種的差異、發(fā)酵工藝及后處理技術(shù)均對植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生較大影響，進而表現(xiàn)出作用效果的差異。植酸酶應(yīng)用大多以粉末或者微顆粒的形式在飼料加工調(diào)質(zhì)和制粒之前添加，酶在高溫蒸汽的制粒過程中，活力容易大量損失。另外，胃腸道內(nèi)的消化酶以及胃腸道內(nèi)的pH，也是影響植酸酶作用效果的重要因素。因此，制備出耐溫和耐酸性能佳的植酸酶才具有廣闊的應(yīng)用前景。有研究報道，大部分植酸酶的最適溫度在50～60 ℃范圍內(nèi)，植酸酶對磷的消化率也只達到約65%[7]。研究最深入的黑曲霉Aspergillus niger NRRL 3135 菌株產(chǎn)生的PhyA 和PhyB 兩種植酸酶，PhyA 的2 個最適pH分別為2.5和5.0，PhyB的最適pH為2.5[8]，大腸桿菌植酸酶AppA的最適pH為2.5[9]。本研究中的耐酸耐溫試驗結(jié)果顯示，該新型植酸酶最適pH為3.0，pH 3～6范圍內(nèi)相對酶活大于94.6%，最適pH與Wodzinski[8]等研究結(jié)果接近，但其在廣域pH范圍內(nèi)仍保持較好活性，說明其耐酸性較好；最適溫度高達85 ℃，在溫度范圍80～90 ℃內(nèi)酶活存留率>87.1%，相比何邵平等[7]的報道，耐溫性大幅提高；水浴試驗結(jié)果也較好，80 ℃3 min，相對酶活為87.9%；85 ℃3 min，酶活存留率為74.9%；進一步的實際制粒試驗結(jié)果表明，飼料調(diào)質(zhì)溫度85 ℃，調(diào)質(zhì)時間60 s 時，相對酶活為78%，雖然已有研究報道[10]的一種植酸酶的制粒存留率為85.92%，好于本研究中的78%，但是其制粒條件為85 ℃30 s，制粒時間較短，可見，該新型植酸酶在耐溫性和耐酸性方面較普通植酸酶有顯著進步，較好的酶學(xué)性質(zhì)與其菌種來源、發(fā)酵工藝及后處理技術(shù)密不可分。

3.2 該新型植酸酶對飼料底物磷消化率的影響

日糧結(jié)構(gòu)配比不同，飼料中肌醇-6-磷酸水平也有差異，也就是植酸酶所作用的底物類型和含量均會不同，因此植酸酶的作用效果也會有波動。有報道指出，植酸酶添加量在500 U/kg 飼料以上時，酶添加量與磷消化率提高間為線性關(guān)系；大于1 000 U/kg飼料時，可能無繼續(xù)表現(xiàn)出改善效果，在飼料中添加再多的酶都很難使飼料中的磷消化率超過70%[11]。本研究以玉米豆粕為底物，添加該新型植酸酶1 000 U/kg底物時，磷的消化率由32.9%提高至82.5%，顯著（P=0.001）提高了150.76%，高于賀建華等[11]研究結(jié)果。本研究中該新型植酸酶分解底物植酸的效率更高，可以釋放出更多的無機磷，能夠更徹底降低日糧中磷酸氫鈣的用量，這可能是該酶選自耐高溫微生物并經(jīng)過分子育種改良后的結(jié)果。

3.3 該新型植酸酶對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

植酸酶的來源不同，會引起作用效果的差異。Zimmer-mann等[12]研究在豬日糧中添加不同來源的植酸酶發(fā)現(xiàn)，小麥和黑麥源植酸酶的作用效率只有黑曲霉源植酸酶的40%。雷喬波等[13]的研究也表明，在低磷蛋雞飼糧中添加相同來源的粉狀和顆粒狀兩種劑型的植酸酶對蛋雞產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)的影響無顯著差異，這可能由于飼料未經(jīng)過高溫制粒過程而造成植酸酶的活性損失較大，因此具有良好的酶學(xué)性質(zhì)才可保證在實際應(yīng)用獲得更好的效果。高峰等[14]將蛋雞飼料中有效磷水平減少為0.23%和0.19%后，再添加植酸酶，得到與對照組（0.4%）并無顯著差異的結(jié)果。朱金清[15]的研究顯示，添加植酸酶對肥育豬生長性能沒有不良影響，由于減少50%磷酸氫鈣的添加量，對于日增重、采食量和料肉比均無顯著影響，與本研究結(jié)論相似。本研究中新型植酸酶對蛋雞生產(chǎn)性能的影響結(jié)果表明，添加新型植酸酶顯著提高了蛋雞產(chǎn)蛋率，最高提高了1.04%（P=0.012），達到92.27%；與普通植酸酶相比，飼料中同時添加150 g/t新型植酸酶（10 000 U/g）和4 kg/t磷酸氫鈣，后者的平均蛋重顯著增加0.37g/枚，日均采食量顯著（P=0.005、0.01、0.003）提高，但對破蛋率無顯著影響，這與李連彬等[16]的結(jié)果相似。與目前常規(guī)配方中普通植酸酶在飼料中的應(yīng)用（試驗1組）相比，試驗3、4、5組在使用新型植酸酶的基礎(chǔ)上分別替代了全部、7 kg/t磷酸氫鈣和5 kg/t磷酸氫鈣，結(jié)果顯示添加新型植酸酶各組均達到了較好的作用效果，因此，該新型植酸酶在蛋雞飼料配方中的應(yīng)用，可根據(jù)實際生產(chǎn)需要替代或部分替代磷酸氫鈣用量。

4 結(jié)論

①本研究中的新型植酸酶具有較好耐溫耐酸性，而且具有對飼料中植酸磷具有較強的酶解效果，酶解效率達到82.5%。

②飼料中添加該新型植酸酶，可減少磷酸氫鈣用量，同時提高或維持蛋雞產(chǎn)蛋性能。