■臧 曉 劉 釗 趙天成 吳 旻 張愛武 尹 劍 孫智禹 鞠貴春*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118；2.長春市雙陽區(qū)畜牧總站，吉林長春 130600；3.吉林省養(yǎng)蜂科學研究所，吉林吉林市 132108）

近年來，我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，尤其是烏蘇里貉養(yǎng)殖業(yè)，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，病原微生物污染的概率和空間也大大提高。細菌性疾病已成為烏蘇里貉養(yǎng)殖中的主要死亡原因之一，為此養(yǎng)殖場通常使用抗生素來解決這一問題，但抗生素具有抗生素殘留、細菌耐藥性、環(huán)境污染等眾多負面影響。為了應對抗生素濫用所導致的一系列問題，需要一種新的飼料添加劑應用于烏蘇里貉養(yǎng)殖。甘露寡糖（Man?nan oligosaccharides）又稱甘露低聚糖，是酵母細胞壁中α-甘露糖蛋白濃縮形成的低聚糖[1]。自Firon[2]發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能與致病菌結(jié)合從而阻止致病菌在腸道內(nèi)的定植之后，人們對于甘露寡糖的關(guān)注度越來越高。國內(nèi)外學者大量研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖作為一種不易被消化的化合物，可通過胃腸道中的微生物代謝，調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的組成和活性，從而對機體腸道產(chǎn)生積極的生物學效應[3]。正是由于這種特性，甘露寡糖已然成為被廣泛認為是抗生素生長促進劑的天然替代品。

在家禽和仔豬的相關(guān)試驗中[4-5]，已證明甘露寡糖可提高機體的免疫水平。但在烏蘇里貉飼糧中添加甘露寡糖是否能增強其免疫能力，從而預防疾病的發(fā)生，目前還鮮有報道。為此進行了甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率、血清免疫指標及血清抗氧化指標的影響研究，以期為甘露寡糖在毛皮動物高質(zhì)量養(yǎng)殖中的應用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物選取日齡[（120±5）d]接近、體重接近的健康雄性烏蘇里貉24只。

1.1.2 添加劑甘露寡糖：甘露寡糖含量≥99.0%，購于西安百川生物科技有限公司。

1.1.3 試驗飼糧試驗采用的基礎(chǔ)飼糧是由漢虹牧業(yè)有限公司配制的干粉料，各飼料配比及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組與飼養(yǎng)管理

將烏蘇里貉隨機分為4 組，分別為對照組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組6個重復，每個重復1只動物。對照組：基礎(chǔ)飼糧；Ⅰ組：在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5 g/kg 甘露寡糖；Ⅱ組：在基礎(chǔ)飼糧中添加1 g/kg 甘露寡糖；Ⅲ組：在基礎(chǔ)飼糧中添加2 g/kg 甘露寡糖。共進行為期45 d的試驗。其中前5 d為預飼期，試驗期35 d，采樣期5 d，在最后1 d每組挑選3只進行屠宰。試驗期間每天07：00，18：00 各喂1 次，保證充足的飲水。每只貉單籠飼養(yǎng)，定時清潔籠子。

1.2.2 樣本采集與指標測定

1.2.2.1 樣本采集糞樣：在飼養(yǎng)試驗第41 d 時，采用全收糞法進行消化代謝試驗，為期5 d。在每天晨飼前收集糞便，并噴灑10%的硫酸溶液進行固氮處理。在第5 d，將每只貉所有的糞便混合均勻，稱取10%放于烘箱在65 ℃的條件下進行烘干，粉碎，過40 目篩保存使用。另取10%鮮糞置于-80 ℃保存待用。

血樣樣本：試驗結(jié)束后，每組隨機選取3 只烏蘇里貉處死，進行心臟采血，所采的血液靜置離心后，保存于-20 ℃待用

組織樣本：血液樣本采集結(jié)束后，待去皮完成，取出心臟、肝臟、胰腺、脾臟和腎臟，濾紙吸干血水，進行稱重。

1.2.2.2 指標測定

生長性能的測定：在試驗正式開始第1 d及試驗結(jié)束最后1 d，晨飼前空腹秤取烏蘇里貉的重量，第1 d為始重，最后1 d為末重，計算烏蘇里貉的平均日增重。

營養(yǎng)物質(zhì)消化率的測定：干物質(zhì)的測定采用高溫干燥法（GB/T 9695.15—2008）；粗灰分的測定采用茂福爐高溫灼燒法（GB/T 9695.18—2008）；粗脂肪的測定采用索氏抽提法（GB/T 9695.1—2008）；粗蛋白的測定采用凱氏半微量定氮法（GB/T 9695.11—2008）；鈣的測定采用灰分法；磷的測定采用釩鉬酸銨顯色法；營養(yǎng)物質(zhì)消化率計算公式如下：

某養(yǎng)分的表觀消化率(%)=[(某養(yǎng)分采食量-某養(yǎng)分排出量)/某養(yǎng)分采食量]×100

生化指標的測定：從-20 ℃冰箱中取出處理好的血清，放置4 ℃環(huán)境下解凍。生化指標的測定均通過南京建成生物工程研究所試劑盒分析檢測。其中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的測定采用雙抗體夾心法，過氧化氫酶（CAT）的測定采用高錳酸鉀法，總超氧化物歧化酶（T-SOD）的測定采用氮藍四唑光化還原法。

臟器指數(shù)的測定：將所取得的心臟、肝臟、脾臟和腎臟的重量記錄，計算各臟器指數(shù)：

臟器指數(shù)（%）=（器官重量/體重）×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)通過采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA，LSD），Duncan’s 多重比較檢驗，結(jié)果以“平均值±標準差”來表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉生長性能的影響（見表2）

表2 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉生長性能的影響

由表2可知，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組烏蘇里貉末重和平均日增重及采食量與對照組相比無顯著差異（P>0.05）。

2.2 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響（見表3）

表3 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響（%）

由表3可知，試驗Ⅰ組和Ⅱ組粗蛋白消化率顯著高于對照組（P<0.05）；其余各組間粗脂肪消化率、干物質(zhì)消化率和有機物質(zhì)消化率，差異均不顯著（P>0.05），但隨著飼糧中甘露寡糖水平的提高，干物質(zhì)消化率有升高的趨勢。

2.3 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉血清免疫指標的影響（見表4）

由表4可知，試驗Ⅰ組和Ⅱ組IgA、IgG含量顯著高于對照組（P<0.05），其余組間差異不顯著（P>0.05）；試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組IgM 含量均顯著高于對照組（P<0.05）。隨著甘露寡糖添加水平的提高，烏蘇里貉血清中免疫球蛋白含量整體呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢。

表4 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉血清免疫指標的影響

2.4 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉血清抗氧化指標的影響（見表5）

由表5 可知，試驗Ⅰ組過氧化氫酶活性顯著高于對照組（P<0.05），其余各組間差異不顯著（P>0.05）；試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組總超氧化物歧化酶活性均顯著高于對照組（P<0.05），其中隨著甘露寡糖添加水平的提高，整體總超氧化物歧化酶活性有隨之增高的趨勢。

表5 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉血清抗氧化指標的影響(U/mL)

2.5 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉臟器指數(shù)的影響（見表6）

由表6可知，試驗Ⅲ組胸腺指數(shù)顯著高于對照組（P<0.05），試驗Ⅰ組和Ⅱ組胸腺指數(shù)與對照組相比無顯著差異（P>0.05）；其余各組間胰腺指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)均無顯著差異（P>0.05）。

表6 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉臟器指數(shù)的影響(%)

3 討論

3.1 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉生長性能的影響

甘露寡糖作為一種常用做飼料添加劑的功能性寡糖[6]，大量研究表明其能夠促進動物生長[7]。武威等[8]研究表明，在肉仔雞早期飼糧中添加50 mg/kg 甘露寡糖能夠顯著提高肉仔雞采食量、體重以及飼料報酬。Hazrati 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露寡糖的鵪鶉，其體重（1～21 d）和采食量（22～42 d）均有顯著提高。然而，Terre 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在犢牛飼料中添加甘露寡糖雖然能夠增加犢牛的采食量，但是對其體重沒有產(chǎn)生顯著影響。同樣Cheng 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞生長階段的飼糧中添加甘露寡糖，肉雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率并未顯著提高。本試驗結(jié)果表明：在冬毛期烏蘇里貉飼糧中添加甘露寡糖，末重和日增重與對照組相比并未出現(xiàn)統(tǒng)計學上的差異，與Terre 等[10]、Cheng 等[11]研究結(jié)果基本一致，說明在本試驗條件下甘露寡糖并不能提高冬毛期烏蘇里貉的生長性能。甘露寡糖在冬毛期烏蘇里貉的實際中應用效果與武威等[8]、Hazrati 等[9]的研究結(jié)果并不完全一致，其原因可能如下：①烏蘇里貉在冬季進入不完全冬眠期，采食欲望下降[12]。②由于單糖的連接方式多種多樣，這從某種程度上決定了寡糖的結(jié)構(gòu)也錯綜復雜，因此來源不同的甘露寡糖，其結(jié)構(gòu)組成和作用效果也大不相同[13]。③不同動物對各種營養(yǎng)成分需求不同，因此試驗飼糧的營養(yǎng)組成比例也不同。甘露寡糖作為飼料添加劑，飼糧中營養(yǎng)成分很可能會與甘露寡糖發(fā)生相互作用[14]。

3.2 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

吳峰洋等[15]研究表明，在獺兔飼糧中添加甘露寡糖，能夠使干物質(zhì)和粗蛋白的消化利用率雙雙提高。張雪等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在大菱鲆幼魚的飼料中添加甘露寡糖后，其飼料系數(shù)、攝食率、粗蛋白、干物質(zhì)表觀消化率和總蛋白含量均有不同程度的提高。在毛皮動物相關(guān)試驗中，鞠貴春等[17]研究發(fā)現(xiàn)，以甘露寡糖添加量2.5～5.0 g/kg 的飼料進行飼喂，能夠顯著提高水貂的采食量，此外，營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和生長發(fā)育速度也有不同程度的提高。本試驗研究表明：在飼糧中添加0.5 g/kg 和1 g/kg 甘露寡糖可顯著提高冬毛期烏蘇里貉對粗蛋白的利用率，此外隨著甘露寡糖添加水平的提升，干物質(zhì)消化率有隨之增高的趨勢，本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。甘露寡糖能夠提高冬毛期烏蘇里貉粗蛋白消化率及有機物質(zhì)消化率的原因可能如下：①腸道是動物重要的消化器官，健康的腸道是營養(yǎng)物質(zhì)高效消化的前提，因此健康的腸道對于動物的生長發(fā)育至關(guān)重要[18]。甘露寡糖作為新型功能性飼料添加劑，可結(jié)合病原細菌1 型菌毛，阻斷病原細菌凝集素從而抑制病原細菌在腸道的定植，進而為有益細菌的生長提供有利的環(huán)境[19]。Oyofo 等[20]研究也證明，與對照組相比，2.5%甘露寡糖組可顯著減少鼠傷寒沙門氏菌在腸道的定植。此外，甘露寡糖可上調(diào)MUC基因的表達，分泌更多的黏蛋白，而黏蛋白可以阻止病原體對腸道上皮細胞的侵入，為腸道提供更強的抗病原體保護，起到第一道防線的作用[21]。②小腸的腸道結(jié)構(gòu)與消化能力密切相關(guān)，小腸的絨毛長度和隱窩深度的比值是評價小腸消化吸收能力的重要指標[22]。研究證明甘露寡糖可通過增加小腸絨毛長度和表面積，降低隱窩深度，從而來改善消化率。孟巖等[23]研究證明，在肉雞飼料中添加0.3%的甘露寡糖，與對照組相比可顯著增加回腸中絨毛長度。本試驗中，粗脂肪消化率隨甘露寡糖水平的提高呈下降趨勢。甘露寡糖對粗脂肪消化率抑制的機制可能是甘露寡糖通過調(diào)節(jié)脂肪相關(guān)基因如PPARγ、Srebp1c 的表達，降低血清脂質(zhì)水平和肝臟脂質(zhì)的聚集，增加了脂肪的排出量[24]。此外甘露寡糖還可能影響烏蘇里貉脂肪酶的活性，但兩者之間的作用機制仍需進一步研究。

3.3 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉免疫指標的影響

免疫球蛋白不僅僅是體液免疫的重要組成成分，也是機體抗感染免疫的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，免疫球蛋白含量的高低可直接反映機體免疫功能的強弱[25]。lgA 是存在機體內(nèi)的一種傳統(tǒng)的非炎性抗體，它是機體黏膜防御系統(tǒng)的主要成分。能夠抵抗病原微生物的入侵，抑制病毒繁殖，起到免疫屏障的作用。IgM 不僅是原發(fā)性免疫應答的重要產(chǎn)物，也是感染免疫應答過程中出現(xiàn)的第一個抗體亞型。IgG是動物體內(nèi)最主要的抗體，占血清中總免疫球蛋白的75%，具有抗病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)的功能[26]。在肉雞試驗中，高林[27]發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加甘露寡糖可以顯著提高IgA、IgM 水平。同樣在豬試驗中，Czech 等[28]發(fā)現(xiàn)，在母豬日糧中添加400 mg/kg 的甘露寡糖，與對照組相比可顯著提高其初乳及其后代仔豬血清中IgG 含量。免疫球蛋白主要是由淋巴細胞分泌，根據(jù)已有研究結(jié)果表明，甘露寡糖可與免疫細胞的相關(guān)受體結(jié)合，這一過程使得免疫防御機制被激活，從而刺激細胞因子的產(chǎn)生，提高抗原遞呈細胞的遞呈能力，進而使得機體的非特異性免疫得到增強。其中甘露結(jié)合蛋白作為非特異免疫的重要組成成分，甘露寡糖成功刺激肝臟之后，便可產(chǎn)生甘露結(jié)合蛋白，而作為鈣依賴性凝結(jié)素的甘露結(jié)合蛋白，能夠激活補體級聯(lián)酶促反應，這一過程使得機體產(chǎn)生免疫應答[29]。另外Toll 樣受體能夠識別并結(jié)合甘露寡糖，這一過程成功之后，便可形成配體-受體復合物，調(diào)節(jié)免疫細胞內(nèi)與受體相關(guān)聯(lián)的信號蛋白分子的產(chǎn)生和信號通路的激活，以誘導細胞因子產(chǎn)生這一方式，使得機體的免疫應答反應啟動[30]。本試驗結(jié)果表明：在冬毛期烏蘇里貉的飼糧中添加不同水平的甘露寡糖都在不同程度上提高了IgA、IgG、IgM 含量，其中0.5 g/kg 和1 g/kg甘露寡糖組IgA、IgM 均顯著高于對照組，與上述結(jié)果基本一致，說明在飼糧中添加甘露寡糖能夠有效增強冬毛期烏蘇里貉血清中免疫球蛋白活性從而提高其免疫力。

3.4 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉抗氧化指標的影響

動物在代謝過程中以及應激環(huán)境下均會產(chǎn)生活性氧和自由基，它們的累積會引起生物體內(nèi)細胞構(gòu)造和功能的破壞[31]。T-SOD 和CAT 是普遍存在于生物體內(nèi)，在保護細胞免受氧化損傷過程中起到非常關(guān)鍵作用的抗氧化酶，它們活性的高低，可在一定程度上評價一個動物的抗氧化能力[32]。而甘露寡糖具有天然抗氧化作用，它能夠激活抗氧化酶系統(tǒng)，提高T-SOD 以及CAT 的活性，清除動物體內(nèi)過量的自由基和活性氧，保護動物免受氧化損傷[33]。Zheng 等[34]在試驗中發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能夠提高綿羊的抗氧化能力，尤其是在1.6%的劑量下，能顯著提高T-SOD 的活性。在肉雞相關(guān)試驗中，武威等[8]研究發(fā)現(xiàn)，25、50、75 mg/kg 的甘露寡糖組與對照組相比，甘露寡糖顯著提高肉雞血清中CAT 和T-SOD 活性，總抗氧化能力亦有提高趨勢。本試驗結(jié)果表明：甘露寡糖組CAT 活性均高于對照組，其中0.5 g/kg 甘露寡糖組顯著高于對照組，甘露寡糖組T-SOD 活性均顯著高于對照組，本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，說明在飼料中添加甘露寡糖能提高冬毛期烏蘇里貉抗氧化能力。

3.5 甘露寡糖對冬毛期烏蘇里貉臟器指數(shù)的影響

免疫器官是由免疫細胞構(gòu)成，其同樣也是淋巴細胞、單核巨噬細胞、粒細胞產(chǎn)生以及分化成熟的重要場所，這些細胞在免疫器官里，進行增殖及免疫應答，而胸腺作為動物機體免疫器官的重要組成，為T細胞分化成熟提供了必要的場所，其重量是免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。一旦動物陷入應激狀態(tài)，很可能會造成動物胸腺萎縮，從而導致其免疫功能受損[35]。黃俊文等[36]研究表明，在仔豬飼料中添加甘露寡糖，可以達到促進仔豬免疫器官生長發(fā)育的效果，與對照組相比，0.1%甘露寡糖組中胸腺和脾臟這兩組指數(shù)，分別對應增長了1.78%和17.1%。在小鼠相關(guān)試驗中，葛淑芝等[37]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，每天灌服80 g/L 甘露寡糖組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所提高。熊阿玲等[38]在試驗中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，0.9 g/kg甘露寡糖顯著提高了肉雞的法氏囊指數(shù)（21 d）和胸腺指數(shù)（42 d）。本試驗結(jié)果表明：在飼料中添加甘露寡糖均在不同程度上提高了冬毛期烏蘇里貉的胸腺、肝臟和腎臟指數(shù)，其中與對照組相比，2 g/kg 甘露寡糖組顯著提高了胸腺指數(shù)，與上述結(jié)果基本一致，進一步表明甘露寡糖確實可以提高冬毛期烏蘇里貉免疫功能。

4 結(jié)論

①在飼糧中添加0.5 g/kg和1 g/kg的甘露寡糖可以顯著提高冬毛期烏蘇里貉的免疫功能和抗氧化能力。

②在飼糧中添加甘露寡糖能夠在不同程度上提高冬毛期烏蘇里貉的營養(yǎng)物質(zhì)消化率和臟器指數(shù)。