李琬騰 劉 杰 李典鵬 呂 喆 萬(wàn) 云 冷 欣,3* 安樹(shù)青,3

（1 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230000；3 南京大學(xué)常熟生態(tài)研究院，江蘇 蘇州 215501）

生態(tài)恢復(fù)和生態(tài)重建是中國(guó)濕地恢復(fù)的主要策略，人工干預(yù)可促進(jìn)濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)恢復(fù)(安樹(shù)青等, 2019)。沉水植物作為水生態(tài)系統(tǒng)的重要生產(chǎn)者，在修復(fù)水體污染中因具有去除水體中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Kufel et al, 2002; Clarke et al, 2001)、去除沉積物中污染物(Dai et al, 2014)、促進(jìn)水體氮磷循環(huán)(Li et al, 2008)、加速生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)(朱江等, 2020)等作用而被廣泛使用。輪葉黑藻(Hydrilla verticillate)屬水鱉科黑藻屬，為多年生沉水植物，普遍生長(zhǎng)于世界各處水域中，具有極強(qiáng)的耐污性(林連升等, 2005; Srivastava et al, 2016)，同時(shí)自身的凈化能力又使其成為水生植物恢復(fù)過(guò)程中的先鋒物種(Wei et al, 2004)。輪葉黑藻通過(guò)種子或營(yíng)養(yǎng)繁殖體進(jìn)行自我繁殖，且以斷枝進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖較為普遍，但該繁殖方式存在占用空間資源大、成苗周期長(zhǎng)及種苗價(jià)格高等問(wèn)題(羅錢(qián)等, 2021)，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以對(duì)輪葉黑藻母本進(jìn)行快速擴(kuò)繁(Shasmita et al, 2018；孫敏杰等, 2012)，以解決我國(guó)輪葉黑藻野生苗來(lái)源不足的關(guān)鍵問(wèn)題。

目前對(duì)輪葉黑藻組培苗的培養(yǎng)液成分、移栽基質(zhì)及種植密度進(jìn)行了大量的研究，形成了較為成熟的培養(yǎng)及種植體系(蔣金輝, 2007)。煉苗是使植株迅速適應(yīng)環(huán)境，在定植前采取放風(fēng)、降溫、適當(dāng)控水等措施對(duì)幼苗強(qiáng)行鍛煉的過(guò)程。煉苗技術(shù)對(duì)于輪葉黑藻的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，組培苗經(jīng)過(guò)室內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的閉瓶生長(zhǎng)，未經(jīng)馴化直接移栽易出現(xiàn)品質(zhì)不佳、倒苗死亡等現(xiàn)象。開(kāi)蓋煉苗可以短期內(nèi)使組培苗重建自身的獲得性抗逆性(Conrath et al, 2009)，例如張有鐸(2010)和柳躍等(2014)通過(guò)此方法提高組培苗移栽存活率。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于輪葉黑藻組培苗在整個(gè)生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)生理指標(biāo)變化及煉苗對(duì)其環(huán)境適應(yīng)能力的影響研究較少。

通過(guò)探究輪葉黑藻組培苗的生長(zhǎng)規(guī)律和環(huán)境適應(yīng)能力，以期提高輪葉黑藻組培苗出苗品質(zhì)及其快速適應(yīng)新環(huán)境的能力，為輪葉黑藻組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及工程化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

輪葉黑藻在實(shí)驗(yàn)室中繼代培養(yǎng)1年，選取成熟健壯、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株，截取片段進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)按23.7:150:20:1的對(duì)應(yīng)比例將MS培養(yǎng)液與蔗糖、BA、IAA等物質(zhì)混合，配置組培苗基礎(chǔ)培養(yǎng)液，pH值為5.6～5.8。將培養(yǎng)液置于高壓滅菌鍋內(nèi)(121℃)滅菌30 min，再置于超凈工作臺(tái)中紫外殺菌30 min，待全部滅菌完成即可開(kāi)始接種。其中組培苗的接種規(guī)格為：長(zhǎng)2±0.2 cm、重0.2±0.01 g的成熟健壯輪葉黑藻片段。接種完成并封口后置于25℃恒溫組培室中進(jìn)行培養(yǎng)，在此期間密切觀察組培苗生長(zhǎng)情況以便及時(shí)剔除有菌苗。另一組組培架采取遮光處理以避免不同位置產(chǎn)生的光線干擾，固定光源與植物間距離為15 cm，燈與燈之間距離為10 cm。于培養(yǎng)后的第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d分別取樣，每次隨機(jī)取6瓶，3瓶用于測(cè)量干重、鮮重、莖長(zhǎng)、分枝數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)，3瓶用于測(cè)葉綠素(Chl)等生理指標(biāo)。

1.2.2 開(kāi)蓋煉苗試驗(yàn)基于預(yù)實(shí)驗(yàn)以及其他同類型實(shí)驗(yàn)的參考(陳彩霞等, 2004; 柳躍等, 2014)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置3種不同開(kāi)蓋煉苗時(shí)間(1 d、3 d、5 d)及3種不同光 周期(6 h/d、9 h/d、12 h/d)進(jìn) 行3×3正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。取閉瓶育苗完成且長(zhǎng)勢(shì)健壯的輪葉黑藻組培苗作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將組培苗置于組培架內(nèi)，對(duì)其進(jìn)行9種不同條件的開(kāi)蓋煉苗處理，處理完成后將苗置于育苗袋中進(jìn)行室外馴化培養(yǎng)，馴化用水取自實(shí)驗(yàn)當(dāng)?shù)毓珗@湖水。室外馴化培養(yǎng)14 d后每個(gè)條件隨機(jī)選取3株組培苗，用于測(cè)量可溶性糖、可溶性蛋白及葉綠素等生理指標(biāo)。

1.2.3 樣品指標(biāo)測(cè)定方法鮮/干重測(cè)定方法為將待測(cè)輪葉黑藻樣品所有根、莖、葉均收集起來(lái)，洗凈后迅速用濾紙擦干測(cè)量鮮重(FW)，在60°C恒溫烘箱中24 h后測(cè)定生物量干重(DW)。葉綠素含量測(cè)定采用丙酮乙醇混合液法(張憲政, 1986)；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法(王學(xué)奎, 2006)；可溶性總糖含量測(cè)定采用蒽酮法(李合生, 2006)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析、雙因素方差分析、person相關(guān)性分析，采用Origin進(jìn)行線性回歸擬合，Graphpad prism軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 組培苗生長(zhǎng)生理指標(biāo)分析

2.1.1 表型指標(biāo)輪葉黑藻組培苗各表觀形態(tài)指標(biāo)整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，并在培養(yǎng)25 d后，各指標(biāo)均隨著組培時(shí)間的增加而顯著增加(P＜0.05)，干鮮重以及莖長(zhǎng)等指標(biāo)在第45 d分別增加了81.41%、157.72%、8.02%，分 枝 數(shù) 在 第35 d顯 著 增 加66.67%(表1)。組培苗培養(yǎng)初期，因剛接種至瓶?jī)?nèi)新環(huán)境下，組培苗處于初期生長(zhǎng)遲緩階段，植物新陳代謝緩慢，故各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)未出現(xiàn)顯著上升。而后期隨著組培苗對(duì)環(huán)境的不斷適應(yīng)，光合作用不斷增強(qiáng)，逐步進(jìn)入高速生長(zhǎng)階段，這與謝翔(2020)對(duì)草莓組培苗的研究結(jié)果相同。此外，輪葉黑藻組培苗各生長(zhǎng)指標(biāo)之間出現(xiàn)了異速增長(zhǎng)，其中分枝數(shù)最先發(fā)生顯著性變化，表明輪葉黑藻組培苗優(yōu)先實(shí)現(xiàn)分支數(shù)的顯著增加而后再加速莖長(zhǎng)、干鮮重等生長(zhǎng)。

表1 輪葉黑藻組培苗表型指標(biāo)變化Table 1 Changes of apparent type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.1.2 生理型指標(biāo)輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb在組培育苗前35 d內(nèi)始終處于下降趨勢(shì)，自第25 d起Chla顯著下降49.71%，Chlb顯著下降40.65%(P＜0.05)(表2)?？赡苡捎诮M培苗處于緩苗期，這與陳磊(2019)對(duì)白芨苗組培研究的結(jié)果一致；也可能由于組培室內(nèi)光照過(guò)強(qiáng)，輪葉黑藻通過(guò)減少自身Chla、Chlb含量來(lái)減少單位面積Chl酶活性從而避免光氧化(Shigenaga et al, 1994; Salin et al, 1991; Pascal et al, 2005)。緩苗期后輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb含量仍未上升，可能與瓶?jī)?nèi)沒(méi)有足夠的氮源供組培苗進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化有關(guān)(蘇敏, 2020)，而Chlb下降的原因可能是在植物體內(nèi)Chlb往 往 由Chla轉(zhuǎn) 化 形 成(Rüdiger, 2002)。盡管實(shí)驗(yàn)過(guò)程中輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb始終未呈上升趨勢(shì)，但其Chla/b在第45 d有顯著提升，Chla/b是評(píng)價(jià)植物葉綠素濃度吸光度值的可靠性標(biāo)準(zhǔn)，也是反映植物光合作用能力的關(guān)鍵性指標(biāo)(Lee, 2019)，該指標(biāo)的提高說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中組培苗的光合作用隨時(shí)間增加有所增強(qiáng)。

2.1.3 生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)分析為探究輪葉黑藻組培苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中內(nèi)部生理生態(tài)變化與其表型變化之間的相關(guān)關(guān)系，為生長(zhǎng)曲線擬合提供依據(jù)，對(duì)輪葉黑藻組培苗干鮮重、莖長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)與Chl等生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)。其中輪葉黑藻組培苗各生長(zhǎng)指標(biāo)與Chla、Chlb等生理指標(biāo)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，表明植物在生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期不同生物指標(biāo)之間存在一定差異性(許智宏等, 1998)，由表1、表2可知，輪葉黑藻各項(xiàng)生理性微觀指標(biāo)優(yōu)先于其表型等宏觀指標(biāo)表現(xiàn)出顯著性差異。此外，不同于Chla、Chlb等生理指標(biāo)，輪葉黑藻組培苗的Chla/b指標(biāo)與其生長(zhǎng)指標(biāo)之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，其中鮮重與Chla/b的相關(guān)系數(shù)最高，達(dá)0.747，說(shuō)明只有較高的Chla/b值，植物才能較好地進(jìn)行光合作用及生長(zhǎng)發(fā)育(金相燦等, 2008)。

表2 輪葉黑藻組培苗生理型指標(biāo)變化Table 2 Changes of physiological type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.2 組培苗生長(zhǎng)曲線擬合

由于輪葉黑藻組培苗干重含量較低(最小只有0.02 g)，容易因操作誤差而對(duì)其數(shù)據(jù)結(jié)果造成較大影響，且組培后期組培苗繁殖較快，分枝數(shù)、芽數(shù)與葉片數(shù)混雜難以分辨及測(cè)量，所以本研究以時(shí)間為自變量，鮮重為因變量，對(duì)組培苗的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，能較大程度減少誤差。由表3的指標(biāo)相關(guān)性分析可知，鮮重與其他表型指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，以鮮重變化來(lái)替代其它類型指標(biāo)的變化也具有一定的科學(xué)依據(jù)。

表3 輪葉黑藻組培苗各生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of growth indexes of tissue culture seedlings of H. verticillata

為模擬預(yù)測(cè)輪葉黑藻組培苗生長(zhǎng)發(fā)育狀況，本研究利用Logistic、Gompertz、Von Bertalanffy 3種模型對(duì)輪葉黑藻組培苗的生長(zhǎng)情況進(jìn)行模擬，擬合方程、擬合參數(shù)、R2以及拐點(diǎn)等值如表4所示。

表4 三種“S”型模擬表達(dá)式Table 4 Three "S" type simulation expressions

輪葉黑藻組培苗生長(zhǎng)發(fā)育的實(shí)際擬合曲線如圖1所示，圖中黑色實(shí)心圓點(diǎn)代表實(shí)際鮮重測(cè)量值，3種擬合曲線在第15 d的擬合值均低于實(shí)際測(cè)量值，且存在較大誤差率，隨著育苗時(shí)間的增加，代表組培苗鮮重實(shí)測(cè)值的黑點(diǎn)較為均勻的分布在擬合曲線周圍，尤其第25 d和第35 d，實(shí)測(cè)值幾乎與3種模型的擬合曲線重合，說(shuō)明模型在此階段可高度模擬植物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)規(guī)律。

圖1 輪葉黑藻組培苗生長(zhǎng)曲線擬合圖Fig.1 Growth curve fitting of H. verticillata tissue culture seedlings

為進(jìn)一步比較各階段不同模型擬合效果，表5將組培苗鮮重實(shí)測(cè)值與模擬數(shù)據(jù)之間進(jìn)行對(duì)比。第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d時(shí)，Logistic模 型 擬合誤差率分別為54.05%、0.59%、4.26%、0.91%、0.15%?？傮w來(lái)看，隨著時(shí)間的增加，擬合誤差率逐步降低，曲線的擬合效果越好。分析原因可能是前期組培苗為適應(yīng)新環(huán)境，擾亂了自身正常生長(zhǎng)秩序，而后期通過(guò)自我調(diào)節(jié)適應(yīng)新環(huán)境，恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)(Smithers et al, 2019)。

表5 實(shí)測(cè)值與模型數(shù)據(jù)比較Table 5 Comparison of measured value and model data

2.3 組培苗開(kāi)蓋煉苗生理指標(biāo)分析

光周期為6 h/d和12 h/d時(shí)，開(kāi)蓋時(shí)間不會(huì)引起組培苗可溶性蛋白含量的顯著變化(圖2a)。當(dāng)光周期為9 h/d時(shí)，輪葉黑藻組培苗的可溶性蛋白含量在開(kāi)蓋5 d時(shí)顯著上升了20.49%(P＜0.05)，同時(shí)其含量在該背景下達(dá)到了最大值1.73 mg/L。開(kāi)蓋時(shí)間一定、光周期不同時(shí)，輪葉黑藻組培苗在9 h/d的光周期背景下，其可溶性蛋白含量均顯著高于其他兩組，當(dāng)開(kāi)蓋時(shí)間為1 d、3 d、5 d時(shí)，相較于同一開(kāi)蓋時(shí)間下的6 h/d與12 h/d兩組，輪葉黑藻組培苗可溶性蛋白含量均值分別提高了34.07%、56.32%。說(shuō)明在9 h/d光周期的條件下，開(kāi)蓋馴化5 d可使輪葉黑藻組培苗獲得較高可溶性蛋白含量。當(dāng)光周期為12 h/d時(shí)，與9 h/d組相比，該組可溶性蛋白含量均顯著下降，說(shuō)明較長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)降低輪葉黑藻組培苗的可溶性糖含量，與張愛(ài)玲(2009)對(duì)小麥的研究結(jié)果一致。孫歲寒等(2007)發(fā)現(xiàn)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)影響藻細(xì)胞代謝抑制其生長(zhǎng)，安彥君等(2016)也發(fā)現(xiàn)在24 h連續(xù)光照條件下，葛仙米的物質(zhì)積累出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)損害植物生長(zhǎng)發(fā)育。

圖2 輪葉黑藻組培苗可溶性蛋白（a）/糖含量（b）Fig.2 Soluble protein of H. verticillata tissue culture seedling(a)/ Soluble sugar(b)

光周期為6 h/d和12 h/d時(shí)，隨著開(kāi)蓋時(shí)間的增加，輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量逐步降低但未形成顯著差異(圖2b)。在開(kāi)蓋時(shí)間相同、光周期不同的條件下，輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量均呈現(xiàn)6 h/d＞9 h/d＞12 h/d的趨勢(shì)，但差異不顯著。研究表明：可溶性糖等活性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)宿主植物滲透壓，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育(Ribaut et al, 2002)，植物可以通過(guò)調(diào)整葉片中可溶性糖含量來(lái)提高自身的抗逆性(蘇雅等, 2021; 李婧等, 2021)，故本實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)光周期(12 h/d)不利于輪葉黑藻組培苗環(huán)境適應(yīng)能力的獲取。

3 結(jié)論

(1)在輪葉黑藻組培苗生長(zhǎng)曲線擬合中，3種方程對(duì)其生長(zhǎng)的擬合均具有較好效果，可一定程度上模擬其動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)規(guī)律。46—48 d時(shí)間點(diǎn)附近是組培苗長(zhǎng)勢(shì)最旺盛的階段，此階段及時(shí)移栽可以獲得長(zhǎng)勢(shì)健壯的輪葉黑藻組培苗，從而避免過(guò)度培養(yǎng)帶來(lái)的出苗品質(zhì)不佳及經(jīng)濟(jì)損耗等問(wèn)題。

(2)在輪葉黑藻組培苗開(kāi)蓋煉苗過(guò)程中，煉苗條件對(duì)輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量影響不大，但對(duì)其可溶性蛋白影響較大，且在長(zhǎng)光周期(12 h/d)煉苗背景下會(huì)顯著降低組培苗可溶性蛋白含量，為保證組培苗煉苗效果，應(yīng)給予組培苗5 d開(kāi)蓋露苗處理及9 h/d光周期處理。