基于ITS和nLSU序列的木耳屬物種鑒定

牛宇 徐全飛 聶建軍 潘保華 馮婉君 蒙秋霞 趙悠悠

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，山西 太原 030006；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030031；3 山西省侯馬市出入境檢驗(yàn)檢疫局，山西 臨汾 043000）

木耳屬Auricularia的物種是食用歷史悠久的食藥用菌，早在1 400多年前我國人民就開始人工栽培食用木耳[1]。據(jù)《神農(nóng)百草經(jīng)》記載，木耳“益氣不饑，輕身強(qiáng)志”。木耳屬主要栽培品種為黑木耳和毛木耳。根據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2018年我國黑木耳產(chǎn)量達(dá)674萬t，占全國食用菌總產(chǎn)量的17.54%，主要產(chǎn)區(qū)為東北三省、河北省、山西省、陜西省、云貴川三省[2]。我國木耳屬種質(zhì)資源豐富，《中國食用菌名錄》記載有13種，但我國具體有多少種木耳仍存在爭議。山西省為木耳主要產(chǎn)區(qū)，因此對其木耳屬栽培菌株和野生菌株進(jìn)行物種鑒定，有助于研究木耳種質(zhì)資源的多樣性，也為木耳屬種質(zhì)資源的收集、評價(jià)、利用提供分子數(shù)據(jù)支撐。此外，野外環(huán)境中如黑耳屬等部分銀耳科物種的擔(dān)子果外觀形態(tài)與木耳屬物種十分相似，但食毒不明，所以有必要借助形態(tài)學(xué)觀察和分子系統(tǒng)學(xué)方法加以區(qū)別。

近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，木耳屬物種的遺傳多樣性研究取得了長足的進(jìn)步。吳芳等[3-4]結(jié)合ITS+nLSU+rpb2序列鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，研究了黑木耳復(fù)合群和氈毛木耳復(fù)合群的系統(tǒng)發(fā)育和多樣性。張丹等[5]對5個人工栽培毛木耳菌株和2個野生分離的毛木耳菌株進(jìn)行了ITS序列分析。陶鵬飛等[6]利用ITS和SRAP標(biāo)記對黑龍江省境內(nèi)采集的14株野生黑木耳菌株和1個南方栽培菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。賈定洪等[7-8]對19個毛木耳栽培菌株和3個野生分離菌株進(jìn)行了ISSR分析和基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育研究。劉華晶等[9]借助ISSR和ITS分子標(biāo)記對黑龍江省內(nèi)部分野生黑木耳菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析。劉虹等[10]對來自山西省木耳屬9份人工栽培菌株和7份野生菌株進(jìn)行基于ITS片段鑒定，鑒定出3個木耳屬物種，即黑木耳A.heimuer、短毛木耳A.villosula和毛木耳A.cornea，但沒有匹配到文獻(xiàn)記錄山西省有分布的木耳A.auricula、多毛木耳A.polytricha和皺木耳A.delicata。由于木耳屬種類較多，且其子實(shí)體的形態(tài)、顏色、大小及子實(shí)層的形態(tài)常隨生長環(huán)境及著生部位的不同而變化，因此同物異名或同名異物的情況時有發(fā)生[11]。當(dāng)前人們應(yīng)用分子生物學(xué)和遺傳學(xué)新技術(shù)，通過對DNA等遺傳物質(zhì)的比較，可從分子層面鑒定木耳屬物種并探索其進(jìn)化關(guān)系。筆者基于ITS和nSLU序列，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對7份山西省木耳屬栽培菌株和4份野生菌株進(jìn)行鑒定，以期更好地對山西省木耳屬和部分形態(tài)近似的野生銀耳科物種進(jìn)行鑒別和分類，為進(jìn)一步開發(fā)利用該物種資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

供試菌株共11個，其中7個菌株為山西省常見木耳栽培品種，4個為野生菌株，于2018—2019年采集(表1）。供試菌株均用組織分離法獲得純培養(yǎng)物，擔(dān)子果標(biāo)本保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所食用菌實(shí)驗(yàn)室。

表1 供試菌株及來源

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，硫酸鎂0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，瓊脂2%，pH自然。

1.2 試劑與儀器

DP302基因組DNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶，10×Buffer和6×Loading Buffer(北京天根生化科技有限公司）；PCR引物(上海派森諾生物技術(shù)有限公司）；脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP）[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京）有限公司]；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(杭州Axygen生物技術(shù)有限公司）；Marker Plus(DL2000 Plus）(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）；核酸染料和RNaseA(北京索萊寶科技有限公司）。

Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司）；Applied Biosystems ABI-2720PCR儀，ABI 3730XL測序儀(上海愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）；Major Science Mini Pro 300 V Power Supply電泳儀(上海珩璟科技有限公司）；Labnet Sub System 70電泳槽(北京百奧創(chuàng)新科技有限公司）。

1.3 菌絲體的培養(yǎng)與收集

將各菌株純培養(yǎng)物接入PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 d后用滅菌的手術(shù)刀片在不同菌株的菌落表面刮取少許菌絲，置于2.0 mL的離心管中，編號備用。

1.4 DNA的提取

提取樣品DNA，并電泳，得到DNA電泳條帶。

1.5 PCR擴(kuò)增及測序

選用5條特異引物對11個菌株的DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增(表2）。50 μL反應(yīng)體系成分：20 ng/μL基因組DNA、10×Buffer(含2.5 mmolL Mg2+）、5 U/μL Taq DNA聚 合 酶、10 mmolL dNTP、10 μM引 物、ddH2O。ITS序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變 性30 s，58℃退 火45 s，72℃延 伸1 min30 s，共34個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。nLSU序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變 性30 s，50℃退 火1 min，72℃延 伸90 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。回收、純化后PCR產(chǎn)物送上海派森諾生物技術(shù)有限公司，在ABI 3730XL測序儀上進(jìn)行DNA測序。

表2 試驗(yàn)所用的基因片段及其對應(yīng)引物和引物序列

圖1 供試菌株子實(shí)體

1.6 ITS和nLSU序列分析

用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI核酸數(shù)據(jù)庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）中的數(shù)據(jù)比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息。

1.7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將供試標(biāo)本及來自GenBank登錄木耳屬、黑耳屬、銀耳屬的54個菌株ITS序列、ITS+nLSU序列用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對分析，并用MEGA5.0軟件中的鄰接分析(Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap檢驗(yàn)1 000次。

2 結(jié)果與分析

采用特異性ITS引物對供試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約650 bp的單一條帶(圖2、圖3）；采用特異性nLSU引物對供試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1 000 bp的單一條帶(圖4），條帶清晰明亮，無雜帶、拖尾現(xiàn)象，擴(kuò)增質(zhì)量較好。

圖2 供試菌株的ITS1-PCR凝膠電泳圖

圖3 供試菌株的ITS 5/4-PCR凝膠電泳圖

圖4 供試菌株的nLSU-PCR凝膠電泳圖

基于ITS+nLSU序列構(gòu)建了木耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹(分支上的數(shù)字為用Bootstrap分析獲得的支持值）。如圖5所示，11份菌株聚在5個不同的末端分支。11份菌株的形態(tài)特征見表3。

圖5 基于ITS和nLSU序列的菌株和相關(guān)種屬的木耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 供試11個菌株子實(shí)體形態(tài)特征

樣本1、2、3、4、5、6與黑木耳A.heimuer的可信樣本序列聚為一支，自舉值為98%，結(jié)合擔(dān)子果耳狀、子實(shí)體層被毛少等特征，以及BLAST結(jié)果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性均在99.28%～100.00%），可以確定這些樣本為黑木耳A.heimuer。

樣本7聚在毛木耳A.cornea分支中，自舉值為76%，結(jié)合其擔(dān)子果褐色或紅褐色、厚而堅(jiān)韌、不孕面被明顯長柔毛的形態(tài)特征，以及BLAST結(jié)果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性分別為99.82%、99.49%和99.93%），可以確定該樣本為毛木耳A.cornea。

樣本8也聚在毛木耳A.cornea分支中，自舉值為39%，結(jié)合其擔(dān)子果紅褐色并帶紫色、杯狀或耳狀、新鮮時膠質(zhì)不透明、質(zhì)地粗韌、平滑無皺褶、不孕面具致密長剛毛的形態(tài)特征，以及BLAST結(jié)果(nLSU序列相似性為99.63%），推測該樣本為多毛木耳A.polytricha。

樣本9聚在短毛木耳A.villosula分支中，自舉值為99%，結(jié)合其擔(dān)子果黃褐色、新鮮時膠質(zhì)、杯狀或盤狀、不孕面具明顯短柔毛的形態(tài)特征，以及BLAST結(jié)果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性分別為99.82%、98.81%和99.78%），可以確定該樣本為短毛木耳A.villosula。

樣本10聚在黑耳屬分支中，自舉值為100%，結(jié)合其擔(dān)子果墊狀、平展貼生、膠質(zhì)、淺褐色的形態(tài)特征，以及BLAST結(jié)果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性分別為97.96%、98.60%和99.78%），可以確定該樣本為銀耳科葡萄狀黑耳Exidia uvapassa。

樣本11聚在銀耳屬分支中，自舉值為100%，結(jié)合其擔(dān)子果葉狀、薄、叢生、膠質(zhì)、淡污桃色或淺荷花色、干后銹褐色的形態(tài)特征，以及BLAST結(jié)果(ITS1、ITS5/4序列相似性分別為99.82%和99.16%），可以確定該樣本為銀耳科薔薇色銀耳Tremella roseotincta。

3 小結(jié)與討論

基于ITS和nLSU序列分析，供試11份菌株中鑒定出4個木耳屬物種，即黑木耳、毛木耳、多毛木耳和短毛木耳。其中7個山西省常見人工栽培木耳菌株中，除菌株7為毛木耳A.cornea外，其余菌株均聚在亞洲本地種黑木耳A.heimuer[4]，可見山西省常見的木耳栽培種多數(shù)為黑木耳，這與前人[10]的研究結(jié)果相似。黑木耳是亞洲本地種，并被廣泛栽培[12]。毛木耳也是亞洲物種，并在中國廣為栽培[13]，但在供試木耳栽培種中僅占很小的比例。

自2013年以來，多毛木耳A.polytricha被認(rèn)為是黑色毛木耳A.nigricans的同物異名[14]，檢索真菌索引(Index Fungorum）和MycoBank數(shù)據(jù)庫得出，該種的現(xiàn)用名為黑色毛木耳A.nigricans。供試的多毛木耳A.polytricha樣本采自山西省沁源縣，為文獻(xiàn)記載的分布區(qū)域[15]。依據(jù)nLSU序列相似性結(jié)果(99.63%）推測供試野生菌株8為多毛木耳A.polytricha，然而其在進(jìn)化系統(tǒng)樹中并未與來自美國和哥斯達(dá)黎加的同物異名種A.nigricans的樣本系列聚為一支，而是被聚在毛木耳一支，但自舉值并不高(39%），且該物種與毛木耳可信樣本的ITS序列相似度僅為97.03%。根據(jù)Renske劃定的標(biāo)準(zhǔn)[16]，序列相似度≥99%時，可以判定為同一個種，序列相似度在95%～99%時，可以判定為同一個屬?？梢?，菌株8可能是一個與毛木耳A.cornea或黑色毛木耳A.nigricans不同的物種，其分類學(xué)地位有待于進(jìn)一步研究。

短毛木耳A.villosula分布于亞洲溫帶和亞熱帶，在中國廣泛分布，并被人工栽培[17]，俄羅斯也有分布[18]，采自山西省中陽縣的野生菌株(菌株9）與其相似，但在人工栽培菌株中未發(fā)現(xiàn)。劉虹等[10]在山西省境內(nèi)采集的2份短毛木耳菌株也均為野生。因此，山西省可能尚未人工栽培該物種。

2個銀耳科物種葡萄狀黑耳E.uvapassa、薔薇色銀耳T.roseotincta為山西省首次記錄種。其中，葡萄狀黑耳Exidia uvapassa為銀耳科黑耳屬真菌，已被發(fā)現(xiàn)分布于韓國東南部[19]、中部[20]及日本[21]；薔薇色銀耳Tremella roseotincta也屬于銀耳科銀耳屬，分布于中國、日本[22]、俄羅斯[23]，其形態(tài)與氈蓋銀耳Pha?eotremella fuscosuccinea(Tremella fuscosuccinea）非常相似，區(qū)別在于薔薇色銀耳生長于落葉樹上，目前其真菌宿主尚不清楚，生態(tài)偏好也需進(jìn)一步研究[24]。