高效液相色譜法測定奧沙普秦膠囊溶出度的研究

孫 熒，趙亞萍，李群林，宋麗娟

奧沙普秦(Oxaprozin)化學(xué)名為4, 5-二苯基惡唑-2-丙酸,別名苯惡丙酸和惡丙秦,是一種新的丙酸類非甾體抗炎藥(NSAID)，其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧化酶，抑制前列腺素的生物合成，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用[1]。臨床上主要適用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、肩周炎、頸肩腕癥侯群,也用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、外傷和手術(shù)后的鎮(zhèn)痛[2,3]。目前，奧沙普秦腸溶片及奧沙普秦腸溶膠囊已被《中國藥典》(2020年版二部)收錄，奧沙普秦片已被日本橙皮書和USP39版收錄，奧沙普秦膠囊未被新版藥典或其他國際權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)收錄，現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為2000年以前制定，該標(biāo)準(zhǔn)的溶出介質(zhì)為pH 7.9的磷酸鹽緩沖液，采用紫外分光光度法測定溶出度，專屬性差，測定結(jié)果容易超出藥典規(guī)定的范圍。本研究擬采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定奧沙普秦膠囊溶出度[4-9]，為制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 HPLC色譜儀；Mettler320 pH計(jì)；Mettler XP205分析天平；溶出儀SOTAXAT7。

1.2 試藥 奧沙普秦對照品(50 mg，中國藥品生物制品檢定所，批號100353- 201602；200 mg，USP對照品99.8%，批號LotNO.GOL342)，奧沙普秦膠囊(山東仁和堂有限公司，0.2 g)三批(批號：170901，180102，180103)，奧沙普秦原料(山東仁和堂有限公司，批號：160603)，羥甲淀粉鈉，羥丙甲纖維素，硬脂酸鎂。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Inertsil C8(250 mm×4.6 mm；5 μm)為固定相；0.1%磷酸(pH為2.0)-乙腈(55∶45)為流動相；流速1.0 ml/min；檢測波長286 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積20 μl。稀釋溶液為0.05 mol/l磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.4)。

2.2 檢測波長 取奧沙普秦對照品和奧沙普秦膠囊內(nèi)容物及輔料，分別用稀釋液溶解并稀釋，奧沙普秦最終濃度為12 μg/ml，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描。奧沙普秦對照品最大吸收波長為285.5 nm，奧沙普秦膠囊最大吸收波長為286.7 nm，輔料在該波長處無吸收，選擇286 nm波長為奧沙普秦測定波長。

2.3 HPLC方法學(xué)考察

2.3.1 供試品溶液 稱取奧沙普秦膠囊內(nèi)容物0.2050 g，加稀釋液溶解并稀釋，搖勻，0.45 μl濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，濃度為2 mg/ml。

2.3.2 對照品溶液 稱取奧沙普秦對照品0.2002 g至100 ml容量瓶中，加稀釋液適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適用性 取供試品溶液20 μl，按照預(yù)設(shè)色譜條件測定，記錄色譜圖(圖1)。奧沙普秦與相鄰雜質(zhì)分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)14 500，證明該方法系統(tǒng)適用性良好。

圖1 奧沙普秦測定系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

2.3.4 檢出限與定量限 取對照品溶液，加稀釋液分別稀釋至濃度為0.12 μg/ml、0.036 μg/ml(以奧沙普秦計(jì))，按照預(yù)設(shè)色譜條件進(jìn)行測定，測得奧沙普秦的定量限為2.4 ng，最小檢出量為0.72 ng。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)和溶液的穩(wěn)定性 取對照品溶液，加稀釋液稀釋至濃度為15.0 μg/ml(以奧沙普秦計(jì))，進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)為0.05%，重復(fù)性良好。取供試品溶液，加稀釋液稀釋濃度為12.0 μg/ml(以奧沙普秦計(jì))，于室溫放置0、1、4、8、12、24 h，進(jìn)行測定，RSD為0.5%，結(jié)果表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.6 線性及范圍 取對照品溶液，精密量取0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 ml分別稀釋至50 ml進(jìn)行測定，記錄色譜圖，在進(jìn)樣量4.004～280.28 μg/ml范圍內(nèi)，線性回歸方程 y=50594x，相關(guān)系數(shù)r2=1，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 回收率 按照企業(yè)處方配比制成空白輔料，分別稱取相當(dāng)于奧沙普秦80%、100%、120%的原料和輔料，按照預(yù)設(shè)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。在磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中平均回收率為99.17%，RSD為 0.15%(表1)。

表1 奧沙普秦HPLC法回收率 (n=9)

2.4 溶出方法的研究

2.4.1 溶出介質(zhì) 奧沙普秦的pKa值為4.23，為弱酸性藥物。采用不同pH的溶出介質(zhì)，更能反映藥品在不同體內(nèi)環(huán)境下的溶出釋放情況[10,11]。參照標(biāo)準(zhǔn)[12,13]，同時(shí)結(jié)合《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導(dǎo)原則》[14]，選擇pH 6.8磷酸鹽緩沖液、pH 7.4磷酸鹽緩沖液和脫氣純化水作為溶出介質(zhì)。隨機(jī)選取6粒奧沙普秦膠囊配制3組試液，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出體積1000 ml。取樣時(shí)間點(diǎn)為0、15、30、45、60、90、120、180 min，每次取樣10 ml，并及時(shí)補(bǔ)充等體積空白溶出介質(zhì)。0.45 μm濾膜過濾，HPLC外標(biāo)法測定，繪制溶出曲線(圖2)。

圖2 奧沙普秦膠囊在三種介質(zhì)中轉(zhuǎn)速為100 r/min溶出體積為1000 ml的溶出曲線圖A.pH 6.8的溶出介質(zhì);B.pH7.4的溶出介質(zhì);C.水為溶出介質(zhì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示溶出介質(zhì)為pH 6.8，平均溶出量未達(dá)到80%，溶出介質(zhì)pH 7.4的緩沖液在30 min溶出量大于80%；在純化水中的溶出量小于40%；選定pH7.4磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)。

2.4.2 溶出方法 參照日本橙皮書標(biāo)準(zhǔn)(槳法、50 r/min, 200 mg:45 min, 900 ml)、USP39標(biāo)準(zhǔn)(奧沙普秦片：槳法，75 r/min，45 min，1000 ml)、藥典標(biāo)準(zhǔn)(籃法、100 r/min，45 min，1000 ml)，選擇籃法100 r/min為實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)速，以pH 7.4的緩沖液作為溶出介質(zhì)，溶出體積1000 ml，溫度37 ℃，繪制溶出曲線(圖3)。結(jié)果顯示，提高轉(zhuǎn)速能有效提高溶出率，故選用籃法，100 r/min，45 min為奧沙普秦膠囊溶出方法。

圖3 奧沙普秦膠囊籃法兩種轉(zhuǎn)速的溶出曲線圖A.轉(zhuǎn)速75 r/min；B.100 r/min

2.4.3 溶出度測定結(jié)果 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，最終確定溶出介質(zhì)為0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.4)，籃法，轉(zhuǎn)速100 r/min，溶出體積1000 ml。測定三批樣品的溶出度(平行6份)，平均溶出量依次為95.0%、99.0%和96.9%(表2)。

表2 HPLC法奧沙普秦膠囊溶出度測定結(jié)果 (%)

3 討 論

HPLC法測定奧沙普秦膠囊溶出度具有較高的專屬性、精密度、靈敏度及準(zhǔn)確率及線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)規(guī)避了紫外分光光度法檢測的多步稀釋過程，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，具有較強(qiáng)的可行性。

參照國內(nèi)外藥典含量和有關(guān)物質(zhì)的選用液相條件，考察了pH 2.5的水系和pH 2.00的水系，比較了C8、C18色譜柱等，確定了最佳的液相條件，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)C8色譜柱、pH 2.00的水系是合理的。

取奧沙普秦對照品和膠囊及輔料，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描3D圖譜，結(jié)果顯示在286 nm波長處有最大吸收，而輔料在該波長處無吸收，因而選擇286 nm波長為奧沙普秦測定波長是合理的。

奧沙普秦膠囊現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)采用溶出度測定法第1法，以pH 7.9磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出時(shí)間30 min，限度為70%。USP39采用槳法，以pH7.4磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溶出時(shí)間45 min，限度為75%。USP39收錄的是奧沙普秦片，使用槳法75 r/min，本研究中膠囊劑，故仍然采用籃法，轉(zhuǎn)速100 r/min，溶出介質(zhì)修訂為pH 7.4磷酸鹽緩沖液，溶出時(shí)間修訂為45 min，限度修訂為75%。

根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導(dǎo)原則》，配制pH 6.8磷酸鹽緩沖液、pH 7.4磷酸鹽緩沖液和脫氣純化水作為溶出介質(zhì)，三種方法按照預(yù)設(shè)色譜條件測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算奧沙普秦在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積溶出量，繪制出溶出曲線，結(jié)果表明：溶出介質(zhì)pH 6.8磷酸鹽緩沖液優(yōu)于純化水，pH 7.4磷酸鹽緩沖液優(yōu)于pH 6.8，而最后選擇pH 7.4磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)。溶出介質(zhì)的pH能夠影響藥物的溶出，奧沙普秦為弱酸型藥物，在酸性條件下，藥物的解離受抑制，溶解度低。在pH 5.0～7.8范圍內(nèi)隨著pH的升高，奧沙普秦的解離度增加，溶解度也增加[15]。

圖3B溶出曲線表明，樣品在45 min時(shí)，制劑中的各組分均在90%以上，且兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的溶出量差在5%以內(nèi)，即為溶出平臺期，故選擇45 min為溶出測定的取樣時(shí)間，同時(shí)將取樣點(diǎn)溶出量(>90%)減去15%作為溶出限度。溶出限度通常不少于70%～85%[14]，確定奧沙普秦膠囊的溶出限度為標(biāo)示量的75%。藥物檢測的溶出介質(zhì)一般為500、900、1000 ml，參考國內(nèi)外藥典，奧沙普秦的處方量較大，故選擇1000 ml作為溶出介質(zhì)的體積。

綜上所述，HPLC法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，精密度高，測定結(jié)果不受輔料及制劑工藝影響，HPLC法可以在溶出度儀取樣后直接進(jìn)行液相測定，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，可獲得更寬的線性范圍，減少實(shí)驗(yàn)誤差。該方法作為奧沙普秦膠囊溶出度的有效測定方法，可為奧沙普秦膠囊制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供重要參考。