邵傳龍 陳洪國 龔旭昇,

1（湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院 咸寧 437100）

2（湖北省香花植物工程技術(shù)中心 咸寧 437100）

沉水植物作為水體的主要初級生產(chǎn)者之一，在維持水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用［1］。沉水植物作為大型草本植物，能夠提供更多的空間生態(tài)位和改善水體溶氧環(huán)境，直接為水生動(dòng)物提供食物與棲息地，是水生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵群體。隨著對水生態(tài)修復(fù)的深入研究，水生植物的重要性愈發(fā)顯著，水生態(tài)修復(fù)的關(guān)鍵一步，就是看沉水植能否被恢復(fù)重建?？嗖荩W(xué)名：Vallisneria natans(Lour.)Hara，又稱蓼萍草，水鱉科苦草屬植物，為多年生無莖沉水草本，常生長于溪流、池塘、河渠等地，在中國多個(gè)省份廣泛分布，且苦草還具有凈化水質(zhì)的作用，可吸收水體中的懸浮物質(zhì)和磷酸鹽，是水生態(tài)修復(fù)中的重要植物材料［2-3］。

輻射育種技術(shù)是利用射線誘導(dǎo)生物的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，再經(jīng)過人工定向選擇來培育出新的優(yōu)良品種的技術(shù)方法。利用X射線、γ射線和中子等誘導(dǎo)變異的方法在種子植物中受到了廣泛的應(yīng)用［4］。其中，γ射線具有節(jié)能、高變異率、穿透性強(qiáng)和易控制等特點(diǎn)，易于使植物在分子、細(xì)胞和個(gè)體水平上發(fā)生變異［5］。許多研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過輻照后的植株與自然生長植株的枝條長度和干重差異顯著［6］。葛維亞等［7］的研究結(jié)果表明，當(dāng)60Co γ射線的吸收劑量在30 Gy以上時(shí)能顯著降低地被菊種子的發(fā)芽率，并且提高幼苗丙二醛（MDA）的含量和過氧化物酶（POD）的活性。還有研究者發(fā)現(xiàn)，煙草種子在進(jìn)行輻照處理后，30 Gy以上的劑量處理可以顯著影響煙葉的光合色素含量，從而抑制煙葉的光合作用［8］。也有實(shí)驗(yàn)表明，在低劑量（30 Gy 或60 Gy）輻照處理時(shí)，毛竹葉片的葉綠素含量均較高，而在高劑量（120 Gy）輻照處理時(shí)葉綠素含量最低［9］。然而，這些研究主要集中在陸生植物上，對水生植物輻照育種的研究極其缺乏，僅看到利用離子束輻射對水雍菜進(jìn)行育種的研究［10］。

隨著苦草的應(yīng)用越來越廣泛，選育具有優(yōu)良性狀的苦草品種具有巨大的實(shí)踐價(jià)值。以前的研究者有利用栽培選擇優(yōu)良性狀的方法來選育苦草［11］，但是利用輻照選育苦草品種的方法尚未見報(bào)道。本研究通過不同劑量的60Co γ射線處理苦草種子，探討輻照對其種子萌發(fā)和植株生長的影響，以期為選育優(yōu)良的苦草品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

苦草種子取自湖北省荊州市長湖?？嗖莘N子經(jīng)人工除雜和自然風(fēng)干，再保存于陰涼干燥的環(huán)境中。

1.2 方法

1.2.160Co γ射線輻照

2021年3月，將分裝后的苦草種子在湖北省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所進(jìn)行輻照處理，在輻照前利用標(biāo)準(zhǔn)劑量體系對輻照位置的吸收劑量率進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)后該位置吸收劑量率為100 Gy/h，然后以替代法在同一位置輻照苦草種子，通過校準(zhǔn)得到的吸收劑量率確定輻照合適的時(shí)間，使苦草種子吸收到的劑量值分別為0 Gy、30 Gy、60 Gy和120 Gy，每組吸收劑量重復(fù)3次。

1.2.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

萌發(fā)實(shí)驗(yàn)在湖北科技學(xué)院室內(nèi)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。經(jīng)過輻照的種子首先用0.5%的高錳酸鉀溶液進(jìn)行消毒處理。種子萌發(fā)在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，將種子放入鋪上兩層濾紙的培養(yǎng)皿，加入10 mL蒸餾水，蓋上培養(yǎng)皿，用封口膜封好，在自然條件下進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。每隔2 d 補(bǔ)充一次蒸餾水，萌發(fā)時(shí)間為14 d。每個(gè)吸收劑量設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置50 ?？嗖莘N子。發(fā)芽率（%）計(jì)數(shù)見式（1）。

1.2.3 生長實(shí)驗(yàn)

生長實(shí)驗(yàn)在湖北科技學(xué)院溫室實(shí)驗(yàn)棚進(jìn)行。將經(jīng)過3 個(gè)不同吸收劑量的苦草種子各取3 g 播入底層有20 cm厚洗凈的黃沙的白色塑料桶中，水深設(shè)置為50 cm，每組吸收劑量設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。45 d后在每個(gè)桶中取10 株長勢良好的苦草植株進(jìn)行株高、葉片鮮重、葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量、MDA 含量、超氧化物歧化酶（SOD）、POD 和過氧化氫酶（CAT）活性的測定。株高用直尺測量，鮮重用千分之一電子天平測量，計(jì)算出平均值。

1.2.4 生理生化指標(biāo)的測定

葉片葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量采用乙醇溶液的方法測定；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定；SOD 活性采用氮藍(lán)四唑法；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法；CAT活性采用紫外吸收法測定［12］。不同劑量下每項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0和R 3.5.3進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。計(jì)算苦草種子發(fā)芽率的均值，和苦草幼苗株高、葉片鮮重、葉片葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量、葉片MDA含量、SOD、POD及CAT活性的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并且比較各處理間的差異顯著性（LSD法，p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 輻照對種子萌發(fā)的影響

反映輻照對種子造成損傷程度的重要指標(biāo)之一是發(fā)芽率。有研究表明，低劑量的60Co γ射線輻照會(huì)提高種子的發(fā)芽率，而高劑量的輻照會(huì)嚴(yán)重影響種子的萌發(fā)甚至致死［13-14］。由表1可知，不同吸收劑量處理間的苦草種子萌發(fā)情況存在較大差異。

表1 不同吸收劑量處理對種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different absorbed doses on V.natans germination

萌發(fā)初始，吸收劑量的增加對種子發(fā)芽率無顯著影響，隨著萌發(fā)過程的進(jìn)行，吸收劑量的增加對發(fā)芽率具有顯著性影響（p＜0.05）。30 Gy 輻照條件下的種子發(fā)芽率與對照組無顯著差異，第14 天60 Gy 和120 Gy 處理組的苦草種子發(fā)芽率要顯著低于對照組，這與常媚瑕等［15］對朝天椒種子的研究結(jié)果一致，說明一定的輻照處理可使種子細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到不同程度損害，影響到種子的初始萌動(dòng)過程的酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，阻礙了種子的萌發(fā)進(jìn)程。

2.2 輻照對苦草生長的影響

從表2 可以看出，0 Gy、30 Gy、60 Gy 和120 Gy 處理的幼苗株高平均值分別為12.25 cm、10.79 cm、10.22 cm 和7.09 cm。其中120 Gy 處理的苦草株高要顯著低于對照組（p＜0.05）。120 Gy吸收劑量的苦草長勢較差，葉片短小，植株明顯出現(xiàn)了矮化現(xiàn)象（圖1）。

圖1 不同吸收劑量對苦草生長的影響Fig.1 Effects of different absorbed doses on V.natans growth

表2 不同吸收劑量對苦草生長指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different absorbed doses on V.natans growth indexes

同樣，0 Gy、30 cm、60 cm 和120 Gy 輻射處理下苦草鮮重平均值分別為0.038 g、0.031 g、0.029 g和0.010 g。30 Gy和60 Gy處理下的苦草鮮重與對照組之間無顯著差異，而120 Gy 處理的苦草鮮重顯著低于對照組（p＜0.05）。有研究表明，植物種子經(jīng)過高劑量輻照后萌發(fā)生長的植株會(huì)出現(xiàn)明顯矮化現(xiàn)象［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過輻照處理的苦草株高和鮮重都隨著吸收劑量的增加而下降，這與常玉龍［17］對二球懸鈴木的研究結(jié)果一致。較高的吸收劑量對苦草的株高、鮮重的抑制作用較強(qiáng)，可能是種子受到高劑量輻照后其內(nèi)部組織受到損傷［18-19］，某些植物激素和酶的合成受到抑制，阻礙了細(xì)胞分裂、分化和代謝，從而影響了幼苗的生長。

2.3 輻照對苦草生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1 輻照對葉綠素含量的影響

葉綠素含量能夠影響植物的光合作用強(qiáng)度。鐘楚等［20］認(rèn)為，受到輻照時(shí)，光氧化作用加劇，葉片內(nèi)氧自由基含量上升，導(dǎo)致葉綠素含量出現(xiàn)下降趨勢。如表3 所示，0 Gy、30 Gy、60 Gy 和120 Gy 劑量輻照處理后的苦草葉片葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量之間均出現(xiàn)顯著差異，30 Gy組的葉綠素含量顯著高于對照組和其他處理組（p＜0.05）。隨著吸收劑量的增加，苦草葉片的葉綠素a、b 以及總?cè)~綠素含量均出現(xiàn)先升高后下降趨勢，這說明了較低的吸收劑量能提高苦草葉片的葉綠素含量，這與之前的研究結(jié)果［21-22］基本一致。推測其可能是由于苦草葉片能適應(yīng)低劑量輻照，少量氧自由基的出現(xiàn)促進(jìn)了葉綠素的合成或抑制了其分解過程。

表3 不同吸收劑量對苦草葉綠素含量的影響Table 3 Effects of different absorbed doses on chlorophyll content in V.natans

2.3.2 輻照對丙二醛含量的影響

由圖2 可知，4 個(gè)吸收劑量下的MDA 含量依次為0.004 nmol/g、0.004 nmol/g、0.007 nmol/g 和0.009 nmol/g，0 Gy、30 Gy和60 Gy劑量處理組之間的苦草葉片MDA含量無顯著差異。120 Gy輻射處理下的苦草葉片MDA 含量要顯著高于對照組（p＜0.05）。先前的研究表明，MDA 的含量反映了細(xì)胞膜脂質(zhì)損傷的程度，膜脂過氧化程度越高，MDA 含量越高，細(xì)胞中各種酶和膜系統(tǒng)受到的損傷就越嚴(yán)重［23］。隨著吸收劑量的增加，苦草葉片中MDA的含量呈現(xiàn)升高的趨勢，說明苦草葉片中的細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化，細(xì)胞膜功能發(fā)生紊亂，其在輻照下表現(xiàn)出明顯的生理損傷特征。

圖2 不同吸收劑量對苦草丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of different absorbed doses on the content of malondialdehyde in V.natans

2.3.3 對抗氧化酶活性的影響

當(dāng)植物受到輻照脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）自由基的含量會(huì)增加，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，功能紊亂，代謝異常，從而影響植物的正常生長。植物體內(nèi)的SOD、POD 以及CAT 等抗氧化酶類可以有效清除植物體內(nèi)的活性氧自由基，這些酶的活性能反映植物體的抗逆能力［24］。

從圖3 可知，0 Gy、30 Gy、60 Gy 和120 Gy劑量處理下的苦草葉片SOD活性分別為571.99 U/g、832.05 U/g、1 071.76 U/g和1 009.37 U/g，60 Gy和120 Gy 處理組的苦草葉片SOD 活性顯著高于對照組（p＜0.05）。SOD 活性的上升是苦草對輻射脅迫的自我保護(hù)現(xiàn)象［25］，因?yàn)镾OD 合成及降解途徑相關(guān)酶活性發(fā)生變化導(dǎo)致了SOD 的大量積累，免于活性氧對細(xì)胞DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的損傷。而苦草葉片POD活性在0 Gy、30 Gy、60 Gy和120 Gy處理中分別為7 465.87 U/g、5 334 U/g、4 842.47 U/g和4 471.85 U/g，方差分析結(jié)果顯示各劑量處理之間苦草葉片POD活性無顯著性差異（圖4）。

圖3 不同吸收劑量對苦草SOD活性的影響Fig.3 Effects of different absorbed doses on the activity of SOD in V.natans

圖4 不同吸收劑量對苦草POD活性的影響Fig.4 Effects of different absorbed doses on the activity of POD in V.natans

如圖5 所示，對照組的苦草葉片CAT 活性最高，為1 339.33 U/g，120 Gy 劑量處理下的活性最低，為32.46 U/g，30 Gy、60 Gy 和120 Gy 劑量處理的苦草葉片CAT 活性均顯著低于對照組（p＜0.05），但這3 個(gè)劑量處理組之間的苦草葉片CAT活性無顯著性差異。這是由于CAT 代謝系統(tǒng)對輻射較敏感，經(jīng)輻照后苦草葉片中活性氧自由基大量積累，CAT 失去了防御和修復(fù)的能力，酶活性逐步下降。

圖5 不同吸收劑量對苦草CAT活性的影響Fig.5 Effects of different absorbed doses on the activity of CAT in V.natans

綜上所述，苦草種子在經(jīng)過不同吸收劑量輻照處理后，其葉片SOD 與CAT 活性變化顯著，而POD 對輻照處理不太敏感，說明了苦草葉片中的主要保護(hù)酶為SOD 與CAT，它們的活性變化可以作為判定苦草對輻照敏感性和損傷變異的生理指標(biāo)。

3 結(jié)論

60Co γ 射線輻照對苦草種子萌發(fā)和生長影響較大。隨著吸收劑量的增加，苦草種子的發(fā)芽率、苦草的株高及鮮重均顯著下降。輻照后的苦草葉片葉綠素a、b 以及總?cè)~綠素含量出現(xiàn)先升高后下降趨勢。隨著吸收劑量的增加，CAT 活性顯著低于對照組，而葉片的SOD 活性顯著高于對照組，120 Gy劑量處理的苦草葉片MDA含量也要顯著高于對照組。因此，苦草可利用60Co γ射線進(jìn)行輻射誘變，為今后苦草的新品種選育提供一定參考。