頭部X 射線照射致認(rèn)知障礙過程中小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

張圓 林祎 吳瓊 劉政海 李彩 何潔

1（南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所腫瘤細(xì)胞和分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衡陽 421001）

2（南華大學(xué)應(yīng)用解剖與生殖研究所 衡陽 421001）

3（海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ?？?571199）

放射療法是治療原發(fā)性和繼發(fā)性腦腫瘤的有效方法之一［1］。然而，隨著顱腦腫瘤發(fā)病率及確診率的增加，各種放療技術(shù)和影像檢查手段的迅速發(fā)展與廣泛應(yīng)用，放射治療所致并發(fā)癥的發(fā)病率也呈上升趨勢［2］。頭部輻照后誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙是整個(gè)或部分腦部放療的常見并發(fā)癥，出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶、空間信息處理等海馬依賴性功能的缺陷，嚴(yán)重影響患者遠(yuǎn)期生活質(zhì)量［3］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷反應(yīng)的關(guān)鍵參與者之一的小膠質(zhì)細(xì)胞占腦實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的10%～15%，其影響大腦發(fā)育，維持神經(jīng)元生存環(huán)境，對(duì)損傷進(jìn)行應(yīng)答和修復(fù)［4-5］。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放出的炎性因子可介導(dǎo)神經(jīng)元損傷，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色［6］。小膠質(zhì)細(xì)胞通過經(jīng)典途徑被激活，經(jīng)歷M1極化并分泌大量活性氧和有害介質(zhì)，例如白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO），可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)并加速神經(jīng)元死亡。在神經(jīng)炎癥后期，通過替代激活途徑極化為M2 表型的小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌精氨酸酶-1（Arg-1）、白介素-10（IL-10）和其他抗炎癥因子，這將減弱由于過度炎癥反應(yīng)造成的突觸損傷，并促進(jìn)軸突的再生［7-8］。小膠質(zhì)細(xì)胞的功能與其形態(tài)變化密切相關(guān)，然而在頭部輻射所致認(rèn)知障礙過程中，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化往往被忽視。受周圍環(huán)境的影響，小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)多種表型。在穩(wěn)定狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞是由多個(gè)分支和突起組成的分叉細(xì)胞，能覆蓋很長的距離并監(jiān)測大腦的功能狀態(tài)；在壓力或病理狀況，小膠質(zhì)細(xì)胞從分叉狀變形為變形蟲形狀［9-10］。然而，以往對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后形態(tài)改變?nèi)鄙俣垦芯?。Sholl Analysis以細(xì)胞胞體為圓心，畫一系列同心圓，得到隨離胞體距離變化的突起交點(diǎn)（Intersections）個(gè)數(shù)，以此來反映細(xì)胞的復(fù)雜性，進(jìn)而定量分析小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化的分析方法［11］。因此，進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞在頭部電離輻射所致認(rèn)知障礙小鼠海馬內(nèi)的形態(tài)變化，有助于進(jìn)一步理解小膠質(zhì)細(xì)胞的功能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

離子鈣結(jié)合銜接分子1 （Ionized calcium binding adaptor molecule-1， IBA-1）單克隆抗體（Abcam， ab5076）； 生物素化兔抗羊抗體（CWBIO，CW0107）；兔血清（武漢博士德，AR0010）；ABC試劑盒（Vector，PK-4000）；DAB顯色試劑盒（中山金橋，ZLI-9019）；三羥甲基氨基甲烷（北京博奧拓達(dá)科技公司）；甘氨酸（北京博奧拓達(dá)科技公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司）；PCR 試劑盒（日本TAKARA 公司）；Triton X-100（美國Sigma 公司）。西門子ONCOR型直線加速器（德國SIEMENS公司）；BX-51型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 儀器公司）；YZ90000 型曠場裝置（上海永州實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；ABI7500 型熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）。

1.2 動(dòng)物分組與輻照條件

將購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司動(dòng)物（動(dòng)物合格證號(hào)：2019-0004）的8 周齡雄性ICR 小鼠（體重35～40 g） 隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和頭部輻照組（Irradiation，IR），每組9 只。采用6 mV 高能X 射線頭部局部輻照至吸收劑量10 Gy，構(gòu)建放射性認(rèn)知功能障礙模型，劑量率3 Gy/min。對(duì)照組在相同的輻照環(huán)境下，不輻照。

1.3 新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)

利用小鼠對(duì)新鮮的事物表現(xiàn)出更強(qiáng)的探索欲望及好奇心的原理，以檢測小鼠區(qū)分新舊事物的能力，從而反映小鼠認(rèn)知功能。輻照后56 d 進(jìn)行新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)，檢測小鼠認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練階段和測試階段。訓(xùn)練階段：放置兩個(gè)形狀、質(zhì)地相同的物體于曠場對(duì)稱位置處，小鼠由曠場正中放入，進(jìn)行5 min物體識(shí)別訓(xùn)練，然后取出小鼠，用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)裝置。測試階段：在訓(xùn)練結(jié)束1 h后，將曠場內(nèi)的其中一個(gè)物體更換為另一質(zhì)地、形狀顏色完全不同的新物體，但兩物體在曠場中的位置仍然保持不變，再次將小鼠由曠場正中放入，讓其自由探索5 min，并通過連接到自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)（上海欣軟信息技術(shù)有限公司SuperMaze）的攝像機(jī)記錄其5 min 內(nèi)對(duì)兩物體的總探索時(shí)間。按公式（1）計(jì)算新事物識(shí)別指數(shù)，該指標(biāo)越高代表小鼠記憶能力越好。

1.4 新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)

新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)被廣泛用于檢測小鼠海馬依賴性的空間記憶能力。輻照后56 d 進(jìn)行新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)分為訓(xùn)練階段和測試階段。訓(xùn)練階段：將兩個(gè)形狀、質(zhì)地完全相同的物體成對(duì)角線位置放置在曠場裝置中，將小鼠由曠場正中放入，讓小鼠自由探索，5 min 后取出小鼠，用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)裝置。測試階段：間隔1 h后更換曠場中一個(gè)物體位置，另一個(gè)物體位置保持不變。使用連接有自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)（上海欣軟信息技術(shù)有限公司SuperMaze）的攝像機(jī)記錄其5 min 內(nèi)對(duì)兩個(gè)位置上物體的總探索時(shí)間。按公式（2）計(jì)算新位置識(shí)別指數(shù)，該指標(biāo)越高代表小鼠記憶能力越好。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［12］。10%水合氯醛（10mg/kg）腹腔注射，依次采用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定，取腦置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h。經(jīng)15%和30%蔗糖溶液梯度脫水處理。進(jìn)行冠狀連續(xù)冷凍切片，片厚30 μm。磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗10 min×3 次，后續(xù)實(shí)驗(yàn)皆用此法進(jìn)行漂洗。3%H?O?浸泡28 min，漂洗；5%的兔血清室溫封閉2 h 后，加入羊抗IBA-1 多克隆抗體（1：1 000），室溫下孵育2 h 后于4 ℃過夜；次日復(fù)溫1 h，漂洗；生物素化兔抗山羊IgG二抗（1：1 000）室溫孵育2 h，漂洗；加入提前配好的三抗（AB 液，1：200，Vector 公司）中孵育2 h，漂洗；最后進(jìn)行DAB 染色，貼片，晾干，依次經(jīng)75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脫水、100%二甲苯脫脂及中性樹脂膠封片。光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)海馬DG區(qū)IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 RT-PCR

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［13］。使用10%水合氯醛（10 mg/kg）麻醉后，分離小鼠大腦，分離海馬并冷凍在-80°C。根據(jù)Trizol?試劑（CWBIO）說明書提取總RNA。RNA 純度通過A260nm/A280nm吸收比確定。使用RevertAidTM First Strand cDNA合成試劑盒（Fermentas）將1 μg總RNA進(jìn)行cDNA合成。并將cDNA 存儲(chǔ)在-20 ℃。采用TAKARA 試劑盒進(jìn)行操作，采用2-ΔΔCt法對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。GAPDH基因表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。使用兩步PCR方案，PCR循環(huán)條件如下：在95°C下30 s 進(jìn)行預(yù)變性，然后在95 °C 下10 s 和60 °C 下30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Target sequences of PCR

1.7 Sholl analysis分析

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［14］。使用奧林巴斯（Olympus）顯微鏡（奧林巴斯，日本）和zven2.6.blue 軟件拍攝40×（物鏡）照片。圖像以2 464×2 056 像素密度拍攝。然后在imageJ 中導(dǎo)入圖像并處理，自動(dòng)提取背景，然后隨機(jī)裁剪每個(gè)圖像，從每個(gè)圖像中提取一個(gè)具有代表性的300 dpi樣本，并將每個(gè)圖像轉(zhuǎn)換為8-bit，然后進(jìn)行細(xì)胞骨架化處理進(jìn)行Sholl分析，每只小鼠分析18～20個(gè)細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩組之間比較，采用t檢驗(yàn)，p＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頭部輻照對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響

2.1.1 新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測小鼠認(rèn)知功能

按流程圖1（a）所示，采用劑量率為3 Gy/min、能量為6 MV 的X 射線進(jìn)行單次10 Gy 頭部輻照，構(gòu)建頭部輻射所致認(rèn)知功能障礙模型，并在輻照后56 d 用新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)和新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)來檢測小鼠認(rèn)知功能。圖1（b）為新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)中小鼠活動(dòng)軌跡圖。如圖1（c）所示，與對(duì)照組（25.770±4.347）相比，頭部輻照組（3.447±3.801）小鼠新事物時(shí)間辨別指數(shù)明顯降低（p＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。頭部輻照組小鼠對(duì)新事物的辨別指數(shù)降低，表明頭部輻照小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。

圖1 頭部輻照對(duì)小鼠新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響：（a）實(shí)驗(yàn)流程圖；（b）小鼠活動(dòng)軌跡圖；（c）頭部輻照對(duì)小鼠新事物時(shí)間辨別指數(shù)影響；**p＜0.01，與對(duì)照組相比Fig.1 Effects of head irradiation on the novelty object recognition test in mice:(a)the experimental flowchart;(b)the movement trajectory diagram of mice;(c)the discrimination ratio in the Novelty object recognition test;**p ＜0.01 vs.control group

2.1.2 新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測小鼠認(rèn)知功能

輻照后56 d 進(jìn)行新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2 所示，與對(duì)照組（18.500±5.970）相比，頭部輻照組（-6.161±5.796）小鼠新位置時(shí)間辨別指數(shù)明顯降低（p＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。頭部輻照組小鼠對(duì)新位置的辨別指數(shù)降低，表明頭部輻照小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。

圖2 頭部輻照對(duì)小鼠新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響：（a）小鼠活動(dòng)軌跡圖；（b）頭部輻照對(duì)小鼠新位置時(shí)間辨別指數(shù)影響；*p＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.2 Effects of head irradiation on the Novelty Place Recognition test in mice:(a)the movement trajectory diagram of mice;(b)the discrimination ratio in the Novelty Place Recognition test;*p＜0.05 vs.control group

2.2 頭部輻照對(duì)小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1表達(dá)的影響

頭部輻照后小鼠海馬齒狀回區(qū)（DG區(qū)）IBA-1免疫組化結(jié)果如圖3 所示。相比于對(duì)照組（16.270±1.428），頭部輻照組（25.430±3.670）海馬IBA-1 標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（p＜0.05），說明頭部輻照增加了小鼠海DG 區(qū)IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)目。

圖3 頭部輻照對(duì)小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響：（a）小鼠海馬DG區(qū)IBA-1免疫組化染色結(jié)果，A和C為對(duì)照組，B和D為頭部輻照組；（b）海馬DG區(qū)IBA-1陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果；*p＜0.05，與對(duì)照組相比較Fig.3 Effects of head irradiation on IBA-1 positive cells in the DG of hippocampus:(a)the results of IBA-1 immunohistochemistry images,A and C are control group;B and D are 10 Gy-IR group;(b)the numbers of IBA-1 positive cells in the hippocampal DG of mice statistical analysis for each group;*p＜0.05 vs.control group

2.3 頭部輻照對(duì)小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖4（a）所示，根據(jù)隨機(jī)取樣原則，對(duì)各組小鼠海馬DG 區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行Sholl analysis 分析，定量分析小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變情況。兩因素方差分析顯示，如圖4（b）所示，與對(duì)照組（1～90 μm）相比，頭部輻照組（1～70 μm）小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞突起變短；且在70～80 μm，與對(duì)照組小鼠相比，頭部輻照組小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞突起與同心圓上的交叉點(diǎn)個(gè)數(shù)減少（p＜0.05），說明頭部輻照后小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜性降低。

圖4 頭部輻照對(duì)小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化的影響：（a）Sholl analysis分析小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)示意圖；（b）小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果；*p＜0.05，與對(duì)照組相比較Fig.4 Effects of head irradiation on morphological change of IBA-1 positive cells in the DG of hippocampus:(a)result of Sholl analysis of morphological cells in the DG of hippocampus morphology;(b)morphological analysis of microglia;*p＜0.05 vs.control group

2.4 頭部輻照對(duì)小鼠海馬M1/M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響

t檢驗(yàn)分析如圖5 所示，與對(duì)照組（1.000±0.087）相比，頭部輻照組（1.539±0.191）小鼠海馬M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD68 mRNA 的表達(dá)上調(diào)（p＜0.05）。與對(duì)照組（1.000±0.131）相比，頭部輻照組（0.427±0.049）小鼠海馬M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物ARG1 mRNA的表達(dá)下調(diào)（p＜0.001）。

圖5 頭部輻照對(duì)小鼠海馬M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響；*p＜0.05，***p＜0.001，與對(duì)照組相比較Fig.5 Effects of head irradiation on the mRNA expression of M1/M2 microglia markers in the hippocampus of mice;*p＜0.05,***p＜0.001 vs.control group

3 討論

頭部輻照所致認(rèn)知障礙是多數(shù)接受局部或全腦放療癌癥患者的一個(gè)不可忽視的晚期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著這些患者的遠(yuǎn)期生活質(zhì)量［15］，但其具體機(jī)制尚不明確。頭部輻照所致認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展與許多因素有關(guān)，除了與顱腦腫瘤等疾病本身進(jìn)展?fàn)顩r相關(guān)，同時(shí)也與放射治療的一些輻射參數(shù)（如吸收劑量大小、輻射能量、劑量率等）相關(guān)［16］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有研究發(fā)現(xiàn)，使用單次10 Gy 的X 射線頭部輻照后2 個(gè)月，用Morris 水迷宮檢測小鼠認(rèn)知功能，小鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知功能障礙［17］。因此，本研究采用劑量率為3 Gy/min、能量為6 MV 的X 射線進(jìn)行單次10 Gy 頭部輻照，構(gòu)建頭部輻射所致認(rèn)知功能障礙模型，并在輻照后56 d 用新舊事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)和新舊位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)來檢測小鼠認(rèn)知功能。結(jié)果顯示：頭部輻照組小鼠對(duì)新事物或新位置的辨別指數(shù)降低，頭部輻照所致認(rèn)知障礙模型建立成功。

作為對(duì)電離輻射敏感的靶細(xì)胞之一，小膠質(zhì)細(xì)胞在輻射所致認(rèn)知障礙的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中的重要意義不可忽視［18］。相關(guān)研究顯示，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）能通過負(fù)調(diào)節(jié)活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子的核因子（NF-κB）途徑和激活蛋白-1（AP-1）途徑來抑制輻射誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕輻射引起的認(rèn)知損害［19］。通過給予輻照后小鼠喂養(yǎng)含集落刺激因子-1 受體（CSF1R）抑制劑PLX5622 的食物，來減少照射后的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，能使小鼠認(rèn)知功能改善［20］。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測到頭部輻照小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［21］。眾所周知，小膠質(zhì)細(xì)胞的功能和形態(tài)變化是密不可分的，小膠質(zhì)細(xì)胞能快速響應(yīng)大腦生理或病理變化進(jìn)而發(fā)生相應(yīng)形態(tài)學(xué)改變［22］。在生理?xiàng)l件下，成熟的小膠質(zhì)細(xì)胞呈胞體小、分枝精細(xì)且長的形態(tài)，從而使它們能夠篩查腦實(shí)質(zhì)中是否有入侵的病原體或損害。病理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞從高度分支狀迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆蛹?xì)胞型，這使它們能迅速遷移至受損部位吞噬細(xì)胞碎片或細(xì)菌等。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化作為反應(yīng)大腦功能狀態(tài)正常與否的指標(biāo)，引起人們廣泛關(guān)注。2018 年，Young 等［23］發(fā)表了一篇用Sholl analysis分析小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的文章，表明小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)（如細(xì)胞分支數(shù)目、細(xì)胞分支長度、分支點(diǎn)數(shù)目等）可以被量化為連續(xù)變量，為小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的研究提供定量分析手段。Wadhwa 等［24］發(fā)現(xiàn)使用咖啡因和莫達(dá)非尼不僅能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，改善大鼠睡眠剝奪時(shí)的神經(jīng)炎癥和焦慮行為，同時(shí)用Sholl analysis分析小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)使用咖啡因/莫達(dá)非尼能改善由于睡眠剝奪所致大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞突起變短、分支數(shù)減少等形態(tài)變化。過往關(guān)于輻射所致認(rèn)知障礙的相關(guān)研究中人們主要關(guān)注小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元凋亡或神經(jīng)元死亡等功能變化，相對(duì)忽視腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化，且對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后形態(tài)改變?nèi)鄙俣垦芯?。本研究通過Sholl analysis 分析小鼠海馬DG 區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明，頭部輻照小鼠海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞突起變短；小膠質(zhì)細(xì)胞突起與同心圓的交叉點(diǎn)個(gè)數(shù)減少，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜性降低。

越來越多的研究證實(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞激活存在異質(zhì)性，可分為兩種相反的類型：促炎性M1 型和免疫抑制性M2 型。小膠質(zhì)細(xì)胞暴露于促炎細(xì)胞因子γ 干擾素（IFN-γ）、TNF-α和細(xì)菌或細(xì)胞碎片后會(huì)朝著促炎（M1）表型極化，表達(dá)高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮（iNOS）促進(jìn)一氧化氮（NO）產(chǎn)生，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)并加速神經(jīng)元死亡。小膠質(zhì)細(xì)胞通過替代途徑激活后朝著抑炎（M2）表型極化，該狀態(tài)誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子β（Tgfb）、Arg1的表達(dá)，在過敏反應(yīng)、寄生蟲清除、炎癥抑制、組織重塑、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用［25］。不同表型的小膠質(zhì)細(xì)胞起著損傷和保護(hù)的雙重作用。脊髓損傷相關(guān)研究表明，在脊髓損傷早期階段小膠質(zhì)細(xì)胞以M2 型為主，而在損傷的后期主要為M1 型，僅小部分是M2型。缺氧預(yù)處理?xiàng)l件下，間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的外泌體miR-216a-5p 可通過抑制Toll 樣受體4（TLR 4）的活性，使小膠質(zhì)細(xì)胞從M1 向M2 表型轉(zhuǎn)移，從而調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB/PI3K/AKT 信號(hào)級(jí)聯(lián)，促進(jìn)脊髓損傷后小鼠的功能恢復(fù)［26］。然而，在輻射所致認(rèn)知障礙過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2表型變化尚不明確，本研究通過RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，頭部輻照小鼠海馬小膠質(zhì)M1 型標(biāo)記物CD68 mRNA 表達(dá)上調(diào)，M2 型標(biāo)記物Arg1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，結(jié)合Sholl 分析結(jié)果提示，在輻射所致認(rèn)知障礙過程中，活化小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型（促炎表型）極化，我們推測頭部X 射線照射致認(rèn)知障礙可能與小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化及小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化相關(guān)。

4 結(jié)論

采用X 射線單次頭部輻照至吸收劑量10 Gy，建立頭部輻射所致認(rèn)知障礙模型，以模擬臨床顱內(nèi)腫瘤患者長期多次放射治療所致認(rèn)知障礙。與對(duì)照組相比，頭部輻照組小鼠新事物時(shí)間辨別指數(shù)和新位置時(shí)間辨別指數(shù)均明顯降低；海馬區(qū)IBA1 陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加；小膠質(zhì)細(xì)胞體變大，突起回縮，樹突分支數(shù)與同心圓交點(diǎn)數(shù)目減少，海馬M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD68表達(dá)上調(diào)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Arg1 表達(dá)下調(diào)。綜上，我們得出結(jié)論：頭部X 射線照射致認(rèn)知障礙可能與小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化及小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化相關(guān)。