杜氏肌營養(yǎng)不良小鼠肌損傷對肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機制

張紫玲，陸 茜，徐登球，俞沁瑋*，江振洲，2，3**

（1中國藥科大學新藥篩選中心，南京210009；2中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，南京210009；3中國藥科大學藥物質(zhì)量與安全預警教育部重點實驗室，南京210009）

骨骼肌與肝臟之間存在著密切的器官應答關系。骨骼肌功能障礙會影響體內(nèi)的脂質(zhì)平衡，患有骨骼肌疾?。ㄈ缍攀霞I養(yǎng)不良癥和肌肉減少癥）的患者患上代謝相關性脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）的風險也會相應增加［1-2］。研究表明，肌少癥是誘發(fā)MAFLD 的危險因素之一，其病理生理機制包括胰島素抵抗、血脂異常和炎癥增加［3］，肌少癥還可能是糖尿病易感性的早期預測指標［4］。同時，快速的骨骼肌萎縮預示肝硬化患者的生存率降低［5］。運動干預治療MAFLD 的結(jié)果表明，通過有氧運動和耐力運動促進肌再生能降低肝臟脂肪含量［6］，肝臟與脂肪組織、骨骼肌與微生物群之間的相互作用也可能是肌再生對MAFLD 的影響之一［7］。闡明骨骼肌與肝臟之間的關系，有利于從骨骼肌方向干預MAFLD的發(fā)病進程，或提示骨骼肌損傷患者關注肝臟病變，提早進行肝臟保護治療。

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchene muscular dystrophy，DMD），即假肥大型進行性肌營養(yǎng)不良癥，是一種X 連鎖隱性遺傳的嚴重進行性肌肉萎縮性疾病，會導致運動困難，最終發(fā)展為需要輔助通氣和過早死亡［8］。其發(fā)病原因是染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的部分基因重復、突變或缺失，造成抗肌萎縮蛋白在肌纖維上的缺失或功能異常［9］。臨床數(shù)據(jù)表明，DMD 嬰兒有肝功能生化異常的情況，在臨床兒科上出現(xiàn)了原因不明無黃疸的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）升高，甚至有曾被誤診為肝炎的案例［10］，并且小兒DMD 患者血脂異常的發(fā)生率很高［11］。然而，DMD 對肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機制尚未闡明。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/Jnju（mdx）小鼠是用于研究DMD 疾病的模型動物，該動物編碼抗肌萎縮蛋白的基因4號外顯子出現(xiàn)無義突變，導致抗肌萎縮蛋白無法表達。本實驗以mdx 小鼠為DMD 模型，探究其肝臟脂質(zhì)代謝變化情況。

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）在動物肝臟脂質(zhì)生成、沉積的過程中發(fā)揮了重要作用［12］。乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是催化脂肪酸合成代謝第一步反應的限速酶［13-14］，其中ACC1在肝臟、脂肪和泌乳乳腺中表達量較高［15］。FASN 能利用ACC1 生成的丙二酰輔酶A在胞質(zhì)中合成脂肪酸。同時，除脂質(zhì)合成的相關酶以外，肝臟脂質(zhì)合成的過程還受多種飲食和激素因素的調(diào)節(jié)，這些因素控制著脂肪合成相關酶的表達。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是一類固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白，其中SREBP-1c 作為負責胰島素增強脂質(zhì)生成的胰島素應答轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控脂質(zhì)合成中發(fā)揮著重要的作用［16］。然而，這些脂質(zhì)合成酶是否在DMD 誘發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝異常的的過程中起到了關鍵的調(diào)控作用，還有待進一步探究。

本課題基于DMD患者臨床上所出現(xiàn)的血脂異?，F(xiàn)象，以及骨骼肌疾病和MAFLD 之間緊密的聯(lián)系，探究DMD 對肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機制。研究結(jié)果可為臨床DMD患者檢測肝臟脂質(zhì)代謝情況提供理論依據(jù)，提示患者盡早進行肝臟保護治療，也為治療MALFD提供一個新的研究思路。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

Dystrophin 抗體（美國DSHB 公司）；羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二級抗體（Alexa Fluor 488）、DAPI 染色液、羊抗兔IgG（H+L）二級抗體（HRP）（美國Thermo Fisher 公司）；4% 多聚甲醛、抗熒光淬滅封片液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ALT、AST 檢測試劑盒（中國東軟威特曼生物科技有限公司）；總RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、高敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司）；FASN 抗體（美國Proteintech 公司）；SREBP-1c抗體、ACC 抗體（美國Affinity 公司）；p-ACC 抗體（美國CST 公司）；β-actin（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；油紅O 粉末（上海阿拉丁試劑有限公司）；蘇木精-伊紅染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

激光共聚焦顯微鏡、BX53 顯微鏡（日本Olympus 公司）；多功能酶標儀、高速低溫離心機、Nanodrop 2000/2000C（美國Thermo 公司）；AB StepOne-Plus Real-Time PCR Instrument（美國生命科技有限公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；低溫研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；冷凍切片機（德國Leica 公司）；Tanon 4600 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 動 物

雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju 鼠（以下簡稱mdx 小鼠）和雄性C57BL/6J 鼠（以下稱為對照組）6周齡，SPF 級，購于南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0003。動物飼養(yǎng)于中國藥科大學動物實驗中心屏障系統(tǒng)，正常飲食飲水，晝夜交替。動物實驗符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 動物分組與處理

對照組與mdx 小鼠各6 只，于7 周齡時處死，解剖取其肝臟組織和肌肉組織，取適宜大小進行冷凍包埋，另取一塊放入4% 多聚甲醛中浸泡固定，送往江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科制作石蠟包埋進行組織切片，剩余組織用錫紙包裹后置于液氮中，2 h后取出立即保存于-80 ℃冰箱。

2.2 肌肉組織免疫熒光染色

將冷凍包埋后的骨骼肌組織于冷凍切片機制片，切片厚度為8 μm，制備好的載玻片樣品于室溫干燥5 min 后，浸入預冷丙酮（4 ℃）中固定15 min，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次，晾干液體后于組織樣本上覆蓋含有5% 驢血清的封閉液室溫封閉30 min。棄去液體，加上抗肌萎縮蛋白抗體，4 ℃避光孵育過夜。吸棄抗體，PBS 浸洗3 次，每次5 min，滴加熒光二抗，室溫避光孵育1 h。吸棄二抗，PBS 浸洗3 次，滴加DAPI染色液，室溫避光孵育10 min，吸棄DAPI 染色液，PBS 浸洗3 次，組織樣本上滴加適量抗熒光淬滅封片液，蓋片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 肝臟組織生化檢測

稱取肝組織20 mg，放入磁珠，加入生理鹽水200 μL 勻漿，于高速低溫離心機2500 r/min 離心10 min，按照試劑盒說明書上操作，于多功能酶標儀檢測其吸收度，計算肝勻漿液中TC、TG 的含量。將上步勻漿液低溫11200 r/min 離心10 min，取上清液用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白含量，用以計算TC、TG的終濃度。

2.4 組織形態(tài)學檢查

2.4.1 油紅染色（oil red O staining，OR O 染色）油紅粉末溶于異丙醇中制備成0.5% 油紅母液，母液與水以3∶2混合制備油紅稀釋液，濾紙過濾后進行染色。油紅染完后使用蘇木素染色液對細胞核進行染色。最后滴加甘油明膠封片液，蓋上蓋玻片，于BX53顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.2 蘇木精-伊紅染色（HE染色） 肝臟（肌肉）組織切片使用4% 多聚甲醛溶液固定1 min，而后干燥15 min，用HE 染色液對組織切片進行染色，隨后用樹脂封片，待樹脂完全晾干后，于BX53 顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 血清生化檢測

小鼠眼球取血收集血清，室溫靜置4 h 后以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清液，保存于4 ℃冰箱。按試劑盒操作步驟檢測血清內(nèi)TC、TG、TBA、FFA、HDL，以及ALT 和AST 的含量，于多功能酶標儀檢測其吸收度，計算相應含量。

2.6 Real-Time PCR（RT-PCR）

采用總RNA 提取試劑提取肝臟RNA。采用Nanodrop 2000/2000C 分光光度法測定RNA 濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，使用SYBR Green 試劑在應用生物系統(tǒng)StepOnePlus?Real-Time PCR 上進行RT-PCR，檢測脂質(zhì)合成與代謝相關基因含量。引物序列如表1所示。

2.7 蛋白免疫印跡法

稱取肝臟組織50 mg，使用RIPA 裂解液提取蛋白原液，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白樣品的濃度，再加入上樣緩沖液將其配制成質(zhì)量濃度為5 μg/μL 的蛋白樣品，95 ℃金屬浴煮10 min，制備上樣樣品。樣品通過蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測脂質(zhì)合成和代謝相關酶的蛋白含量。一抗為FASN 抗體、SREBP-1c 抗體、ACC 抗體、p-ACC 抗體、β-Actin，二抗為羊抗兔IgG 抗體。完成一抗與二抗的特異性結(jié)合后，使用ECL 化學發(fā)光試劑盒在發(fā)光成像系統(tǒng)上檢測蛋白表達的信號強度。

Table 1 Sequences of real time PCR primers

2.8 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間分析全部使用t檢驗，當P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 mdx小鼠肌肉損傷

對mdx 小鼠的脛骨前?。╰ibialis anterior，TA）進行抗肌萎縮蛋白的免疫熒光染色（圖1-A）和HE染色（圖1-B），結(jié)果顯示mdx 小鼠TA 肌細胞內(nèi)抗肌萎縮蛋白缺失，肌細胞皺縮，有較多中性粒細胞浸潤。

Figure 1 Loss of dystrophin in tibialis anterior （TA）and muscle damage in mdx miceA: TA muscle was stained with dystrophin (green) and DAPI was used to stain the nuclei (blue) (Scale bar = 50 μm); B: HE staining of TA(Scale bar = 50 μm)DMD: Duchene muscular dystrophy

3.2 mdx小鼠肝臟脂質(zhì)含量增加

與對照組相比，mdx 小鼠的肝重系數(shù)上升（圖2-A），肝臟內(nèi)TC與TG含量均升高，其中TG大幅升高，是正常組含量的3 倍（圖2-B）。肝臟病理組織學染色檢查結(jié)果表明，mdx小鼠肝細胞胞漿中出現(xiàn)許多大小不一的空泡，邊界清晰，將細胞核擠向一側(cè)。肝細胞呈現(xiàn)腫脹的形態(tài)，無炎癥現(xiàn)象（圖2-C）。同時，mdx小鼠的肝臟油紅染色結(jié)果顯示其肝臟內(nèi)脂滴顯著增多（圖2-C）。

3.3 血清生化檢測

與對照組相比，7 周齡的mdx 小鼠血清中ALT、AST 大幅度升高，有顯著性統(tǒng)計學差異（P＜0.001）（圖3-E，3-F），而FFA、HDL、TBA、TC、TG 與對照組相比無明顯變化，其中TBA略微上升，TC稍有下降，但均無統(tǒng)計學差異（圖3）。血生化檢測結(jié)果顯示mdx 小鼠可能存在肝臟炎癥，血清中脂質(zhì)含量沒有明顯變化。

3.4 mdx小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成相關因子含量上調(diào)

Figure 2 Increased lipid content in liver of mdx miceA: Liver index (±s, n = 6); B: Concentrations of TC and TG in liver (xˉ± s, n=6); C: HE staining and oil red O (ORO) staining of liver (20 × )*P ＜0.05 vs control group

Figure 3 Concentrations of TC (A), TG (B), TBA (C), HDL (D), ALT (E), AST (F) and FFA (G) in serum in control and mdx mice (±s, n = 6)***P ＜0.001 vs control group

與對照組相比，mdx小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關基因表達量均升高，其中Fasn，Srebp1-c表達量顯著提高，Scd1基因表達顯著升高，Acc基因表達上調(diào)，以上4 個基因的表達對照組和模型組之間均有顯著性差異（P＜0.05）（圖4-A）。Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，mdx 小鼠肝臟內(nèi)FASN、SREBP-1c、ACC 和p-ACC 的蛋白表達量均顯著上調(diào)，而ACC 的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化（圖4-B）。結(jié)果提示mdx 小鼠肝臟脂質(zhì)含量增多是由于肝臟中脂質(zhì)合成的增加。

Figure 4 Increased expression of lipid synthesis related factors of liver in mdx mice (±s, n = 6)A: Gene expression of lipid synthesis related factors detected by qPCR; B: Protein expression of FASN, SREBP1-c, ACC and p-ACC/ACC in liver*P ＜0.05 ,**P ＜0.01, ***P ＜0.001 vs control group

4 討論

小鼠肝臟組織形態(tài)學結(jié)果顯示，mdx小鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，肝臟中TC 和TG 的含量均上升，提示肝臟中膽固醇運輸出現(xiàn)問題以及TG 發(fā)生累積。mdx 小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成以及氧化代謝相關酶中FASN，SREBP1-c 與ACC 的基因和蛋白表達量均顯著上調(diào)，提示肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)沉積可能是由于脂質(zhì)合成的增加，SREBP1-c 表達量上調(diào)也提示存在胰島素上調(diào)而增加脂肪的可能。

DMD 患者臨床數(shù)據(jù)表明，嬰兒期的DMD 患者肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性明顯升高，并有研究表明血清CK 與ALT、AST水平有顯著相關性。雖然mdx 小鼠血清中ALT、AST 含量顯著升高，但ALT和AST缺乏肝臟特異性，因此對具有潛在肌肉功能障礙的患者肝細胞損傷的診斷受到嚴格限制。最新研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸脫氫酶可作為肝損傷的肝臟特異性生物標志物，具有改善潛在基礎性肌肉損傷患者肝細胞損傷診斷的潛力［17］。

肌肉生長抑制素是轉(zhuǎn)化生長因子-β 超家族中高度保守的成員，是骨骼肌質(zhì)量的有效負調(diào)節(jié)因子。在成人組織中，肌肉生長抑制素主要在骨骼肌中表達，在脂肪組織和心臟中也有少量表達。研究發(fā)現(xiàn)，在mdx 小鼠中阻斷肌肉生長抑制素蛋白的表達能夠緩解mdx 小鼠肌肉萎縮的癥狀［18］。有臨床報道發(fā)現(xiàn)，在肝移植及肝纖維化患者中，血漿肌肉生長抑制素含量有明顯上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)提示肌肉生長抑制素是晚期肝病患者肌肉萎縮的關鍵因素。同時，血清中肌肉生長抑制素水平升高與肝硬化患者的生存率降低有關，提示肌肉生長抑制素在肝硬化發(fā)展進程中可能起到了重要的調(diào)節(jié)作用［19-21］。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，DMD 患者與mdx 鼠肌肉中的肌肉生長抑制素的蛋白表達增加，非諾貝特能抑制腓腸肌與膈肌中肌肉生長抑制素的蛋白表達。因此可考察肌肉生長抑制素是否與脂質(zhì)合成相關酶有關聯(lián)，初步探究骨骼肌和肝病之間相互影響的機制。

以上結(jié)果均提示了7 周齡的mdx 小鼠肝臟組織內(nèi)存在脂質(zhì)蓄積。mdx 小鼠展示了當抗肌萎縮蛋白的基因被完全敲除后其肝臟的變化，抗肌萎縮蛋白的基因缺失導致了體內(nèi)骨骼肌減少。同時，缺少運動或不健康飲食也會導致骨骼肌量的減少，骨骼肌量與肝臟脂肪面積呈負相關。脂肪合成相關酶FASN、SREBP1-c、ACC 和肌肉生長抑制素是兩者相關機制的可能靶點。

綜上所述，mdx 小鼠肝臟脂質(zhì)含量顯著增加，其發(fā)生機制與脂質(zhì)合成相關酶FASN、SREBP1-c、ACC的上調(diào)有關。