李 言， 孫雨杰， 聶陳志鵬， 王 茹， 應(yīng) 浩， 王 立,*

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院/食品科學(xué)與工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫 214122；2.上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院， 上海 200438；3.中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所/中國科學(xué)院營養(yǎng)代謝與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032)

現(xiàn)代社會(huì)，隨著人們生活條件的改善和醫(yī)療保障水平等的提高，老齡人口的比例不斷增加?！?019年世界人口展望》報(bào)告預(yù)測，全球65歲及以上人口的比例將從2019年的1/10增加到2050年的1/6[1]。由衰老引起的肌肉萎縮是人類最常見的肌肉萎縮類型，表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量、力量的流失，活動(dòng)能力的下降等[2]。目前，衰老性肌萎縮已成為嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量的重要問題之一，如何預(yù)防或延緩衰老性肌萎縮的發(fā)生已成為亟待解決的公共健康問題。

運(yùn)動(dòng)是公認(rèn)的改善肌肉質(zhì)量、肌肉力量和行走速度的最佳方式，可以有效預(yù)防或緩解老齡人群的骨骼肌增齡性萎縮，但對(duì)大多數(shù)老年人來說，保持持續(xù)且足夠的運(yùn)動(dòng)是很困難的[3]。飲食干預(yù)作為另一種幫助緩解老年人骨骼肌增齡性萎縮的干預(yù)措施被提出。研究表明，骨骼肌中過量活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致其蛋白降解，相關(guān)蛋白合成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致衰老性肌萎縮[4]。食物中的天然多酚類物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，可以有效減少骨骼肌中的氧化應(yīng)激，抑制NF-κB蛋白核因子(κB nuclear factor)或腺苷酸激活蛋白激酶 [adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]的上調(diào)和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O,FoxO)的激活，進(jìn)而抑制骨骼肌的降解[5]?？寡趸衔锏臄z入不足會(huì)導(dǎo)致骨骼肌抗氧化能力的降低以及骨骼肌力量的下降[6]。青稞是我國青藏高原地區(qū)最主要的農(nóng)作物之一，由于其特定的生長條件而富含酚類化合物、維生素、膳食纖維等生物活性成分[7]，具有獨(dú)特的抗氧化特性，具備緩解氧化應(yīng)激并抑制骨骼肌萎縮的潛力[8]，但有關(guān)青稞提取物對(duì)衰老骨骼肌的作用及其機(jī)理還未見報(bào)道。本研究將對(duì)青稞提取物在衰老骨骼肌中的作用進(jìn)行探討，并進(jìn)一步在分子水平分析其具體的作用機(jī)制，以期為青稞的功能性開發(fā)和改善衰老骨骼肌新策略的提出提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞(HordeumvulgareL. var. nudum Hook. f)，西藏農(nóng)業(yè)科學(xué)院；C57BL/6J小鼠，動(dòng)物倫理審查編號(hào)為JN N020210530c0201220[141]，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；無水乙醇、三氯甲烷、氯仿、異戊烷、多聚甲醛，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、總蛋白提取細(xì)胞組織裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA)、十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液、抗熒光淬滅封片液(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA抽提試劑，美國Invitrogen公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物序列合成，浙江尚亞生物技術(shù)有限公司；核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，日本Takara公司；蛋白Maker，美國Thermo Fisher 公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、PAGE 凝膠制備試劑盒，上海雅酶生物科技有限公司；聚偏氟乙烯 (PVDF)膜，美國Millipore公司；anti-GAPDH、anti-MURF1、anti-Atrogin1、anti-SIRT3、anti-TGF-βR1、anti-mTOR、anti-Acetyl-lysine，美國Cell Signaling Technology 公司；蛋白質(zhì)免疫印記二抗鼠/兔，Jackson Immuno Research公司；馬血清，Gibco公司；anti-Dystrophin，Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)小鼠均為12月齡的C57老齡化老鼠，飼養(yǎng)于無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)動(dòng)物房，12 h晝夜循環(huán)。動(dòng)物房溫度和濕度分別保持為(24±2) ℃，55%±5%。飼養(yǎng)期間小鼠以正常飼料喂養(yǎng)，可以自由進(jìn)食和飲水。

30只實(shí)驗(yàn)小鼠在為期一周的新環(huán)境適應(yīng)期結(jié)束后，被隨機(jī)分為3組(n=10)：空白對(duì)照組、青稞水提物干預(yù)組(每日灌胃800 mg/kg青稞水提物，以體質(zhì)量計(jì))、青稞醇提物干預(yù)組(每日灌胃800 mg/kg青稞醇提物，以體質(zhì)量計(jì))。空白對(duì)照組的小鼠按照體質(zhì)量每日灌胃相應(yīng)體積的超純水。此外青稞水提物使用超純水溶解，醇提物與超純水混合均質(zhì)后進(jìn)行灌胃。

1.3 儀器與設(shè)備

M1- L236A型商用烤箱，廣東美的廚房電器制造有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海恒科技有限公司；R- 100型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；FW100型高速粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；CM3050S型冰凍切片機(jī)，德國Leica公司；Nano Drop 2000型分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific公司；Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀，美國Bio Rad公司；Scientz- 48型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；LSM880型高分辨率激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司公司；EchoMRI型核磁(NMR)體成分分析系統(tǒng)，美國EchoMRI公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1青稞提取物的制備

青稞提取物的提取參照Nie等[7]的方法，并稍做修改。青稞經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩，取適量按照料液比為1∶25(g∶mL)加入去離子水或無水乙醇，于60 ℃水浴中浸提2次，每次1 h，抽濾，合并濾液。提取物于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至其原始體積的1/8，并將濃縮液冷凍干燥成粉末，分別得到水溶性(WS)和醇溶性(AS)組分。最終產(chǎn)品在-20 ℃中儲(chǔ)存，備用。

1.4.2青稞提取物基礎(chǔ)成分的測定

采用苯酚硫酸法對(duì)青稞提取物總碳水化合物含量進(jìn)行測定，具體步驟參考文獻(xiàn)[9]?？偡雍繙y定實(shí)驗(yàn)的試劑來源于北京索萊寶科技有限公司。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定，具體步驟參考文獻(xiàn)[9]。

1.4.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

每日測量小鼠體質(zhì)量和攝食量。在青稞提取物干預(yù)12周后，所有小鼠預(yù)先適應(yīng)跑步機(jī)3 d。根據(jù)Jordan等[10]的方法進(jìn)行小鼠跑步機(jī)實(shí)驗(yàn)。簡單來說，跑步機(jī)以5 m/min的速度啟動(dòng)，持續(xù)3 min。跑步機(jī)以2 m/min的速度連續(xù)加速，至20 m/min后，停止加速。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，跑步機(jī)速度保持恒定在20 m/min，直到小鼠精疲力竭(小鼠在15 s內(nèi)從跑步機(jī)上掉下來超過3次被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn))，無法再忍受跑步，記錄此時(shí)小鼠的累計(jì)跑步時(shí)間和距離。待小鼠休息2 d后，利用核磁(NMR)體成分分析系統(tǒng)對(duì)小鼠的瘦體質(zhì)量(lean mass)進(jìn)行檢測。隨后將小鼠處死，迅速獲取其腓腸肌 (GAS)、脛骨前肌 (TA) 和比目魚肌 (SOL)。將小鼠部分肌肉組織放置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中，其余部分在液氮中速凍，儲(chǔ)存于-80 ℃的冰箱中。

1.4.4RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)Pan等[11]的方法，從肌肉組織中提取總RNA，并根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green Master Mix實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒的操作說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.5蛋白免疫印記分析

參照Li等[12]的方法進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。小鼠肌肉組織加入RIPA裂解緩沖液后，在高通量組織研磨儀中勻漿，隨后4 ℃，12 000 r/min離心30 min得到上清液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并將所有蛋白樣品調(diào)整為相同濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min得到組織樣品。接著用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)模、封閉，加入相應(yīng)一抗4 ℃搖床過夜孵育，充分洗滌后，用二抗孵育1 h。最后加入顯影液，上機(jī)檢測。

1.4.6SOD與MDA含量的檢測

取適量組織樣品加入SOD樣品制備液，勻漿，4 ℃，12 000 r/min下離心5 min，收集上清液作為待測樣品，并根據(jù)試劑盒的操作說明測定SOD活性。取適量組織樣品加入PBS進(jìn)行勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液，并根據(jù)試劑盒的操作說明測定MDA含量。

1.4.7免疫組織化學(xué)染色

參照Kou等[13]的方法，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。小鼠肌肉組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛水溶液固定后脫水，石蠟包埋，切片、烘片，并使用Dystrophin抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，在LSM880高分辨率激光共聚焦顯微鏡下拍攝切片。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用One way ANOVA分析多組數(shù)據(jù)之間的差異性，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞提取物基礎(chǔ)成分分析

對(duì)青稞水提物與醇提物的基礎(chǔ)成分進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，青稞水提物中含有大量的碳水化合物，部分水溶性多酚以及少量蛋白質(zhì)。與青稞水提物相比，青稞醇提物中則含有更豐富的酚類化合物，碳水化合物較少?？梢钥闯?，青稞醇提物中的碳水化合物含量遠(yuǎn)低于青稞水提物，這主要是由于提取青稞醇提物所用的無水乙醇會(huì)導(dǎo)致大分子碳水化合物的析出[7]。因此，青稞水提物中的碳水化合物含有大量的大分子可溶性多糖，而醇提物中的碳水化合物為小分子糖類。

表2 青稞提取物基礎(chǔ)成分分析

2.2 青稞提取物對(duì)老年小鼠骨骼肌質(zhì)量與功能的影響

隨著衰老的發(fā)生，骨骼肌的質(zhì)量會(huì)逐漸減少，骨骼肌的功能損失會(huì)逐步增大[14]。青稞提取物對(duì)老年小鼠骨骼肌質(zhì)量和功能的影響見圖1。由圖1(a)和圖1(b)可見，與對(duì)照組相比，青稞提取物灌胃12周后衰老小鼠體質(zhì)量顯著降低，瘦體質(zhì)量顯著增加。由圖1(c)和圖1(d)可見，與對(duì)照組相比，青稞提取物干預(yù)顯著增加了衰老小鼠力竭時(shí)的跑步距離和跑步時(shí)間，表明青稞提取物可以有效延緩衰老導(dǎo)致的骨骼肌質(zhì)量和功能的下降。

抗肌萎縮蛋白(dystrophin)是一種大型支架蛋白。dystrophin通過將細(xì)胞骨架與肌肉組織的肌膜相連接，起到維持肌肉細(xì)胞完整性的作用[15]。以往的研究表明，衰老會(huì)顯著降低dystrophin蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥(DMD)[16]。由圖1(e)和圖1(f)可見，與對(duì)照組相比，青稞提取物干預(yù)顯著增加了小鼠腓腸肌中dystrophin免疫熒光的強(qiáng)度，說明這兩種青稞提取物均能有效抑制衰老誘導(dǎo)的dystrophin蛋白表達(dá)的下降。本研究表明，青稞提取物可以有效緩解衰老導(dǎo)致的小鼠骨骼肌質(zhì)量和功能的下降。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；圖(e)中白箭頭表示處于萎縮的肌纖維。

2.3 青稞提取物對(duì)老年小鼠骨骼肌萎縮的影響

青稞提取物對(duì)老年小鼠骨骼肌萎縮的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。肌肉環(huán)狀指基因 1(muscle ring finger1，MURF1)和肌肉萎縮盒F基因(muscle atrophy F-box，Atrogin1)是骨骼肌萎縮的標(biāo)記物[16]，它們的表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮。為進(jìn)一步研究青稞提取物是否抑制了老年小鼠的肌肉萎縮，本研究檢測了老年小鼠腓腸肌中MURF1、Atrogin1基因和蛋白的表達(dá)。由圖2可知，與對(duì)照組相比，青稞提取物干預(yù)顯著降低了MURF1、Atrogin1 mRNA和蛋白的表達(dá)，說明青稞提取物能有效抑制衰老小鼠的肌萎縮。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.4 青稞提取物對(duì)骨骼肌中SIRT3信號(hào)表達(dá)及肌內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

青稞提取物對(duì)骨骼肌中SIRT3信號(hào)表達(dá)及肌內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。Sirtuins蛋白家族又被稱為長壽蛋白家族，是一種NAD+依賴性脫乙酰酶。Sirtuins蛋白家族中的SIRT3已被證明在維持細(xì)胞內(nèi)線粒體正常功能，緩解骨骼肌氧化應(yīng)激中起著重要的作用[17]。相關(guān)研究表明，小鼠骨骼肌特異性敲除SIRT3，會(huì)導(dǎo)致其耗氧量減少，活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加，并在骨骼肌中引起氧化應(yīng)激[18]。近年來，SIRT3被認(rèn)為是治療ROS造成的骨骼肌增齡性萎縮研究中的一個(gè)新的靶點(diǎn)[14]。由圖3(a)可見，青稞提取物干預(yù)顯著增加小鼠腓腸肌中SIRT3蛋白的表達(dá)。和本研究結(jié)果一致，Nie等[7]的研究也證實(shí)了青稞醇提物和水提物的抗氧化作用與SIRT3信號(hào)激活的相關(guān)性。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。

SOD被認(rèn)為是抗氧化酶系的重要組成成員，在細(xì)胞氧化損傷的第一道防線中起主要作用。SIRT3可以通過去SOD乙酰化以激活SOD，進(jìn)而清除超氧陰離子自由基[19]。此外，MDA是生物膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，MDA的產(chǎn)生會(huì)加重膜損傷。MDA含量是衡量機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度和自由基水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)[20]。由圖3(b)和圖3(c)可見，青稞提取物干預(yù)不僅顯著增加了老年小鼠腓腸肌中SOD的活性，還減少了老年小鼠腓腸肌中MDA的含量，說明這兩種青稞提取物均能抑制老年小鼠骨骼肌內(nèi)的氧化應(yīng)激。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，機(jī)體會(huì)釋放出大量炎癥因子，如：腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)、白介素-8 (interleukin-8,IL-8)等。炎癥因子在骨骼肌的過多積累會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮,從而導(dǎo)致肌肉減少癥[21]。由圖3(d)可見，與對(duì)照組相比，青稞提取物干預(yù)顯著降低了TGF-β受體1(TGF-βR1)的蛋白表達(dá)。由圖3(e)和圖3(f)可見，與對(duì)照組相比，青稞提取物干預(yù)顯著減少了小鼠腓腸肌中炎癥相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，表明青稞提取物能有效抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)，從而抑制肌萎縮。本研究表明，青稞水提物與醇提物均能通過激活SIRT3途徑降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制骨骼肌的衰老。

此外，與水提物相比，青稞醇提物具有更強(qiáng)的消炎及抗氧化作用，這可能與青稞醇提物含有更多酚類活性物質(zhì)有關(guān)[7]。這些酚類活性物質(zhì)可以有效清除自由基，從而降低衰老引起的氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)。

3 結(jié) 論

本研究利用青稞提取物對(duì)衰老小鼠進(jìn)行飲食干預(yù)。研究結(jié)果表明：長期補(bǔ)充青稞水提物和醇提物均可以有效阻止老年小鼠骨骼肌肌肉重量的減輕，增強(qiáng)其骨骼肌中的線粒體活性，并有效延緩其衰老性肌萎縮的進(jìn)程，使老年小鼠的運(yùn)動(dòng)能力得到增強(qiáng)。從機(jī)制上看，這兩種青稞提取物均通過激活SIRT3信號(hào)通路有效抑制老年小鼠骨骼肌中的氧化應(yīng)激，進(jìn)而延緩與衰老相關(guān)的肌肉質(zhì)量與功能的變化。本研究表明，富含抗氧化成分的青稞提取物可以有效延緩衰老性肌萎縮，證明以青稞提取物作原料制備防治衰老性肌萎縮的功能性食品具有較高的可行性。關(guān)于青稞提取物是否通過其他信號(hào)通路改善老年小鼠的骨骼肌性能，以及青稞提取物中主要功能活性成分的篩選還有待進(jìn)一步的研究。