侯殿志， 唐 健， 鄭博妍， 賈秋菊， 周素梅， 沈 群

(1.北京工商大學 食品與健康學院， 北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

非酒精性脂肪性肝(NAFLD)是指排除繼發(fā)性原因或酒精濫用所致的以肝臟脂肪過度積累為主要特征的臨床病理綜合征[1]。目前，NAFLD已成為世界范圍內(nèi)的一種常見的肝臟疾病，其流行率在22.10%～28.65%。NAFLD對人類健康造成了嚴重的影響，同時也對社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD的發(fā)生也增加了其他一些慢性疾病的風險，如糖尿病和心血管疾病等[3]。然而，NAFLD發(fā)生和發(fā)展的病理機制較為復雜，目前尚無明確的針對NAFLD治療的藥物。生活方式改變和飲食調(diào)整是目前緩解NAFLD的主要策略[4]。近年來，作為飲食干預策略的功能性食品或其成分因在治療和管理NAFLD方面表現(xiàn)出的有益效果而受到廣泛的關注[5]。大量的流行病學調(diào)查顯示，一定量雜豆類食物的攝入可以降低高脂膳食引發(fā)的NAFLD的發(fā)病率[6-7]。

綠豆是我國大部分地區(qū)普遍種植且經(jīng)常食用的豆類作物之一。綠豆含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)(14.6%～32.6%)、膳食纖維(14%～25%)、礦物質(zhì)(3.6%～4.2%)和大量的植物化學物[8]，可滿足人體正常的營養(yǎng)需求。除了營養(yǎng)方面的性質(zhì)外，古代醫(yī)學典籍和現(xiàn)代實驗研究均證實綠豆作為一種功能性食品，具有多種生理功效，如降糖、降脂及抗炎等[9-10]。在日常生活中，人們對綠豆主要是以全綠豆和去皮綠豆兩種形式進行食用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，全綠豆和去皮綠豆均可顯著改善肥胖小鼠和糖尿病前期小鼠肝脂肪變性和腸道菌群紊亂[11-12]，但是，全綠豆和去皮綠豆對于肝脂肪變性改善作用的具體調(diào)控作用途徑以及它們之間的差異化機制還待闡明。

轉錄組學作為一個在mRNA表達水平上研究生物在某一生理進程中所有基因轉錄及其轉錄調(diào)控規(guī)律的測序手段，可提供大量代謝信息，用于幫助預測響應外部刺激而激活的單個基因作用[13]。目前，轉錄組學已被廣泛用于尋找疾病的治療靶標[14]。本研究以高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠為模型，利用轉錄學鑒定和篩選全綠豆和去皮綠豆改善肥胖小鼠肝脂肪變性的差異表達基因和富集的信號調(diào)控途徑，以期揭示綠豆緩解肝脂肪變性的潛在作用機制。希望本研究結果可為綠豆基功能性食品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明綠豆，購自山西東方物華農(nóng)業(yè)科技有限責任公司；4周齡雄性C57/BL6J小鼠[(16±2) g]，動物倫理審查編號為AW08089102-1- 4，北京維通利華實驗動物技術有限公司；高脂飼料(D12492)和低脂飼料(D12450J)，美國Research Diets公司；TRIzol試劑，賽默飛世爾科技有限公司；DNase Ⅰ(脫氧核糖核酸酶Ⅰ)，日本TaKara公司；TruSeqTM RNA sample preparation kit試劑盒，美國Illumina公司；SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit試劑盒，賽默飛世爾科技有限公司；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix，碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)ELISA檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

NanoDrop 2000型超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；Agilent 2100 型生物分析儀，安捷倫科技有限公司；CFX96型 Real-Time PCR 檢測系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；NovaSeq 6000型測序系統(tǒng)，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1去皮綠豆的制備及特種飼料加工

將綠豆常溫下于蒸餾水中浸泡8 h，手動揉搓去除種皮，然后冷凍干燥。將干燥的全綠豆和去皮綠豆研磨成粉，過80目篩，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)高脂飼料配方(D12492)，將質(zhì)量分數(shù)為30%的全綠豆(可利用碳水化合物64.78%，灰分3.36%，脂肪2.58%，蛋白質(zhì)25.81%，粗纖維3.48%，以干基計)和去皮綠豆(可利用碳水化合物66.28%，灰分2.99%，脂肪2.56%，蛋白質(zhì)27.32%，粗纖維0.85%，以干基計)以等宏量營養(yǎng)素和等熱量的形式配比到高脂飼料中，具體的配比參考文獻[15-16]。特種飼料委托常州鼠一鼠二生物科技有限公司加工完成。

1.3.2動物實驗設計與分組

整個動物實驗方案由中國農(nóng)業(yè)大學實驗動物福利和動物實驗倫理委員會批準，并嚴格按照相關的規(guī)定執(zhí)行。將32只小鼠進行適應性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)小鼠的體質(zhì)量按照區(qū)組隨機分組的方法分為4組，每組8只，分別為對照組(NCD)、模型組(HFD)、全綠豆干預組(HFD- WMB)、去皮綠豆干預組(HFD- DMB)。4只小鼠1籠，自由取食和取水，干預周期為12周。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，溫度為(22±2) ℃，相對濕度為55%±10%，12 h光照交替。

1.3.3肝組織收集

小鼠麻醉處死后，進行解剖處理，取小鼠肝大葉于凍存管中，立即放入液氮，隨后轉移到-80 ℃冰箱儲存。每組隨機取3只小鼠的肝臟樣本用于轉錄組測序分析。

1.3.4血清中炎癥因子的測定

使用市售的ELISA檢測試劑盒測定血清腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)的濃度。測定方法根據(jù)制造商的使用說明書進行。

1.3.5RNA的提取和轉錄組測序

1)RNA提取。根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol?試劑從組織中提取總RNA。具體方法：將100 mg肝組織樣品在液氮中研磨后，加入1.0 mL Trizol(靜置10 min)。隨后，加入200 μL氯仿(混勻30 s，靜置5 min)，1 000 r/min離心15 min(4 ℃)。上層水相(約0.4 mL)轉移至滅菌EP管，以1∶1的體積比加入異丙醇(靜置20 min)。1 000 r/min再次離心15 min(4 ℃)，棄上清液，自然風干(約10 min)，得到的RNA呈半透明狀，并且在超凈工作臺中完成。加入20～50 μL DEPC水溶解RNA沉淀，使用ND- 2000(NanoDrop Technologies)對其進行定量，1%凝膠電泳測定所提取RNA質(zhì)量。僅使用高質(zhì)量的RNA樣品[OD260/280=1.8～2.2，OD260/230≥2.0，RIN(表示RNA樣品的完整度)≥6.5，28S：18S≥1.0(衡量提取RNA完整性的指標)，樣品總量>1 μg]用于后續(xù)實驗。

2)文庫制備和測序。按照Illumina(San Diego, CA)的TruSeqTMRNA樣品制備試劑盒使用1 μg總RNA制備RNA-seq轉錄組文庫。簡單來說，根據(jù)polyA選擇方法，通過oligo(dT)磁珠分離信使RNA，用片段緩沖液將其片段化。使用SuperScript雙鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen，CA)和隨機六聚體引物(Illumina)合成雙鏈cDNA。根據(jù)Illumina的文庫構建方案對合成的cDNA進行末端修復，磷酸化和“A”堿基添加。選擇質(zhì)量分數(shù)為2%的低范圍超瓊脂糖上300 bp cDNA靶片段大小的文庫，然后使用Phusion DNA聚合酶(NEB)進行15個PCR周期的PCR擴增。通過TBS380定量后，使用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測序儀(2×150 bp讀取長度)對配對末端的RNA-seq測序文庫進行測序。測序過程由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.6轉錄組測序分析

原始測序數(shù)據(jù)以fastq格式保存，使用fastx_toolkit_0.0.14軟件對原始數(shù)據(jù)進行測序質(zhì)量評估，包括：堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計；堿基錯誤率分布統(tǒng)計；A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計。由SeqPrep(https:∥github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https:∥github.com/najoshi/sickle)使用默認參數(shù)進行質(zhì)量控制。使用HISAT2(http:∥ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)軟件以定向模式將Clean Reads與指定的參考基因組進行序列比對，比對率從92.82%到96.63%不等[17]。獲得用于后續(xù)轉錄本組裝、表達量計算等的Reads，在已有參考基因組基礎上，將Reads進行組裝拼接獲得參考基因，使用表達量計算軟件對參考基因表達水平進行定量差異分析。

為了鑒定兩個不同樣品之間的DEG(差異表達基因)，根據(jù)TPM的方法計算每個轉錄本的表達水平。RSEM(http:∥deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)用于定量基因豐度。在計算每個基因的表達水平后，利用edgeR進行差異表達分析。利用錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)，確定多次測試中P值的閾值，并進行分析，使用FDR閾值≤0.01和絕對值log2FC(上下調(diào)倍數(shù))≥2來判斷重要性基因表達之間的差異。利用差異表達基因(DEGs)建立基因集，并與京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫比對，對基因集中的基因進行KEGG功能富集分析。Q值≤0.05的GO和KEGG途徑均被認為在DEGs中顯著富集。

1.3.7qPCR檢測差異基因的表達

qPCR檢測差異基因表達參考Hou等[18]的方法進行。TNF-α的引物序列為5′-TGGCCCAGACC CTCACACTC-3′和5′-CTCCTGGTATGAAATGGCAA ATC-3′。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用單因素方差分析(one-way ANOVA，Tukey test)計算組間差異。P<0.05代表存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad 8.0軟件進行圖像的繪制。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數(shù)據(jù)及比對分析

我們前期的實驗結果顯示，綠豆可顯著緩解肥胖小鼠的體質(zhì)量、體質(zhì)量增量和肝脂肪變性情況[11]，但相比于去皮綠豆，全綠豆的作用效果更為顯著。為了進一步探究綠豆改善肝脂肪變性的潛在機制，我們以高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠為模型，采用轉錄組技術對對照組(NCD)、模型組(HFD)、全綠豆干預組(HFD- WMB)和去皮綠豆干預組(HFD- DMB)小鼠的肝臟組織進行RNA測序分析。

不同組別中肝樣品轉錄組測序質(zhì)量和序列比對結果見表1。表1顯示，經(jīng)轉錄組測序后，NCD組，HFD組，HFD- WMB組和HFD- DMB組分別平均獲得50 937 731、48 910 641、51 540 116和52 250 552條原始目數(shù)，經(jīng)質(zhì)控去除低質(zhì)量的測序目數(shù)后，分別為50 555 963、48 502 161、51 156 807和51 853 601條測序目數(shù)。Q20、Q30分別指測序質(zhì)量在99.0%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比。在本研究中采用Q20和Q30對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，一般Q20在85%以上，Q30在80%以上可滿足測序的質(zhì)量要求。表1中的結果顯示，Q20值均大于98%，Q30值均大于94%。測序所得的總條目數(shù)和質(zhì)量評估結果表明，本研究測序的數(shù)量和質(zhì)量達到了后續(xù)分析的要求。另外，測序結果與參考基因組的比對結果也顯示，所有樣品的唯一比對率均達到83%以上，證實本次測序結果的有效性。

表1 不同組別中肝樣品轉錄組測序質(zhì)量和序列比對

2.2 主成分分析

根據(jù)基因在不同樣本間的表達情況，對4個組別的基因組樣本進行主成分分析(PCA)，分析結果見圖1。圖1顯示，4組基因組樣本之間各自明顯聚集且表現(xiàn)出顯著分離。具體而言，NCD組與HFD組之間明顯分離，表明高脂飼養(yǎng)顯著改變了小鼠肝臟的基因表達譜。經(jīng)綠豆干預后，HFD- WMB和HFD- DMB兩組與HFD組呈現(xiàn)出的顯著分離暗示綠豆干預可顯著逆轉部分高脂飼養(yǎng)導致的基因表達改變。盡管HFD- WMB組和HFD- DMB組之間也顯示各自聚集和分離的現(xiàn)象，但是距離較為接近。

圖1 不同組別基因表達主成分分析

2.3 差異表達基因分析

NCD和HFD組、HFD和HFD- WMB組，HFD和HFD- DMB組之間的表達量差異基因(P<0.05，|log 2FC|≥2.0)分析結果見圖2。圖2顯示，NCD組和HFD組之間共有819個表達量差異基因。與NCD組相比，HFD組有606個表達量差異基因顯示出顯著上調(diào)，213個表達量差異基因顯示出顯著下調(diào)[圖2(a)和圖2(d)]。經(jīng)綠豆干預后，與HFD組相比，HFD- WMB組有306個表達量差異基因顯示出顯著上調(diào)，596個表達量差異基因顯示出顯著下調(diào)[圖2(b)和圖2(e)]，而HFD- DMB組有461個表達量差異基因顯示出顯著下調(diào)，1 132個表達量差異基因顯示出顯著上調(diào)[圖2(c)和圖2(f)]。這些顯著上調(diào)和下調(diào)的表達量差異基因表明綠豆在一定程度上可通過調(diào)控相關基因的表達改善小鼠的肝脂肪變性。

圖2 不同組別的差異表達基因分析

2.4 KEGG功能注釋分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫。利用KEGG數(shù)據(jù)庫，可將基因集中的基因按照參與的信號通路或行使的功能進行分類。為了進一步明確組間表達量差異基因的功能，對HFD和HFD- WMB組、HFD和HFD- DMB組之間的表達量差異基因進行KEGG功能注釋分析。KEGG通路的功能注釋分析結果見圖3。圖3顯示，根據(jù)KEGG分類，HFD和HFD- WMB組、HFD和HFD- DMB組之間的表達量差異基因分別注釋到了代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程、生物體系統(tǒng)和人類疾病中。在代謝相關的功能中，全綠豆和去皮綠豆分別有30和52個表達量差異基因顯著注釋到了脂質(zhì)代謝相關的通路上，其次有23和29個表達量差異基因注釋到了碳水化合物代謝相關的通路上。脂質(zhì)代謝和碳水化合物代謝被認為與肝脂肪變性之間存在密切聯(lián)系，因此，基于KEGG功能注釋分析的結果，進一步證實了綠豆改善肥胖小鼠肝脂肪變性與調(diào)控一些表達量差異基因存在顯著的相關性。

圖3 KEGG通路的功能注釋分析

2.5 KEGG途徑富集分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對表達量差異基因可能參與的信號通路進行富集分析，結果見圖4。圖4顯示了HFD和HFD- WMB組、HFD和HFD- DMB組之間表達量差異基因富集的相關信號通路。以HFD與HFD- WMB之間表達量差異基因富集的前20條信號通路為基準，表達量差異基因參與了多種不同疾病的調(diào)控，其中涉及的與肝脂肪變性調(diào)控相關的信號通路，包括NOD樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路。不同組別中與肝脂肪變性調(diào)控相關的KEGG信號通路見表2。從表2中可以看出，3組之間的表達量差異基因顯著富集到了2種信號通路中。Liu等[18]采用比較轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，蝦青素對小鼠酒精性肝的保護作用主要是通過調(diào)控NOD樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路完成的。NOD樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路與調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應密切相關[19]。最近的研究表明，炎癥小體激活引發(fā)的炎癥應答與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關[20]。Kwon等[21]的研究結果顯示，木犀草素可通過靶向Toll樣受體信號通路預防飲食誘導肥胖小鼠肝和脂肪細胞纖維化及胰島素抵抗?；趫D4和表2的分析可以看出，盡管綠豆可通過調(diào)控多信號通路的協(xié)同作用改善小鼠肝脂肪變性，但是，綠豆對肥胖小鼠肝脂肪變性的改善作用可能主要側重于炎癥和免疫相關的NOD樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路上。

Rich factor表示該通路中富集到的基因/轉錄本數(shù)目與注釋基因/轉錄本數(shù)目的比值。

表2 不同組別中與肝脂肪變性調(diào)控相關的KEGG信號通路

另外，需要注意到的是，NOD樣受體信號通路中所含有的表達量差異基因的數(shù)量幾乎是Toll樣受體信號通路的兩倍。結合我們的研究目的以及考慮到NOD樣受體信號通路在HFD模型組和綠豆干預組中均可顯著富集且在肝脂肪變性中發(fā)揮的重要作用，在接下來的研究中選擇NOD樣受體信號通路進一步分析綠豆改善肥胖小鼠肝脂肪變性的潛在機制。

2.6 NOD樣受體信號通路中調(diào)控肝脂肪變性的表達量差異基因分析

綠豆干預后富集在NOD樣受體信號通路上的表達量差異基因見表3。由表3可知，對NOD樣受體信號通路中的表達量差異基因進行分析發(fā)現(xiàn)，NCD和HFD組，HFD和HFD- WMB組，HFD和HFD- DMB組之間有12個共有表達量差異基因，即干擾素激活基因206，干擾素激活基因211，鳥苷酸結合蛋白7，鳥苷酸結合蛋白5，鳥苷酸結合蛋白3，2′～5′寡腺苷酸合成酶3，鳥苷酸結合蛋白2，干擾素激活基因208，2′～5′寡腺苷酸合成酶1G，干擾素調(diào)節(jié)因子7，腫瘤壞死因子，信號轉導和轉錄激活因子1。與NCD組相比，這12個表達量差異基因在HFD組顯著上調(diào)，但經(jīng)過綠豆干預后，它們均得到顯著下調(diào)。這表明綠豆改善高脂飼養(yǎng)肥胖小鼠肝脂肪變性的效果很大可能與調(diào)控這些基因的表達有關。

2.7 小鼠血清中炎癥因子的測定及qPCR驗證差異基因的表達

從2.5和2.6結果的分析可以看出，綠豆有可能主要是通過調(diào)控炎癥相關的信號通路和基因完成肝脂肪變性的改善作用。我們前期的實驗結果已經(jīng)證實，綠豆可顯著改善肥胖小鼠肝臟組織中炎性細胞浸潤[11]。為了更好地支撐本研究的實驗結果，我們對小鼠血清中的炎癥因子TNF-α和IL-6進行了測定，炎癥因子水平見圖5。圖5顯示，與NCD組相比，盡管HFD組中的炎癥因子TNF-α和IL-6的水平顯著升高，但是經(jīng)過全綠豆(HFD-WMB)的干預后，兩種炎癥因子的水平顯著降低[圖5(a)，(b)]。去皮綠豆對于炎癥因子TNF-α和IL-6的干預僅僅只是顯示出改善的趨勢，但不顯著。這一結果基本與轉錄組測序的結果一致。另外結合血清炎癥因子TNF-α的變化以及NOD信號通路中差異表達基因TNF的表達情況(表3)，我們重點對NOD樣受體信號通路中TNF-α轉錄因子進行了驗證。結果顯示，相比NCD組，HFD組小鼠肝臟中TNF-α mRNA的表達水平顯著提升。全綠豆顯著降低了高脂飼養(yǎng)肥胖小鼠肝組織中的TNF-α mRNA的表達情況(如圖1)，而去皮綠豆對TNF-α mRNA的表達量只表現(xiàn)出下降的趨勢，但并不顯著。在之前的研究中，牡荊素被發(fā)現(xiàn)可通過降低肝臟中TNF-α等炎癥因子mRNA的表達水平顯著改善小鼠的肝損傷[22]，而牡荊素也被認為是綠豆發(fā)揮功效作用的主要黃酮類物質(zhì)[9]。

表3 綠豆干預后富集在NOD樣受體信號通路上的表達量顯著差異基因及其差異倍數(shù)

不同小寫字母表示組間差異顯著。

3 結 論

綠豆對肥胖小鼠肝脂肪變性的改善作用與其調(diào)控肝臟中相關的基因表達有關。綠豆可顯著改變肥胖小鼠肝臟的基因表達譜，且與模型組小鼠相比，全綠豆和去皮綠豆干預組分別有902個(306個顯著上調(diào)和596個顯著上調(diào))和1 593個(461個顯著上調(diào)和1 132個顯著下調(diào))表達量差異基因。30和52個表達量差異基因顯著注釋到了脂質(zhì)代謝相關的通路上。KEGG通路富集分析結果表明，綠豆干預后的表達量差異基因發(fā)生了以NOD樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路激活為特征的功能轉變。綠豆引起了NOD樣受體信號通路中12個表達量差異基因的顯著下調(diào)。肥胖小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6水平的顯著降低以及肝臟TNF-α mRNA表達水平的降低對轉錄組測序的結果起到了很好的支撐作用。未來仍需要進一步的實驗研究驗證轉錄組學的推測，以及更多的證據(jù)來闡釋綠豆通過NOD樣受體信號通路緩解肝脂肪變性的分子機制。