吳華偉，劉 丹，陳曉春，高金源，鄧 永，秦義嫻，蘇 佳，黃小潔，薛青紅，陳延飛

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5, PIV5)屬于副黏病毒科腮腺炎病毒屬，基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，全長(zhǎng)15246 bp，由3’前導(dǎo)序列、5’尾隨序列和7個(gè)非重疊基因組成：3’-N-P/V-M-F-SH-HN-L-5’，依次編碼核衣殼蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、V蛋白、膜基質(zhì)蛋白(M)、小疏水性蛋白(SH)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、聚合酶蛋白(L)[1]。SH蛋白作為病毒的主要包膜糖蛋白，能夠抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[2-4]。2018年，中監(jiān)所采用RT-PCR方法首次從某企業(yè)的豬偽狂犬病活疫苗中檢測(cè)到PIV5污染[5]，隨后在PIV5污染來(lái)源篩查中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和牛血清為主要的污染來(lái)源。對(duì)于獸用生物制品以及動(dòng)物源性原輔材料中是否污染PIV5外源病毒的檢測(cè)而言，RT-PCR方法僅可以作為初篩方法或企業(yè)內(nèi)控方法，熒光抗體檢查法是現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》檢測(cè)特定外源病毒的推薦方法。國(guó)外已有個(gè)別PIV5蛋白的單克隆抗體(如F蛋白)供應(yīng)，但國(guó)內(nèi)除PIV5 RT-PCR檢測(cè)試劑盒外，尚無(wú)PIV5單克隆抗體或熒光抗體檢測(cè)試劑供應(yīng)，亟需開(kāi)展PIV5 單克隆抗體研究。研究采用原核表達(dá)的PIV5 SH蛋白按常規(guī)方法免疫小鼠后，共篩選到3株雜交瘤細(xì)胞，均可識(shí)別PIV5毒株，為外源性PIV5污染檢測(cè)用免疫熒光試劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株、重組質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Vero細(xì)胞、PIV5/01株，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存；pET43a-SH重組質(zhì)粒，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所構(gòu)建及鑒定；8周齡Balb/c雌性小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 表達(dá)菌株BL21(DE3)plys購(gòu)自北京全式金公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Proterin Marker購(gòu)自TaKaRa公司；HAT、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品；Mouse單克隆抗體亞型鑒定試劑盒為proteintech公司產(chǎn)品；QuickAntibody-Mouse 3 W佐劑為北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 重組質(zhì)粒pET43a-SH的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET43a-SH 0.5 μL轉(zhuǎn)化100 μL BL21(DE3)plys感受態(tài)細(xì)胞，挑菌于2 mL 相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子菌。按1∶100(V/V)接種于3 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD=0.6-0.8，IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 h。取1 mL誘導(dǎo)的菌液，12000 r/min，離心1 min，棄上清，沉淀用50-100 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定)，加入與緩沖液等體積的 2 ×loading buffer，100 ℃煮5 min，電泳檢測(cè)。

1.4 SH重組蛋白的可溶性分析 接1～2 μL活化的菌液到 5 ml相應(yīng)抗性 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，200 r/min。將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到1000 mL相應(yīng)抗性 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)至OD=0.6-0.8，IPTG(0.5 mmol/L)37 ℃誘導(dǎo)4 h。8000 r/min，離心6 min，棄上清。菌體用30 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超聲波破碎(500 W， 180次，每次5 s，間隔5 s)。取100 μL超聲后的菌懸液，12000 r/min，離心10 min，取50 μL上清至另一EP管，上清去除干凈后沉淀用50 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。電泳檢測(cè)。

1.5 SH重組蛋白的純化 用去離子水洗鎳柱，至pH 7.0。掛鎳，至pH 2-3。用去離子水洗柱至pH 7.0。用100 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡鎳柱。用50 mL含0.5 mol/L氯化鈉的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡鎳柱。稀釋樣品，使樣品中含氯化鈉終濃度為0.5 mol/L，上樣。上樣結(jié)束后，用含0.5 mol/L氯化鈉的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液洗柱。分別用含15 mmol/L咪唑、60 mmol/L咪唑的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)(含0.5 mol/L氯化鈉)溶液洗脫，分別收集蛋白峰。SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純化效果。

1.6 動(dòng)物免疫 將純化后的SH蛋白與QuickAntibody-Mouse 3 W佐劑等體積混勻，通過(guò)后腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠接種100 μL。此后每隔14天按相同劑量、相同途徑加強(qiáng)免疫，共免疫3次。融合前3日使用200 μL抗原加強(qiáng)免疫一次。

1.7 細(xì)胞融合 無(wú)菌條件下取免疫小鼠的脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)并重懸于20 mL培養(yǎng)液中，4 ℃放置備用。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)并重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，4 ℃放置備用。將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按5∶1混合，4 ℃離心，1000 r/min，10 min。輕輕去掉上清，并把細(xì)胞沉淀打散，置于37 ℃水浴中，在1 min內(nèi)邊混合邊逐滴加入1 mL 50%PEG，繼續(xù)混合，在2 min內(nèi)加入2 mL預(yù)熱的DMEM，4 min內(nèi)邊混合邊加入另外8 mL 含10%FBS的DMEM。4 ℃離心，1000 r/min，10 min。加入含10%FBS的DMEM輕輕混勻，鋪板，0.15 mL/孔，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。加入0.05 mL HAT，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。10 d后收集雜交瘤細(xì)胞上清采用間接免疫熒光方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 雜交瘤細(xì)胞篩選

1.8.1 熒光篩選板制備 將 PIV5/01株用病毒培養(yǎng)液稀釋為1000 TCID50/mL，接種已長(zhǎng)成細(xì)胞單層的96孔Vero細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL, 同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照。置37 ℃培養(yǎng)96～120 h。然后棄去培養(yǎng)液，用80%冷丙酮每孔加入100 μL固定30 min，自然風(fēng)干后作為熒光染色板。

1.8.2 間接免疫熒光試驗(yàn)程序 在PIV5/01株接毒孔和正常細(xì)胞孔中各加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，置37 ℃濕盒作用45 min，用PBS液洗滌5次，每次3 min；然后加入二抗(羊抗小鼠FITC熒光抗體1∶200)，37 ℃濕盒作用45 min，用PBS液洗滌5次，每次3 min，置于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，以正常細(xì)胞對(duì)照背景最暗且無(wú)特異性熒光，陽(yáng)性病毒孔出現(xiàn)特異性熒光作為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞選擇的依據(jù)。

1.9 雜交瘤細(xì)胞的鑒定

1.9.1 類(lèi)及亞類(lèi)的鑒定 使用proteintech公司的Mouse單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單抗亞類(lèi)。具體步驟如下：將雜交瘤細(xì)胞上清以1 ×PBST 1∶100稀釋后加入樣品孔中，50 μL/孔。將1×羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入樣品孔中，50 μL/孔。混勻器上輕輕混勻，蓋上封板膜，室溫孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體，1×PBST洗板3次，吸水紙上拍干。將顯色液A液和B液按1∶100混合后加入孔中，100 μL/孔。室溫避光顯色10～20 min，每孔加入終止液，100 μL/孔。結(jié)果判定：通過(guò)酶標(biāo)儀讀取OD450值，以O(shè)D450值最高的孔對(duì)應(yīng)的亞類(lèi)即為單抗亞類(lèi)。

1.9.2 IFA效價(jià)測(cè)定 用PBS將雜交瘤細(xì)胞上清分別稀釋為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160后按照1.8.2間接免疫熒光方法進(jìn)行檢測(cè)，可觀察到特異性熒光的最高稀釋度即為雜交瘤細(xì)胞上清的IFA效價(jià)。

1.9.3 細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè) 將雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)10代，分別取第1、5、10代細(xì)胞上清及其1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋度，按照1.8.2間接免疫熒光方法測(cè)定IFA效價(jià)。以IFA效價(jià)不低于第1代IFA效價(jià)作為細(xì)胞穩(wěn)定性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.10 單克隆抗體腹水的制備 小鼠腹腔注射液體石蠟致敏，每只0.5 mL，7 d后經(jīng)腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個(gè)細(xì)胞/mL，每只小鼠注射0.5 mL。待小鼠腹腔膨大時(shí)收取腹水，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清液，即獲得單克隆抗體。

1.11 單克隆抗體的純化與鑒定

1.11.1 單克隆抗體的純化 將收集的腹水以10000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，用小型濾器過(guò)濾，置于冰上。用預(yù)冷的20 mmol/L PB、3 mol/L NaCl pH7.4溶液平衡5 mL的HiTrap MabSelect親和純化親和柱10個(gè)柱體積。用預(yù)冷的20 mmol/L PB、3 mol/L NaCl pH 7.4溶液將樣品稀釋5倍后上柱結(jié)合。上樣完畢用預(yù)冷的20 mmol/L PB 3 mol/L NaCl pH 7.4溶液平衡2.5 mL的HiTrap MabSelect親和純化親和柱10個(gè)柱體積。用200 mmol/L 甘氨酸緩沖液， pH 3.0溶液洗脫，收集完畢，立即加入300 μL調(diào)節(jié)溶液，輕輕混勻即可。將收集的組分用SDS-PAGE電泳檢測(cè)進(jìn)行純度檢測(cè)。

1.11.2 濃度測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后的單克隆抗體濃度。

1.11.3 IFA效價(jià)測(cè)定 用PBS將純化后的單克隆抗體稀釋為1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000后按照1.8.2間接免疫熒光方法進(jìn)行檢測(cè)，可觀察到特異性熒光的最高稀釋度即為單克隆抗體的IFA效價(jià)。

1.11.4 特異性檢測(cè) 將BPIV3、BVDV、IBRV、BRV、CSFV、PPV、PRV、PEDV、TGEV、PRRSV、PCV2等毒株分別稀釋為1000TCID50/ml，然后接種已長(zhǎng)成單層的敏感細(xì)胞的96孔培養(yǎng)培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。培養(yǎng)3～4日后棄去上清液，80%冷丙酮固定后，采用制備的PIV5單克隆抗體進(jìn)行IFA染色，評(píng)價(jià)單抗的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET43a-SH的誘導(dǎo)表達(dá) 取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果在68 ku處可見(jiàn)表達(dá)條帶，符合預(yù)期(圖1)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)對(duì)照(BL21)；2-4：IPTG誘導(dǎo)(BL21)；5:0.5 mg/mL BSA;M.Protein molecular weight Marker;1.No induced control(BL21);2-4:IPTG induced(BL21);5. 0.5 mg/mL BSA;圖1 pET43a-SH誘導(dǎo)表達(dá)Fig 1 The induced expression of pET43a-SH

2.2 重組蛋白的可溶性分析 超聲裂解誘導(dǎo)后的菌液，將菌液上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，pET43a-SH蛋白主要出現(xiàn)在上清中，提示該蛋白在上清中表達(dá)(圖2)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 0.5 mg/mL BSA；2. 超聲后全菌；3. 超聲后上清；4. 超聲后沉淀M.Protein molecular weight Marker;1. 0.5 mg/mL BSA; 2. Total bacteria after ultrasound; 3. Ultrasound supernatant; 3. Precipitation after ultrasound.圖2 pET43a-SH重組蛋白可溶性分析Fig 2 Soluble analysis of pET43a-SH recombinant protein

2.3 蛋白純化結(jié)果 將表達(dá)蛋白掛鎳柱后用不同濃度的咪唑(15 mmol/L、60 mmol/L)洗脫，分別收集蛋白峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示咪唑洗脫的最佳濃度為60 mmol/L。最終獲得純度較高的pET43a-SH重組蛋白，濃度為1.7 mg/mL(圖3)。

2.4 雜交瘤細(xì)胞篩選 共篩選出3株IFA熒光陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為5B9、3G8、4E11(圖4)。

2.5 雜交瘤細(xì)胞的鑒定

2.5.1 類(lèi)及亞類(lèi)的鑒定 采用Mouse單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)三株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示5B9、3G8、4E11重鏈類(lèi)型均為IgG2a，輕鏈類(lèi)型均為Kappa(表1)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 蛋白原樣；2：流穿；3：15 mmol/L 咪唑洗脫；4-5：60 mmol/L 咪唑洗脫；6：0.5 mg/mL BSAM. Protein molecular weight Marker; 1. Original protein; 2. Flow through; 3. 15 mmol/L imidazole elution; 4-5: 60 mmol/L imidazole elution; 6. 0.5 mg/mL BSA圖3 pET43a-SH重組蛋白的純化Fig 3 Purificaiton of pET43a-SH recombinant protein

1. 雜交瘤細(xì)胞株5B9; 2. 雜交瘤細(xì)胞株3G8；3. 雜交瘤細(xì)胞株4E11；4. 正常細(xì)胞對(duì)照1. Hybridoma cell line 5B9; 2. Hybridoma cell line3G8; 3. Hybridoma cell line 4E11; 4. Normal cell control圖4 雜交瘤細(xì)胞株的間接免疫熒光分析Fig 4 Indirect immunofluorescence analysis of hybridoma cell lines

表1 ELISA法測(cè)定單克隆抗體類(lèi)及亞類(lèi)Tab 1 Detection of subclasses of McAbs by ELISA

2.5.2 細(xì)胞上清 IFA效價(jià)測(cè)定 經(jīng)測(cè)定，5B9、3G8、4E11三株雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞上清IFA效價(jià)分別為1∶20、1∶10：1∶5。

2.5.3 細(xì)胞分泌穩(wěn)定性 將雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)10代，分別取其第1、5、10代細(xì)胞上清，5B9、3G8、4E11三株雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞上清IFA效價(jià)分別為1∶20～1∶40、1∶10、1∶5～1∶10，穩(wěn)定性較好。

2.6 腹水純化結(jié)果 將5B9雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后接種小鼠制備腹水。采用HiTrap MabSelect親和純化方法對(duì)采集的腹水進(jìn)行純化，獲得純度不低于90%的單克隆抗體(圖5)。

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 5B9腹水掛柱后流穿液；2. 5B9腹水掛柱后平衡液洗雜；3. 5B9腹水純化洗脫液M. Protein molecular weight Marker; 1. 5B9 ascites was transfused after hanging the colum; 2. Cleaning of 5B9 ascites with balanced solution after hanging column; 3. 5B9 ascites purified eluent圖5 5B9腹水純化結(jié)果Fig 5 Results of 5B9 ascites purification

2.7 腹水單抗?jié)舛葴y(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抗體濃度，濃度為4.256 mg/mL。

2.8 IFA效價(jià)測(cè)定 經(jīng)測(cè)定，純化后5B9單抗IFA效價(jià)可達(dá)到1∶2000(圖6)。

1.5B9腹水1∶1000染色；2. 5B9腹水1∶2000染色; 3.正常細(xì)胞對(duì)照1. 5B9 ascites 1∶1000 staining; 2. 5B9 ascites 1∶2000 staining; 3. Normal cell control圖6 5B9腹水的IFA效價(jià)測(cè)定Fig 6 Determination of IFA titer of 5B9 ascites

2.9 特異性檢驗(yàn) 采用純化后的5B9單抗進(jìn)行IFA染色，除PIV5/01株陽(yáng)性對(duì)照外，與BPIV3、BVDV、IBRV、BRV、CSFV、PPV、PRV、PEDV、TGEV、PRRSV、PCV2等感染的細(xì)胞孔及其正常細(xì)胞對(duì)照孔均無(wú)特異性綠色熒光出現(xiàn)，說(shuō)明特異性良好。

3 討論與結(jié)論

副流感病毒5型自1956年從原代猴腎細(xì)胞中首次分離[6]以來(lái)，傳播迅速，目前已分布至全球。PIV5感染宿主范圍較廣，可感染人、犬、貓、豬、牛、虎、小熊貓、豚鼠等多種宿主[7-9]。PIV5可通過(guò)呼吸道途徑在易感動(dòng)物中水平傳播，除犬出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀可誘發(fā)感染犬出現(xiàn)“犬窩咳”外，其他動(dòng)物大都呈現(xiàn)隱性感染，不易被發(fā)現(xiàn)，可成為影響獸用生物制品質(zhì)量的潛在風(fēng)險(xiǎn)。牛血清、細(xì)胞(原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞)、種毒等為PIV5污染的主要來(lái)源[10]，除可采用RT-PCR方法進(jìn)行快速初篩外，最終需要采用病毒分離并結(jié)合免疫熒光方法才能進(jìn)行確診。鑒于國(guó)內(nèi)尚無(wú)PIV5單克隆抗體及免疫熒光抗體，開(kāi)展相關(guān)試劑研制十分迫切。

目前，常用ELISA、IFA等方法作為雜交瘤細(xì)胞篩選的方法。相比較ELISA方法而言，IFA方法直接與感染病毒進(jìn)行反應(yīng)，能更大可能識(shí)別PIV5 SH蛋白的天然抗原表位，從而避免采用表達(dá)的蛋白可能存在的交叉反應(yīng)現(xiàn)象，檢測(cè)時(shí)間更短，結(jié)果更直觀可靠。本研究利用大腸桿菌表達(dá)的純化PIV5 SH蛋白，按常規(guī)方法免疫小鼠，采用間接免疫熒光方法篩選出3株雜交瘤細(xì)胞株，制備的腹水單抗IFA效價(jià)可達(dá)到1∶2000，與BPIV3等豬牛常見(jiàn)病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，為下一步開(kāi)展PIV5診斷試劑(如IFA檢測(cè)試劑盒)研制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。