魏秀麗，馮言言，張傳津*，張 琦，楊志昆，馮 濤

(1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100；2.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南250100)

加米霉素為動(dòng)物專用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其制劑加米霉素注射液主要治療對(duì)加米霉素敏感的溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌引起的牛呼吸道疾病，治療對(duì)加米霉素敏感的胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸道疾病[1-2]。加米霉素抗菌譜廣[3]，抗菌活性強(qiáng)，藥代動(dòng)力學(xué)特征優(yōu)良[4-5]，臨床療效好[6-8]，毒副作用小[9-10]，與同類產(chǎn)品替米考星相比，安全性高，無(wú)耐藥性，對(duì)豬牛呼吸系統(tǒng)疾病的防治起到了關(guān)鍵作用，保障了食品安全[11-12]。在中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第16號(hào)等文獻(xiàn)中對(duì)加米霉素及其注射液均采用普通高效液相色譜方法[13-17]檢測(cè)，但檢測(cè)時(shí)間比較長(zhǎng)，所用流動(dòng)相量比較大，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了原料藥中加米霉素含量測(cè)定的超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(UPLC-PDA)研究。超高效液相色譜法大大縮短了檢測(cè)用時(shí)。另流動(dòng)相用量極大減少，減少試驗(yàn)耗材的用量，可極大減少對(duì)環(huán)境的污染，并降低廢液處理的成本。本試驗(yàn)建立的超高效液相色譜法具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，能有效控制加米霉素原料的質(zhì)量，可作為企業(yè)及相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 加米霉素對(duì)照品，含量98.5%，齊魯動(dòng)物保健品有限公司提供；乙腈為色譜純；氨水為分析純；超純水。加米霉素原料，來(lái)自齊魯動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀，美國(guó)waters 公司；配Waters 2695高效液相色譜儀，美國(guó)waters 公司，配二極管陣列檢測(cè)器。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 取本品精密稱定16 mg，加乙腈∶水(70∶30)溶解，并定容至20 mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱取加米霉素對(duì)照品16 mg(折含量后)，加乙腈：水(70∶30)溶解，并定容至10 mL，配制成1600 μg/mL儲(chǔ)備液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取儲(chǔ)備液適量，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液：每1 mL含加米霉素1200、800、400、200、80、40、20 μg/mL的溶液。

1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，氨水(0.1∶30)為流動(dòng)相B，以70∶30的比例進(jìn)行等度洗脫；二極管陣列檢測(cè)器，掃描范圍190～400 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃，流速為0.45 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取加米霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液，制成每1 mL含加米霉素400 μg的對(duì)照品溶液，重復(fù)配制6份，進(jìn)樣，計(jì)算其峰面積RSD。精密吸取上述對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積RSD。

1.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取本品精密稱定14.4 mg至20 mL容量瓶，加1600 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，加乙腈∶水(70∶30)溶解，并定容至20 mL。平行做六份上機(jī)測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算加米霉素的回收率和RSD。

1.3.7 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 對(duì)加米霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行UPLC的分析，并逐級(jí)降低其濃度，以溶液檢測(cè)時(shí)的信噪比S/N≥3作為檢測(cè)限、S/N≥10作為定量限。

1.3.8 不同色譜條件樣品檢測(cè)比較 分別使用高效液相色譜儀(參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第16號(hào)文[1], 流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，紫外檢測(cè)器)和超高效液相色譜儀(流速：0.45 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL，二極管陣列檢測(cè)器)在不同的色譜條件下運(yùn)行，對(duì)同一樣品中加米霉素的含量和出峰時(shí)間分別進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測(cè)得加米霉素色譜峰峰形良好，且均達(dá)到基線分離，在1.3.4項(xiàng)條件下，加米霉素對(duì)照品和加米霉素原料樣品，色譜保留時(shí)間約為4.2 min，分離度均滿足要求。

2.2 線性 在選定的色譜條件下，使用等度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，加米霉素在80～1600 μg/ mL的范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=272.2x+193.23，R2=0.9996。其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 加米霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of gamithromycin

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 在選定的色譜條件下，配制400 μg/mL加米霉素對(duì)照品溶液，重復(fù)配制6份，進(jìn)樣，測(cè)得加米霉素峰面積RSD為0.43%；取400 μg/mL加米霉素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得加米霉素峰面積RSD為0.26%，均滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 加米霉素的平均回收率為99.80%，RSD分別為0.32%(表1)。

2.5 檢測(cè)限和定量限 40 μg/mL加米霉素對(duì)照品溶液信噪比≥3為檢出限，80 μg/mL加米霉素對(duì)照品溶液信噪比≥10為定量限(圖2、圖3)。

表1 加米霉素添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 Experimental results of gamithromycin fortified recovery (n=6)

圖2 40 μg/mL加米霉素原料色譜圖UPLC 1 μLFig 2 40 μg/mLgamithromycin drug substance chromatogram UPLC 1 μL

圖3 80 μg/mL加米霉素原料色譜圖UPLC 1 μLFig.3 80 μg/mLgamithromycin drug substance chromatogram UPLC 1 μL

2.6 不同色譜條件樣品檢測(cè)結(jié)果的比較 不同色譜條件下的主成分理論塔板數(shù)、保留時(shí)間等參數(shù)的比較見(jiàn)表2。

表2 不同色譜條件下的主成分不同色譜參數(shù)的比較Tab 2 Comparison of principal components with different chromatographic parameters under different chromatographic conditions

由表2可見(jiàn)，使用waters 的CSH C18色譜柱理論塔板數(shù)非常高，性能是完全滿足要求的。光譜圖見(jiàn)圖4～圖5；色譜圖見(jiàn)圖6～圖9。保留時(shí)間約為4.2 min，滿足檢測(cè)需求。

圖4 加米霉素對(duì)照品UPLC光譜圖Fig 4 UPLC spectrogram of gamithromycin control

圖5 加米霉素對(duì)照品HPLC光譜圖Fig. 5 HPLC spectrogram of gamithromycin control

圖6 800 μg/mL加米霉素對(duì)照品UPLC色譜圖(1 μL)Fig 6 UPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin control (1 μL)

圖7 800 μg/mL加米霉素原料色譜圖UPLC (1 μL)Fig.7 UPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin drug substance (1 μL)

圖8 800 μg/mL加米霉素對(duì)照品HPLC 色譜圖(10 μL)Fig 8 HPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin control (10 μL)

使用waters超高效液相色譜儀(色譜條件見(jiàn)1.3.4項(xiàng))和高效液相色譜儀(色譜條件見(jiàn)1.3.7項(xiàng))，對(duì)同一樣品中加米霉素的含量(按無(wú)水物計(jì)算)分別進(jìn)行了比較(表3)，無(wú)顯著差異，相對(duì)偏差均小于1%，表明本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單可行，結(jié)果精確可靠。

圖9 800 μg/mL加米霉素原料HPLC色譜圖(10 μL)Fig.9 HPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin raw material (10 μL)

表3 不同色譜條件下加米霉素含量檢測(cè)結(jié)果表(n=4)Tab 3 Results of different chromatographic conditions for the content of gamithromycin (n=4)

由于兩種色譜方法均已通過(guò)其方法學(xué)驗(yàn)證，均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測(cè)效率上看，優(yōu)選超高效法(UPLC)。

3 討論與結(jié)論

3.1 UPLC方法波長(zhǎng)的選擇及定性鑒別 本研究將加米霉素的對(duì)照溶液利用PDA檢測(cè)器采集其光譜圖，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，加米霉素在198.2 nm左右有最大吸收，根據(jù)光譜圖可以判斷含有主成分，可以作為定性鑒別的手段；198.2 nm信號(hào)噪音較大，最終選擇同原農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告中208 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，35 ℃柱溫，保留時(shí)間約為4.2 min。

3.2 UPLC方法色譜柱耐用性實(shí)驗(yàn) 改變流速0.44、0.46 mL/min，柱溫35 ℃不變，保留時(shí)間上下浮動(dòng)0.3 min以內(nèi)。改變柱溫33、37、40 ℃，流速0.45 mL/min不變，保留時(shí)間上下浮動(dòng)0.3 min以內(nèi)，均能達(dá)到良好的分離度和精確的含量測(cè)定結(jié)果。色譜柱性能穩(wěn)定，適合本項(xiàng)目加米霉素含量的測(cè)定。

3.3 本方法與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13]的結(jié)果對(duì)比 本實(shí)驗(yàn)選擇了獸藥企業(yè)的加米霉素原料進(jìn)行含量測(cè)定，分別采用高效液相色譜方法和超高效液相色譜方法，原料中加米霉素含量相對(duì)偏差均小于1%。超高效液相流動(dòng)相的流速為0.45 mL/min，需要運(yùn)行10 min，每針運(yùn)行需要4.5 mL流動(dòng)相；高效液相色譜儀器流速為1.2 mL/min，運(yùn)行時(shí)間40 min，每針運(yùn)行需要48 mL流動(dòng)相。超高效液相色譜更節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材溶劑等，每運(yùn)行一針流動(dòng)相節(jié)省43.5 mL，并節(jié)約了30 min時(shí)間。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優(yōu)勢(shì)，更經(jīng)濟(jì)和快捷。

本實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相色譜法，對(duì)加米霉素原料中加米霉素進(jìn)行定性和定量測(cè)定，方法快速，可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法，具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，能有效控制加米霉素原料的質(zhì)量。