張?jiān)滦?天津市東麗區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科 （天津 300300）

內(nèi)容提要：目的：探討實(shí)時熒光定量PCR儀器對流感病毒檢測效果。方法：選擇2019年6月～2020年6月本中心采集的流感病毒咽拭子及血液樣本各116份，根據(jù)檢測方法將其分為三個不同的組別，分別用實(shí)時熒光定量PCR儀、普通PCR儀、酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測、最終采用病毒分離培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，使用實(shí)時熒光定量PCR儀檢測流感病毒的靈敏性和準(zhǔn)確度要比傳統(tǒng)血清學(xué)檢測的靈敏性和準(zhǔn)確度都高。結(jié)論：雖然流感病毒檢測中使用實(shí)時熒光定量PCR儀需要消耗高一些的成本，但使用此種方法可以節(jié)省檢測的人力，并縮短人員的檢測時間，可以根據(jù)PCR檢測的特點(diǎn)，將其使用于公共場所從業(yè)人員的流感病毒快速篩選工作中，從而幫助更多的人及時檢測病原，最終展開針對性的治療方案。

流感病毒其屬于一種RNA的病毒，呈現(xiàn)出絲狀或者球形的狀態(tài)[1]。流感病毒可以分為甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒。流感病毒主要是由凝血素以及神經(jīng)氨酸酶共同組成，該病毒具有一定的抗原性，極易發(fā)生變異[2]。甲型流感病毒則主要包含H以及N的變異，H有16個亞型，而N有9個亞型[3]。因此，甲型流感病毒也又分為很多不同的亞型疾病。為了顯著降低患有甲型流感病毒的發(fā)生率，需要建立一個快速準(zhǔn)確的檢測方法，從而為更多的甲型流感病毒患者提供有效的診斷以及治療，并實(shí)現(xiàn)全球流感疾病發(fā)生趨勢的預(yù)見性作用[4]?；诖耍疚倪x擇2019年6月～2020年6月本院采集的流感病毒咽拭子樣本及血液樣本各116例，根據(jù)檢測方法將其分為三個不同的組別，分別用實(shí)時熒光定量PCR儀、普通PCR儀、酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測、最終采用病毒分離培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證，主要研究實(shí)時熒光定量PCR儀在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用，以期為大家提供部分建議。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年6月～2020年6月本院采集的流感病毒咽拭子樣本及血液樣本各116例，根據(jù)檢測方法將其分為三個不同的組別，分別用實(shí)時熒光定量PCR儀、普通PCR儀、酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測、最終采用病毒分離培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證。參與實(shí)驗(yàn)的樣本均在24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢查。無法在24h內(nèi)進(jìn)行檢測的咽拭子樣本需保存在零下70°C的環(huán)境中，血液樣本保存需保存在零下20°C的環(huán)境中。

1.2 方法

使用生物安全柜、高速離心機(jī)、全自動實(shí)時熒光定量PCR儀器、PCR儀、電泳儀、酶標(biāo)儀、旋渦振蕩器、核酸提取儀、核酸提取試劑、無核酸離心管、培養(yǎng)液、流感病毒核酸檢測試劑盒。

A組實(shí)施熒光定量PCR法：根據(jù)核酸提取儀說明書以及擴(kuò)增試劑盒的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

使用流感病毒核酸檢測試劑盒，反應(yīng)體系主要由反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物探針組成，全部反應(yīng)體系配置情況，需以試劑盒的說明書為主。擴(kuò)增步驟為：第一步，50°C進(jìn)行30min→95°C進(jìn)行5min，此步驟完成一個循環(huán)；第二步，95°C的環(huán)境下進(jìn)行10s，然后在55°C環(huán)境下進(jìn)行40s，同時在55°C的環(huán)境下收集熒光。如此反復(fù)45個循環(huán)，最后進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，從而判定是否為流感病毒，且同時完成病毒分型。

B組實(shí)施RT-PCR方法：核酸提取使用同實(shí)時熒光定量PCR法相同的試劑和步驟，擴(kuò)增選用普通RT-PCR反應(yīng)試劑盒，使用普通PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增過程同樣為50°C進(jìn)行30min→95°C進(jìn)行5min，此步驟完成一個循環(huán)。然后95°C的環(huán)境下進(jìn)行10s，在55°C環(huán)境下進(jìn)行40s，此過程重復(fù)45個循環(huán)。然后收集擴(kuò)增產(chǎn)物，加染色劑進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行條帶分析。通過與對照條帶的比對進(jìn)行陰陽判斷，并同時完成分型。

C組實(shí)施使用酶標(biāo)儀進(jìn)行血清學(xué)檢測。將血液標(biāo)本進(jìn)行離心后取上清液，使用流感病毒抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)步驟遵照試劑盒使用說明書進(jìn)行，最后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

根據(jù)流行感冒診療方案，對流感病毒實(shí)施分離鑒定培養(yǎng)，并將10000u/mL雙抗置入樣本病毒內(nèi)，進(jìn)行采液，并對細(xì)胞病理變化進(jìn)行詳細(xì)的觀察，最終通過紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)對病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，當(dāng)實(shí)驗(yàn)滴度達(dá)到1:16的時候，或者超過這一比例的細(xì)胞培養(yǎng)液時，需要使用紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)對相關(guān)的亞型標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行鑒定。檢測人員需要在樣本中適當(dāng)添加雙抗接種細(xì)胞，并觀察細(xì)胞的變化。同時結(jié)合細(xì)胞病變以及細(xì)胞凝集的實(shí)際情況進(jìn)行判斷。若紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)符合細(xì)胞培養(yǎng)，可以采用亞型標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行流感病毒的分型。并以病毒培養(yǎng)的結(jié)果為最終依據(jù)，判斷以上三種方法的檢出率及準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本次臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0對其進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計以及分析，陽性檢出率使用計算型指標(biāo)以[n(%)]表示，并使用χ2值對其進(jìn)行檢驗(yàn)。P<0.05為兩組具有顯著性差異。

2.結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)研究的檢測結(jié)果顯示，使用實(shí)時熒光定量PCR儀檢測出樣本的陽性數(shù)量為57，陽性檢出率為97.28%。實(shí)時熒光定量PCR與普通RT-PCR方法檢測的結(jié)果一致，可以互為驗(yàn)證，但是使用熒光定量PCR儀更省時，操作也更簡單，同時因?yàn)槭窃诜忾]的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增同時完成檢測和數(shù)據(jù)分析，大大減少了擴(kuò)增產(chǎn)物泄露污染實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行的血清學(xué)檢測方法陽性檢測數(shù)量為50，陽性檢出率為86.21%，其中，通過與病毒分離培養(yǎng)結(jié)果的比對驗(yàn)證，有2例標(biāo)本排除了流感病毒陽性，為假陽性結(jié)果?？梢姡鍖W(xué)的方法雖然快速、方便、操作簡單，但是干擾因素比較多，容易出現(xiàn)假陽性和漏檢的情況。使用統(tǒng)計學(xué)計算顯示，χ2=5.9024，P<0.05。由此可見，PCR檢測方法的陽性檢出率和準(zhǔn)確性要比血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的陽性檢出率和準(zhǔn)確性都高。使用熒光定量PCR儀檢測因?yàn)椴僮骱唵?、快速、?zhǔn)確、安全等一系列優(yōu)點(diǎn)，可以作為流感檢測的首選方案。

3.討論

3.1 流感病毒分析

流感病毒可以通過患者的飛沫、人與人之間的接觸或者和被污染的物品接觸進(jìn)行傳播[5]。流感患者的臨床表現(xiàn)為寒戰(zhàn)、肌肉酸痛、干咳等，且每年流感的發(fā)生率較高，甚至嚴(yán)重時會發(fā)生死亡，對于嬰幼兒以及老年人群的身體產(chǎn)生嚴(yán)重危害。

3.2 實(shí)時定量PCR分析

實(shí)時定量PCR分析在對病毒的檢測、病毒感染的預(yù)防、診斷和治療以及病毒疫苗的質(zhì)量控制等方面都有重要作用。實(shí)時定量PCR是實(shí)驗(yàn)室病毒檢測中最常用的方法。該方法具有靈敏度高、檢測速度快、污染小等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時定量PCR技術(shù)是一種基于常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的高靈敏度定量PCR技術(shù)。較傳統(tǒng)PCR方法，提高了反應(yīng)的特異性和自動化程度，有效地解決了PCR污染問題，實(shí)現(xiàn)了檢測質(zhì)量的飛躍。在醫(yī)學(xué)診斷和環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是分子生物學(xué)中常用的實(shí)驗(yàn)方法。它在病原體檢測和疾病診斷等方面有著廣泛的應(yīng)用?；趥鹘y(tǒng)PCR技術(shù)在基因數(shù)量上的不足，1996年提出了實(shí)時熒光定量PCR（RQ-PCR）。這一技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了由定性PCR向定量PCR的飛躍，而且其簡單性、特異性和敏感性，以及高通量的潛力和新科學(xué)的不斷引入，使得實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)成為檢測基因水平的基準(zhǔn)技術(shù)[3]。

實(shí)時熒光定量技術(shù)基礎(chǔ)在于：實(shí)時定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，基本原理相同，主要區(qū)別是其定量體系。將熒光染料或熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，使之具有特定波長。利用熒光信號，可對整個聚合酶反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時自動檢測和監(jiān)測。測量到的信號將被用來作為聚合酶鏈反應(yīng)周期熒光閾值的坐標(biāo)。

3.3 實(shí)時定量PCR分析的定量方法

實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)是一種可以進(jìn)行定量檢測的基因擴(kuò)增的PCR技術(shù)，此種檢測技術(shù)的主要原理是在PCR系統(tǒng)中，添加一些熒光染料或者熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，通過物質(zhì)和PCR相結(jié)合產(chǎn)生特定的物質(zhì)，且此種物質(zhì)在紫外線的刺激之下，可以發(fā)生特定的熒光。熒光標(biāo)記的探針匯總主要包括水解探針和雜交探針[6]。

而實(shí)時熒光定量PCR的定量方法中主要包括：（1）絕對的定量措施，通過構(gòu)建合理的基因序列標(biāo)準(zhǔn)，并對其進(jìn)行一系列的定量檢測工作，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行合理的稀釋工作之后，可以獲得多個不同稀釋之后的Ct數(shù)值。（2）相對定量：其主要是檢測人員不需要做一些額外的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其具有簡便、省時等優(yōu)勢。

3.4 實(shí)時熒光定量技術(shù)在病原DNA檢測中的應(yīng)用

實(shí)時PCR檢測病原DNA，不僅能確定病原DNA的性質(zhì)，還能定量檢測病原DNA含量，為臨床診斷提供有力的依據(jù)。當(dāng)前，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已應(yīng)用于乙型肝炎病毒DNA、豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、EB病毒等多種病原體的檢測。

流感病毒是粘性病毒陽性家族的代表。這就是所謂的流感病毒屬于單負(fù)鏈RNA病毒，易導(dǎo)致上呼吸道感染。流感病毒可感染許多動物，也是人類主要的病原菌。流感病毒按照其H、N抗原可分為若干亞型。流行性感冒的臨床癥狀很容易與普通感冒混淆。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法費(fèi)時費(fèi)力、技術(shù)要求高，不能及時診斷。常用的診斷方法有：血清學(xué)診斷、病毒分離及特異性抗體檢測。但是，當(dāng)新型流感病毒引發(fā)流感流行時，由于無法在短時間內(nèi)得到病毒株的抗體，因而無法實(shí)現(xiàn)血清學(xué)檢測。所以，開展病毒核酸檢測技術(shù)的研究，對早期診斷病原體有重要意義[7,8]。

即時多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是利用核酸高度擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)和探針技術(shù)的高度特異性而實(shí)現(xiàn)的飛躍（實(shí)時定量的聚合酶鏈反應(yīng)）。該方法克服了常規(guī)PCR法檢測流感病毒易被污染、假陽性率高的缺點(diǎn)，且具有較高的特異性、靈敏度和操作自動化等優(yōu)點(diǎn)，可用于流感病毒的快速檢測。該方法操作簡便，不需特殊儀器，20min內(nèi)可迅速得到檢測結(jié)果，操作人員培訓(xùn)易于掌握。為快速篩查提供了有效手段。但是它的陽性率很低，容易產(chǎn)生假陰性。利用熒光PCR技術(shù)實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中各循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號，可實(shí)現(xiàn)對初始模板的定量和定性分析。一種熒光化學(xué)物質(zhì)被引入到實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)中[9-11]。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物隨著聚合酶鏈反應(yīng)的不斷積累，熒光信號強(qiáng)度呈等比例增加。PCR產(chǎn)物可通過實(shí)時動態(tài)監(jiān)測來定性、定量地監(jiān)測。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。流感病毒檢測可以在3～4h內(nèi)完成，可以實(shí)現(xiàn)封閉式PCR檢測，克服了普通PCR易污染的缺點(diǎn)。試驗(yàn)中，兩種用于探針標(biāo)記的熒光素FAM的發(fā)射波長相距較遠(yuǎn)，以避免由于接近熒光波長所引起的相互干擾，保證了實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏度。在全球流感疫情日趨嚴(yán)重的情況下，口岸傳染病檢測的要求也越來越高。該方法能快速有效地檢測出流感病毒[12,13]。

甲型流感病毒通用型引物探針，對于其他非甲型流感病毒不存在任何交叉檢驗(yàn)反應(yīng)。使用逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系中最低的可檢測數(shù)量為100copies。逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測甲型流感病毒的特異性以及敏感性都比較好。因此，將實(shí)時熒光定量PCR應(yīng)用于流感病毒核酸檢測中，具有較高的檢測意義。結(jié)果顯示，PCR陽性檢出率（97.28%）高于血清學(xué)實(shí)驗(yàn)組的陽性檢出率（86.21%），且P<0.05。

綜上所述，使用RT-PCR，尤其是實(shí)時熒光定量PCR檢測流感病毒具有較高的應(yīng)用價值。