大豆水解蛋白中苦味肽的研究進(jìn)展

◎ 黃 磊，周其洋

（佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528500）

近年來，隨著人們對(duì)健康的追求，天然活性呈味物質(zhì)的重要性越來越高，植物蛋白質(zhì)資源的開發(fā)受到的關(guān)注也日益加強(qiáng)。隨著生物、分析技術(shù)的進(jìn)步，以大豆肽為代表的植物肽的活性功能和呈味效果也逐漸明確，具有調(diào)節(jié)免疫、控制“三高”、調(diào)節(jié)腸道微生物和抗疲勞等生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品中，但大豆肽的苦澀味、豆腥味限制了其進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用場(chǎng)景[1]。大豆水解蛋白中的苦味物質(zhì)主要是小分子多肽，其分子量集中在500～4 000 Da，疏水性氨基酸在其中起到重要作用。本文綜述了大豆多肽的生產(chǎn)技術(shù)及苦味多肽的研究進(jìn)展，希望為其進(jìn)一步商業(yè)化應(yīng)用提供借鑒和參考。

1 大豆肽的制備工藝

1.1 酶解法

酶解法以其制備條件溫和、產(chǎn)物功能多樣及水解后產(chǎn)品穩(wěn)定性較好具備了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的能力，被廣泛使用。最適用于大豆肽的生產(chǎn)加工酶制劑主要有植物蛋白酶中的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，以及微生物蛋白酶中的酸性、中性、堿性、風(fēng)味蛋白酶，還有特異性較強(qiáng)、主要用作醫(yī)藥保健的胃蛋白酶、胰蛋白酶等。其中來源于微生物的蛋白酶因成本低、反應(yīng)條件廣等更受青睞。

吳文煜等[2]利用外肽酶（三肽酶）和堿性蛋白酶復(fù)配制備具有功能的大豆肽，其苦味值相較于單獨(dú)使用堿性蛋白酶降低7.3%。劉公博等[3]發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶在50 ℃以5%原料比作用4 h 可獲得無明顯苦味的大豆肽。此外，谷宇等[4]用胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶復(fù)配，在50 ℃酶解4.5 h，獲得大豆肽的苦味只有單酶水解的22%～28%。

1.2 發(fā)酵法

有別于酶解法，微生物發(fā)酵法更好地利用了微生物的代謝過程，將一種或多種微生物的代謝活動(dòng)和大豆多肽的分解過程有機(jī)結(jié)合，互相促進(jìn)。目前研究較多的有地衣芽孢桿菌2709、枯草芽孢桿菌1389、黑曲霉3.350 等。

早在2008年就有用黑曲霉AS3.350 固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵制備大豆肽的報(bào)道，肽含量達(dá)到62.35%，且無苦味。有公司用地衣芽孢桿菌和泡盛曲霉兩步發(fā)酵獲得植物蛋白多肽，或用枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵豆粕獲得無苦味的大豆多肽。發(fā)酵法相較于酶解法成本下降40%～60%，具有良好的商業(yè)應(yīng)用前景。樂能生物工程股份有限公司于2006年就建立了年產(chǎn)1 000 t 的發(fā)酵法生產(chǎn)大豆活性肽的生產(chǎn)線，其肽轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%。

1.3 化學(xué)法/物理法

化學(xué)法是利用酸或堿水解大豆蛋白，生產(chǎn)成本低，但反應(yīng)條件一般較為苛刻，水解不具有針對(duì)性，氨基酸易被破壞，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此多見于實(shí)驗(yàn)室研究，少見于工業(yè)應(yīng)用。物理法主要和酶解法復(fù)配使用，利用物理?xiàng)l件改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從而優(yōu)化酶解結(jié)果。采用靜高壓技術(shù)，在200 MPa 下用酶解法處理大豆蛋白，可利用高壓改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)，從而獲得具有較高活性的大豆肽。

2 大豆肽苦味形成機(jī)理及評(píng)價(jià)方法

2.1 多肽苦味形成機(jī)理

大豆肽中的苦味主要來自于苦味肽，疏水氨基酸是其中的主要因素。分子量在500～4 000 u 的大豆肽苦味最明顯，隨著分子量降低，苦味隨之降低。當(dāng)分子量較大時(shí)，疏水氨基酸被包埋在內(nèi)部而無法表現(xiàn)出苦味，只有分子量在適當(dāng)范圍時(shí)，疏水氨基酸才能更大比例地刺激味蕾產(chǎn)生苦味。有學(xué)者用生物信息學(xué)分析方法對(duì)已明確口感的苦味肽的分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其疏水值越大，苦味越強(qiáng)。此外，氨基酸序列和組成也會(huì)影響苦味的強(qiáng)度。

2.2 苦味評(píng)價(jià)方法

食品中的苦味強(qiáng)度檢測(cè)大多由感官評(píng)價(jià)或明確苦味組分的定量檢測(cè)來判斷。由于大豆肽苦味來源的復(fù)雜性，且苦味組分尚未明確，因此往往采取感官評(píng)價(jià)結(jié)合儀器分析來進(jìn)行。生物評(píng)價(jià)法、動(dòng)物評(píng)價(jià)法因?qū)嶒?yàn)難度大，檢測(cè)費(fèi)用高目前以實(shí)驗(yàn)室研究為主。

通過電子舌分析和感官評(píng)價(jià)分析相關(guān)性，在大豆蛋白水解物中完成苦味、鮮味、咸味和豐富度的綜合影響的苦味口感回歸曲線為近年來的研究熱點(diǎn)，R2可以達(dá)到0.93～0.97，擬合度較好，且普遍報(bào)道敏銳度相較于感官更高[5]。ITO 等[6]綜合甜味標(biāo)準(zhǔn)品和苦味標(biāo)準(zhǔn)品的評(píng)價(jià)結(jié)果提出了苦味預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)人工甜味劑對(duì)鹽酸奎寧有較好的掩蔽作用，預(yù)測(cè)模型與感官呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。在復(fù)雜體系中，無法用電子舌對(duì)苦味的單一響應(yīng)來代表感官評(píng)價(jià)中的苦味，需綜合鮮味、咸味、酸味和豐富度等其他維度來綜合評(píng)估。鈴木由佳等[7]研究發(fā)現(xiàn)，清酒中感官苦味與ANS 的熒光強(qiáng)度（F1）存在極高的相關(guān)性，可通過ANS 熒光法測(cè)定清酒苦味度。

3 大豆肽脫苦方法

肽常用的脫苦方法可分為生物法、掩蓋法、分離法3 種。生物法更多見于食品研究，分為兩種，一種為酶法，一種為微生物法。掩蓋法則可分為風(fēng)味掩蓋和包埋法。

3.1 生物法

酶法的脫苦原理是通過氨肽酶和羧肽酶切斷多肽鏈末端的部分疏水性氨基酸殘基，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)脫苦的目的。此法在生產(chǎn)中可與酶法做兩步生產(chǎn)，無需額外投入而被廣泛應(yīng)用。該方案的缺點(diǎn)是脫苦的同時(shí)產(chǎn)生游離氨基酸。

LIU 等[8]研究紅曲霉羧肽酶（MpiCP-1）和胃蛋白酶對(duì)大豆蛋白分解的影響，明確了紅曲霉羧肽酶通過在C 端釋放疏水性氨基酸來減弱胃蛋白酶水解大豆多肽的苦味。此外，用氨肽酶處理大豆蛋白水解產(chǎn)物或用氨肽酶和堿性蛋白酶復(fù)配酶解，纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸等疏水性氨基酸會(huì)被釋放，酶解液苦味會(huì)明顯降低。

微生物法原理和酶法一致，采用可以產(chǎn)生肽酶的微生物參與發(fā)酵，從而實(shí)現(xiàn)脫苦。微生物脫苦常與微生物發(fā)酵制備多肽同步使用。李萍等[9]使用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的粗蛋白酶酶液對(duì)大豆水解物進(jìn)行脫苦，在34 ℃作用2.1 h 可以將苦味下降75%左右，但該反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行。此外，還有將乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵，利用雅致放射毛霉羧肽酶，使小麥肽或大豆肽苦味消失的報(bào)道[10-11]。

3.2 掩蓋法

掩蓋法相較于生物法，不會(huì)改變大豆肽的結(jié)構(gòu)和組成，由于其在功能性的保留方面具有優(yōu)勢(shì)，而被對(duì)大豆肽功能關(guān)注度較高的行業(yè)所應(yīng)用，如保健品行業(yè)。

風(fēng)味掩蓋指利用味道的協(xié)同拮抗效應(yīng)來減少苦味感受，該方案多見于多肽口服液等保健食品的開發(fā)。如用蛋白糖、檸檬酸和大豆肽復(fù)配可提供豐富的口感從而掩蓋大豆肽氨基酸口服液的苦味。再如中糧集團(tuán)用甜味劑、果膠、果粉和香精等制備了一種多肽含量為60%以上，苦味、豆腥味得以有效遮蔽的固體飲料。

包埋法利用環(huán)狀糊精等絡(luò)合苦味肽的疏水氨基酸殘基達(dá)到脫苦的效果，但因用量較大，達(dá)到了25%～43%，應(yīng)用范圍受限。戰(zhàn)旭梅等[12]用β-環(huán)糊精包埋技術(shù)消除玉米活性肽的苦味，確定其加工條件為β-環(huán)糊精∶玉米活性肽為1.0∶1.3，在溫度35 ℃中性條件下處理44 min，包埋率為80.12%，苦味值下降到1.70，口感改善效果明顯，且對(duì)功能肽的損失較小。

3.3 分離法

分離法通過苦味肽和其他組分理化性質(zhì)的不同，采用超濾、吸附、萃取和色譜分離等方式對(duì)肽進(jìn)行選擇性分離，去除苦味組分。該方法損失較多，可能造成某些功能成分片段喪失，且部分方法如色譜分離成本較高，少見于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

4 結(jié)語

近年來，關(guān)于大豆肽的苦味及其形成機(jī)理、評(píng)價(jià)方法均取得了一定的進(jìn)展。目前，大豆肽工業(yè)化發(fā)展還需解決一些問題。大豆肽苦味的評(píng)價(jià)尚未建立一種明確且具有公信力的方法，對(duì)感官的依賴性較大。對(duì)于苦味肽的鑒定和結(jié)構(gòu)解析仍處在初級(jí)階段，疏水性對(duì)苦味的影響、疏水性氨基酸排列和空間結(jié)構(gòu)對(duì)苦味的影響、苦味肽與其他呈味肽的協(xié)同作用尚未清晰。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，評(píng)價(jià)和分析手段的增多，苦味肽消除會(huì)越來越具有針對(duì)性，進(jìn)而促進(jìn)大豆肽在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。