于金超 張?zhí)煊?/p>

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

瘢痕組織是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中自然形成的產(chǎn)物，理想的愈合應(yīng)產(chǎn)生不太明顯的瘢痕。增生性瘢痕(hypertrophic scars，HTSs)是皮膚愈合過程中產(chǎn)生的病理狀態(tài)，其機(jī)制不甚明確，但在創(chuàng)傷愈合過程中炎癥期、增殖期和重塑期的任何一個(gè)階段產(chǎn)生調(diào)節(jié)異常，均可導(dǎo)致HTSs的發(fā)生。HTSs的病理特征表現(xiàn)為表皮層和真皮層增厚、角質(zhì)細(xì)胞增生、大量成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞、血管增生、膠原組織含量和排列異常等[1]。全球每年有數(shù)百萬以上的人因各種原因而形成瘢痕[2]，嚴(yán)重?zé)齻?0%~90%患者會(huì)發(fā)展為HTSs[3]。大約70%的患者HTSs發(fā)生在關(guān)節(jié)附近或身體其他皮膚緊致部位，在受傷后6~12個(gè)月真皮發(fā)生纖維化，形成隆起、僵硬、發(fā)癢的瘢痕，產(chǎn)生瘢痕攣縮，嚴(yán)重影響美觀，并導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。HTSs形成過程中主要表現(xiàn)為皮膚過度纖維化增生，伴有過度的成纖維細(xì)胞增殖和異常膠原蛋白沉積。多種方法應(yīng)用于HTSs的治療，包括傳統(tǒng)的壓迫治療、局部或全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物局部注射、激光治療、手術(shù)切除、自體脂肪移植和放射治療等[2]。但迄今為止，尚未形成一個(gè)HTSs治療的金標(biāo)準(zhǔn)。自體脂肪移植由于移植物獲取簡易，且可進(jìn)行注射移植，在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域中引起了學(xué)者的關(guān)注和重視。自體脂肪移植和脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)逐步應(yīng)用于病理性瘢痕的治療。臨床研究和基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADSC可在HTSs的治療中發(fā)揮作用[4-5]，可以有效修復(fù)面部及身體的功能和美觀。但自體脂肪移植后改善瘢痕的基本機(jī)制尚未明確，由于脂肪注射量與瘢痕相比較小，注射后局部容積的變化并不能很好地解釋自體脂肪移植的抗瘢痕作用。因此，目前推測ADSC多向分化能力、自身分泌的可溶性因子、與瘢痕組織細(xì)胞之間的相互作用等，可能與其抗瘢痕作用有關(guān)。本文就自體脂肪移植治療HTSs的作用機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 ADSC的生物學(xué)特性

皮下脂肪組織主要由成熟的脂肪細(xì)胞和血管基質(zhì)組分(stromal vascular fraction，SVF)組成，后者包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和ADSC等，SVF中64% 為ADSC[6]。自Zuk等[7]于2001年首次在抽脂手術(shù)后的脂肪組織中分離出ADSC后，ADSC在多個(gè)不同領(lǐng)域展現(xiàn)了其臨床應(yīng)用潛力。ADSC來源廣泛，取材較易，具有自我更新、穩(wěn)定生長、組織修復(fù)和多向分化潛能等。成體干細(xì)胞缺乏特異性和通用的分子標(biāo)記，必須使用多種分化的功能測定法來鑒定干細(xì)胞。用于標(biāo)記ADSC的蛋白包括黏附分子、受體分子、表面酶、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、糖蛋白和組織相容性抗原等[8-9]，但不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記物，例如CD14、CD31、CD34和CD45[9]。ADSC具有可分化成中胚層、內(nèi)胚層和外胚層3個(gè)胚層的能力，包括脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等[8]，與骨髓干細(xì)胞相比，其軟骨分化能力弱。ADSC的克隆率高于骨髓干細(xì)胞，兩者之間具有相似的抑制T細(xì)胞增殖的能力。

2 ADSC的旁分泌作用

在特定的微環(huán)境中，ADSC可分泌大量特定生長因子、細(xì)胞因子或其他旁分泌因子等，促進(jìn)傷口愈合。有研究[10]表明機(jī)械損傷可促進(jìn)脂肪組織分泌成纖維細(xì)胞生長因子-2 (f ibroblast growth factor-2， FGF-2)、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)、表 皮 細(xì) 胞 生 長 因 子(epidemal growth factor，EGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等，而通過脂肪抽吸術(shù)獲取的脂肪移植物本身就是一種嚴(yán)重的損傷過程，其移植至修復(fù)部位后將啟動(dòng)傷口愈合的級(jí)聯(lián)過程，ADSC及其分泌物在這一過程中起到了重要作用。FGF-2可上調(diào)HTSs成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)和HGF的表達(dá)[11]，而阻斷FGF-2后可增加纖維化程度[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)FGF-2可減輕瘢痕的形成[11]。PDGF與HTSs中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化高度相關(guān)[13]。HGF可通過依賴JNK途徑在抑制纖維化過程中發(fā)揮重要作用，阻斷HGF后可增加纖維化程度[12]。HGF也可有效抑制纖維化相關(guān)因子，調(diào)節(jié)HTSs中 ECM重塑[14]。

白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是ADSC旁分泌的主要抗炎因子之一，與TGF-β和其他炎癥因子相比，IL-10可抑制纖維化[15]，發(fā)揮其抗瘢痕作用[16]，但其抗瘢痕的機(jī)制不甚明確，可能與降低炎癥反應(yīng)、減少ECM形成和調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)化和凋亡等有關(guān)。IL-10也可能會(huì)下調(diào)IL-6和IL-8的表達(dá)，發(fā)揮其抗瘢痕形成作用[5]。也有研究[1,17]指出，IL-10的抗瘢痕作用可能與PI3K/AKT和STAT3信號(hào)通路或STAT3和AKT-mTOR信號(hào)通路之間相互影響有關(guān)。此外，IL-10可顯著下調(diào)Ⅰ型、Ⅲ型膠原和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，并上調(diào)MMP-1和MMP-8的表達(dá)[15]。

3 ADSC和TGF-β/ Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

TGF-β是一種多功能生長因子，包括TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3 3種亞型，與TGF-β Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合后[18]，誘導(dǎo)下游靶點(diǎn)Smad的激活，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在結(jié)締組織重塑和ECM基因表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械應(yīng)力的作用下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，mRNA和蛋白質(zhì)水平均高表達(dá)TGF-β1、TGF-β2和膠原[19]。HTSs中的成纖維細(xì)胞高表達(dá)α-SMA，并可持續(xù)自分泌TGF-β1。TGF-β1也可促進(jìn)α-SMA的表達(dá)[20]，α-SMA蛋白的表達(dá)與肌成纖維細(xì)胞的收縮密切相關(guān)。TGF-β1可刺激組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)的合成，進(jìn)而抑制MMP介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrices，ECM)的降解[18]。與TGF-β1在損傷后數(shù)分鐘即可由血小板釋放相比，TGF-β2和TGF-β3在損傷發(fā)生后24 h內(nèi)緩慢升高[18]。另外，TGF-β1主要在成人組織中表達(dá)，而胎兒組織中主要表達(dá)TGF-β3，TGF-β3可能與胎兒無瘢痕愈合相關(guān)。ADSC可顯著抑制TGF-β1和α-SMA的表達(dá)[5]，導(dǎo)致TGF-β/Smad信號(hào)通路中下游Smad2和Smad3磷酸化減少[5]，其磷酸化的減少在一定程度上阻斷了TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，改善了瘢痕的形成。Zhang等[16]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在瘢痕模型病灶內(nèi)注射ADSC后，可降低α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)，并可以改善膠原蛋白沉積和排列，減少HTSs的形成。另有動(dòng)物研究[21]發(fā)現(xiàn)，在ADSC注射到瘢痕組織后的早期會(huì)出現(xiàn)TGF-β3和MMP1的上調(diào)，晚期出現(xiàn)α-SMA和TIMP的減少。ADSC調(diào)節(jié)TGF-β1、TGF-β3以及相關(guān)信號(hào)通路中細(xì)胞因子的變化提示ADSC可能通過TGF-β/ Smad信號(hào)通路發(fā)揮其抗瘢痕作用。

4 ADSC和p38/MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

p38/MAPK是一個(gè)經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，是細(xì)胞外信號(hào)傳送到細(xì)胞內(nèi)的一類重要信號(hào)通路，通過線粒體死亡途徑、細(xì)胞分化或血管緊張素Ⅱ的激活等影響HTSs的形成[22]。有研究表明ADSC-CM降低了Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-SMA的表達(dá)以及影響膠原蛋白的排列。ADSCCM處理的HTSs成纖維細(xì)胞中p-p38蛋白水平呈現(xiàn)濃度依賴性下調(diào)。加入p-p38抑制劑后可出現(xiàn)Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原和α-SMA表達(dá)的下降，p38的加入則出現(xiàn)相反的結(jié)果[22]。p38/MAPK信號(hào)通路可能是ADSC抗瘢痕的潛在機(jī)制之一。

5 ADSC的免疫調(diào)節(jié)作用

過度的炎癥反應(yīng)是HTSs形成的一個(gè)重要因素。受傷即時(shí)血小板、激活的補(bǔ)體和凝血因子等形成纖維蛋白凝集塊，刺激炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等)募集，后者進(jìn)一步產(chǎn)生促炎介質(zhì)，包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α、MCP-1、調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的活化因子、IL-1β和IL-6等。之后ECM的形成和重塑同樣有多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中，如前所述，TIMP和MMPs在ECM的降解中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)[21,23]報(bào)道ADSC在傷口愈合過程中具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。除了前面所提到的一些生長因子和抗炎因子外，ADSC也可自分泌前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)，PGE2可調(diào)控T細(xì)胞的增殖和分化[23]，抑制其免疫反應(yīng)。與T細(xì)胞同時(shí)大量存在于活躍期瘢痕組織的肥大細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞在脂肪注射后其數(shù)量明顯減少[21]。巨噬細(xì)胞在受傷早期即募集到傷口周圍，清理損傷細(xì)胞和異物等。在炎癥反應(yīng)過程中巨噬細(xì)胞可進(jìn)行M1型和M2型的轉(zhuǎn)換，ADSC可促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)換為M2型[24]。M1型高表達(dá)促炎性細(xì)胞因子，并可促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)揮功能；而M2型低表達(dá)促炎細(xì)胞因子和高表達(dá)抗炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)Th2細(xì)胞發(fā)揮功能。如M1型巨噬細(xì)胞存在時(shí)間較長則將不利于傷口的愈合，M1型轉(zhuǎn)換為M2型后有利于傷口愈合[23]。PGE2作用于T細(xì)胞后可促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞的轉(zhuǎn)換[25]，與巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)型相互發(fā)揮協(xié)同作用，免疫細(xì)胞在炎癥后期的轉(zhuǎn)型對瘢痕增生和重塑起到了至關(guān)重要的作用。因此ADSC通過分泌抗炎因子、抑制炎癥介質(zhì)分泌、促進(jìn)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)型和減少免疫細(xì)胞的數(shù)量等聯(lián)合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

6 ADSC的抗氧化作用

組織受到損傷后，局部的低氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，ROS對TGF-β1/Smad通路的激活和下游因子的調(diào)控有著積極的促進(jìn)作用。Kim等[26]通過體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了ADSC對皮膚纖維化的抗氧化作用，通過減少細(xì)胞凋亡來保護(hù)其免受氧化損傷。ADSC條件培養(yǎng)基中含有許多已知的抗氧化因子，包括胰島素樣生長因子、胎盤生長因子、PDGF，VEGF、FGF、HGF、IL-6、IL-8和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等。同時(shí)ADSC條件培養(yǎng)基可增強(qiáng)成纖維細(xì)胞中SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx)的 活 性。SOD和GPx是細(xì)胞內(nèi)抗氧化的重要分子。ADSC-CM也可有效清除過氧化氫并抑制脂質(zhì)過氧化，并可影響成纖維細(xì)胞中MMPs和TIMP的表達(dá)[27]。ADSC在局部微環(huán)境的影響下可通過其抗氧化作用影響瘢痕的纖維化和重塑過程。

7 自體脂肪移植在瘢痕中的應(yīng)用

1893年Gustav Neuber首次將手臂脂肪組織移植到眼眶以糾正骨髓炎后的瘢痕后遺癥。1974年Fisher提出了脂肪抽吸技術(shù)，隨后1985年Klein提出了腫脹液的應(yīng)用更加促進(jìn)了脂肪抽吸技術(shù)的發(fā)展。黃振等[28]前瞻性研究報(bào)道二氧化碳點(diǎn)陣激光聯(lián)合自體脂肪注射治療HTSs的有效率明顯高于單純激光治療，可明顯減輕疼痛、瘙癢癥狀，改善瘢痕外形美觀情況。王斐等[29]報(bào)道的80例瘢痕患者中乳糜脂肪移植組的術(shù)后溫哥華瘢痕量表(Vancouver scar scale，VSS)評(píng)分與術(shù)前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而生理鹽水注射組的術(shù)后VSS評(píng)分與術(shù)前相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此指出乳糜脂肪移植對HTSs有良好的治療效果，其作用可能與ADSC、ECM、脂肪前體細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子等有關(guān)[29]。另一篇隨機(jī)對照試驗(yàn)(randomized controlled trial，RCT)研究發(fā)現(xiàn)，自體脂肪移植術(shù)后，醫(yī)師客觀評(píng)估和患者自我評(píng)估均顯示出瘢痕狀況得到改善，但與生理鹽水對照組相比，瘢痕的硬度、彈性、顏色評(píng)分和血管走形，膠原的重塑，慢性炎癥等組織學(xué)指標(biāo)均無明顯差異[30]。但同時(shí)這篇文獻(xiàn)也指出了自身存在的可能缺陷，包括入組數(shù)量較少(僅有17例)、單次自體脂肪移植、無其他治療，以及年齡、病因和部位等因素的不確定性等。多數(shù)文獻(xiàn)[4,28-29]報(bào)道自體脂肪移植治療為3次，但對治療次數(shù)和治療間隔時(shí)間目前并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。亟須多中心、大樣本的RCT研究對自體脂肪移植治療HTSs進(jìn)行分析對比。 Sataloff 等[31]首次報(bào)道了4例自體脂肪移植治療因聲帶瘢痕而引起言語障礙的患者，術(shù)后隨訪10個(gè)月~3年，嗓音質(zhì)量得到改善。Neuenschwander 等[32]報(bào)道了8例因嚴(yán)重瘢痕和發(fā)音困難而進(jìn)行脂肪移植的患者，平均隨訪時(shí)間為23個(gè)月，聲門關(guān)閉、黏膜波、僵硬程度和嗓音嘶啞評(píng)估(GRBAS)評(píng)分均有顯著改善。Cantarella等[33]報(bào)道了7例Nano 脂肪注射治療廣泛聲帶瘢痕引起的嚴(yán)重發(fā)音障礙患者，術(shù)后所有患者的嗓音質(zhì)量和吞咽功能均得到改善。Kim等[34]將人ADSC注射到兔聲帶損傷瘢痕動(dòng)物模型，評(píng)估其高速攝影、聲學(xué)功能性指標(biāo)、蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)指標(biāo)，與未進(jìn)行ADSC注射組相比，ADSC改善了聲帶ECM和過度沉積的I型膠原。胡蓉等[35]研究ADSC移植到損傷聲帶后的分布及對聲帶固有層及ECM變化的影響，發(fā)現(xiàn)單純聲帶損傷3個(gè)月后局部出現(xiàn)瘢痕攣縮，大量纖維組織增生，持續(xù)至12個(gè)月；ADSC植入損傷聲帶后，形態(tài)6個(gè)月時(shí)接近正常，部分組織學(xué)結(jié)構(gòu)在12個(gè)月時(shí)類似聲帶。ADSC可以促進(jìn)ECM分泌并合理有序地分布和排列在聲帶固有層內(nèi)。聲帶脂肪注射是治療嚴(yán)重和(或)廣泛的聲帶瘢痕一種有效和實(shí)用的方法。

綜上所述，自體脂肪移植后改善瘢痕的作用機(jī)制可能是多種分子機(jī)制共同介導(dǎo)的。目前的研究多集中于ADSC通過旁分泌因子、多種不同信號(hào)通路相互影響作用于瘢痕組織成纖維細(xì)胞和ECM，對ADSC的多向分化潛能研究較少，間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合的局部會(huì)分化成真皮細(xì)胞，但其在瘢痕組織微環(huán)境中是否會(huì)發(fā)生相似的變化目前不甚明了。ADSC對早期和晚期HTSs的抗纖維化作用機(jī)制是否不同，需要進(jìn)一步深入的研究，在可靠的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在HTSs發(fā)生時(shí)進(jìn)行干預(yù)阻斷其發(fā)生、發(fā)展過程，可較高水平提高患者的生活質(zhì)量。自體脂肪移植物中抗纖維化的旁分泌因子(如TGF-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、HGF、bFGF等)可能是藥物治療HTSs的潛在靶點(diǎn)。