中藥逆轉(zhuǎn)消化道腫瘤耐藥微環(huán)境的機(jī)制研究進(jìn)展

孟丹 仇奕文 湯紫怡 朱瑩杰

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和社會(huì)發(fā)展的重大疾病之一。消化道腫瘤是常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要治療手段以化療、靶向治療為主。近幾年免疫治療的興起給腫瘤的治療帶來(lái)了希望，然而這些藥物在治療腫瘤的同時(shí)亦會(huì)造成腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥，導(dǎo)致治療失敗。當(dāng)然除了藥物本身外，腫瘤所處的環(huán)境也是引起腫瘤耐藥的原因。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞的生存場(chǎng)所，腫瘤微環(huán)境由各種基質(zhì)細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞)和細(xì)胞外成分(如細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì))組成，它們圍繞腫瘤細(xì)胞并由血管系統(tǒng)滋養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞針對(duì)化療及靶向藥物產(chǎn)生的耐藥性可分為先天性耐藥及獲得性耐藥兩大類，前者在治療前即存在耐藥，后者指由化療藥物所誘導(dǎo)的耐藥。根據(jù)腫瘤細(xì)胞耐藥的特點(diǎn)，又可分為原藥耐藥(primary drug resistance，PDR)和多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)兩種。其中MDR[1]的形成機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括抑制跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排機(jī)制、影響酶系統(tǒng)的改變、促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)下降等多種機(jī)制[2]。因此如何逆轉(zhuǎn)耐藥及其耐藥機(jī)制研究已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中西醫(yī)綜合治療能為腫瘤患者帶來(lái)生存獲益。近年來(lái)的研究表明, 中藥在增強(qiáng)抗腫瘤藥物敏感性和克服腫瘤耐藥方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文通過(guò)收集、整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)中藥能抑制跨膜蛋白、影響酶系統(tǒng)和促進(jìn)凋亡通路，從而逆轉(zhuǎn)消化道腫瘤治療耐藥的發(fā)生，也為中醫(yī)藥的推廣提供依據(jù)。

1 中藥抑制跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族ATP結(jié)合盒(ATP- binding cassette，ABC)是多藥耐藥研究中最常見(jiàn)的機(jī)制，在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中有48名成員，本文研究其中3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分別為P-糖蛋白，多藥耐藥相關(guān)蛋白和乳腺癌耐藥蛋白[3]。上述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)高低與耐藥性及不良反應(yīng)最為相關(guān)，其機(jī)制是將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，達(dá)到藥物細(xì)胞毒作用減弱甚至喪失的作用，因此可以降低藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[4]。

1.1 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)

P-gp是由多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的首個(gè)人體ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，又稱ABCB1。P-gp的誘導(dǎo)或抑制作用可能會(huì)對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響[5]。P-gp主要參與藥物外排，降低抗腫瘤藥物在腸道的吸收，縮短作用在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間，因此導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[6]。

健脾理氣類中藥以黃芪為代表，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪及其有效成分對(duì)P-gp的表達(dá)有抑制作用。葉青[7]的實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃芪甲苷可以使胃癌順鉑耐藥株(SGC7901/DDP)增加化療敏感性而死亡。通過(guò)對(duì)比不同濃度時(shí)黃芪甲苷發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的效果，提示在0.08 mg/mL濃度時(shí)黃芪甲苷能明顯發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的效應(yīng)，其機(jī)制可能是黃芪甲苷通過(guò)下調(diào)MDR1 mRNA及P-gp的表達(dá)，降低耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗作用而起到逆轉(zhuǎn)效果。張雋開等[8]實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明黃芪注射液可增強(qiáng)肝癌5-Fu耐藥細(xì)胞株Bel/Fu的化療敏感性，下調(diào)P-gp表達(dá)，降低化療藥物外排功能。研究中也發(fā)現(xiàn)黃芪注射液在使Bel/Fu化療增敏的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的血紅素加氧酶表達(dá)有顯著下降，表明黃芪可能是通過(guò)改善了細(xì)胞的乏氧狀況而實(shí)現(xiàn)其化療增敏作用，從而逆轉(zhuǎn)耐藥的發(fā)生。

除了健脾理氣類中藥外，清熱解毒類中藥也發(fā)揮中藥逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。Jun Li等[9]驗(yàn)證了黃芩素對(duì)多藥耐藥肝癌細(xì)胞(Bel7402/5-FU)的作用，發(fā)現(xiàn)10 μg/mL黃芩素是研究黃芩素對(duì)多藥耐藥影響的合適濃度。黃芩素在體外實(shí)驗(yàn)中具有促凋亡、促自噬和逆轉(zhuǎn)化療耐藥性的作用，主要通過(guò)降低P-gp和Bcl-xl蛋白的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)耐藥。此外，黃芩素能通過(guò)抑制P-gp介導(dǎo)的藥物外排，增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞內(nèi)積累。Neerati等[10]運(yùn)用姜黃素處理結(jié)腸癌細(xì)胞，研究表明結(jié)腸癌細(xì)胞中P-gp的表達(dá)量下調(diào)至原來(lái)的1/15，且姜黃素處理組的藥物累積量是P-gp抑制劑維拉帕米處理組的7倍，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠明顯增強(qiáng)伊立替康化療藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的滲透作用，從而逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象。王開雷等[11]運(yùn)用大腸癌多藥耐藥細(xì)胞LOVO/5-Fu進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)粉防己堿可能是通過(guò)抑制多藥耐藥基因的表達(dá)，使P-gp的表達(dá)降低，從而增強(qiáng)LOVO/5-Fu耐藥細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性。Yuan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍提取物能顯著提高化療藥物在P-gp過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的敏感性，增強(qiáng)了化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，因此可知蟾蜍提取物可能是P-gp介導(dǎo)的體外多藥耐藥的有效逆轉(zhuǎn)劑。

通過(guò)對(duì)胃癌、腸癌、肝癌細(xì)胞耐藥細(xì)胞株的研究，中藥治療可作為輔助療法與目前的化療結(jié)合使用，以增加癌癥化療作用及減少化療多藥耐藥的發(fā)生。

1.2 多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)

目前已知的人類MRP家族有12個(gè)成員組成，均屬于ABCC家族。其中MRP1和MRP2是研究最多的兩種MRP[13]。臨床研究中吉西他濱是目前胰腺癌治療的有效化療藥物之一，通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抑制MRP的表達(dá)可能是吉西他濱治療胰腺癌有效的原因。Skrypek Nicolas等[14]在敲除ErbB2/HER2基因的胰腺癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)吉西他濱和伊立替康/SN-38的耐藥性升高，其中MRP1和MRP2在細(xì)胞株中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為83%和91%，因此考慮MRP1和MRP2與SN-38治療胰腺導(dǎo)管腺癌的耐藥密切相關(guān)。Guo等[15]在裸鼠體內(nèi)建立吉西他濱耐藥PANC-1胰腺癌細(xì)胞移植瘤模型，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證大黃素通過(guò)抑制P-gp和MRP的表達(dá)，增強(qiáng)吉西他濱治療腫瘤的療效和減輕對(duì)吉西他濱的耐藥性。這可能是通過(guò)下調(diào)MRP1和MRP5的表達(dá)，提高吉西他濱耐藥PANC-1胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。

粉防己堿和苦參不但具有良好的抗腫瘤作用，還對(duì)消化道腫瘤的耐藥有一定的逆轉(zhuǎn)作用。Wang等[16]采用逐步篩選的方法，在化療藥物順鉑濃度遞增的條件下分離人食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞系YES-2/DDP，并從中藥漢防己中分離得到粉防己堿，將其作用于人食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞系YES-2/DDP。研究表明粉防己堿能通過(guò)下調(diào)MRP1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)YES-2/DDP細(xì)胞的耐藥作用，且呈劑量依賴性，但對(duì)MDR1和BCRP的表達(dá)無(wú)明顯變化。尹衛(wèi)華等[17]采用濃度梯度實(shí)驗(yàn)篩選無(wú)毒劑量復(fù)方苦參注射液的濃度，研究表明復(fù)方苦參注射液能通過(guò)降低P-gp、P-170和MRP等蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腸癌SW480/5-氟尿嘧啶(SW480/5-FU)耐藥細(xì)胞株、腸癌SW480/奧沙利鉑(SW480/L-OHP)耐藥株，因此復(fù)方苦參注射液可減少結(jié)直腸癌耐藥率的發(fā)生，增加化療藥物對(duì)腫瘤的敏感性。馮巍巍等[18]選用人肝癌多柔比星耐藥HepG2/ADM細(xì)胞在裸鼠腋下接種，發(fā)現(xiàn)苦參素能通過(guò)調(diào)控MRP1的表達(dá)來(lái)提升多柔比星對(duì)人肝癌耐藥裸鼠移植瘤的抑制作用。

上述中藥對(duì)MRP的研究提示清熱解毒類中藥抑制MRP的表達(dá)可能是逆轉(zhuǎn)消化道腫瘤耐藥的機(jī)制之一。

1.3 乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)

BCRP屬于三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ATP-bindiong cassette superfamily G member 2，ABCG2)。研究表明，孕激素受體、雌激素受體、核因子-κB、芳香烴受體和缺氧誘導(dǎo)因子等可參與乳腺癌耐藥蛋白啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)的特定反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而激活乳腺癌耐藥蛋白的轉(zhuǎn)錄[19]。Li Q等[20]構(gòu)建大腸癌耐藥細(xì)胞(HCT-8/5-FU)，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草醇提物作用下，HCT-8/5-FU細(xì)胞中P-gp和ABCG2蛋白表達(dá)下降，表明白花蛇舌草通過(guò)下調(diào)P-gp和ABCG2的表達(dá)逆轉(zhuǎn)耐藥的發(fā)生。林久茂[21]通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證白花蛇舌草能顯著下調(diào)HCT-8/5-FU細(xì)胞中及裸鼠移植瘤中ABCC/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、Cyclin D1、CDK4、Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)p21、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究還驗(yàn)證了白花蛇舌草對(duì)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、氨基末端激酶、p38、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B，且進(jìn)一步驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)耐藥的發(fā)生與白花蛇舌草劑量有一定的依賴作用。以上實(shí)驗(yàn)研究均驗(yàn)證白花蛇舌草具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥和抑制腫瘤耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為其作為化療輔助劑運(yùn)用于臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

2 中藥影響酶系統(tǒng)改變

在多藥耐藥細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核中存在一些與多藥耐藥產(chǎn)生有關(guān)的酶, 改變特異性酶系活性可以降低藥物的細(xì)胞毒作用，主要是蛋白激酶C、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)以及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)等。其中蛋白激酶C可能是通過(guò)誘導(dǎo)多藥耐藥基因過(guò)表達(dá)和加速P-gp磷酸化而導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生。GST轉(zhuǎn)移酶通過(guò)催化谷胱甘肽與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合，增加其水溶性，促進(jìn)藥物外排，從而降低抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。金秀東等[22]以人結(jié)腸癌細(xì)胞耐奧沙利鉑細(xì)胞(THC-8307/OXA)為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方五味子素B可以降低GST-π在THC-8307/OXA中的表達(dá)，從而提高奧沙利鉑藥物的敏感性。王亞琪[23]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討益氣化瘀解毒方干預(yù)后對(duì)索拉菲尼獲得性耐藥人肝癌QGY7702細(xì)胞(QGY7702/Sora)增殖及MRP、GST-π和TopoⅡ基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明益氣化瘀解毒方可抑制耐藥細(xì)胞的增殖活性。益氣化瘀解毒方組可抑制GST-π基因的過(guò)表達(dá)(P<0.01)，且聯(lián)合索拉菲尼可顯著提高TopoⅡ基因的表達(dá)量(P<0.01)，因此益氣化瘀解毒方能夠拮抗索拉菲尼耐藥與抑制GST-π過(guò)表達(dá)相關(guān)。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證實(shí)在消化道腫瘤中中藥及相關(guān)制劑能通過(guò)影響酶系統(tǒng)的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的發(fā)生。

3 中藥促進(jìn)凋亡通路的激活

目前已知的許多化療藥物可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡這一途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，從而起到抑制腫瘤的作用，因此腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡耐受是產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一。凋亡通路一般包括半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)及凋亡抑制基因等。招志輝等[24]通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用人結(jié)直腸癌HT-29順鉑耐藥細(xì)胞株，證實(shí)黃芪多糖能顯著抑制HT-29/DDP細(xì)胞的增殖(P<0.01)，且呈劑量依賴性。其機(jī)理認(rèn)為是黃芪多糖能通過(guò)下調(diào)miR-20a并上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體-2的表達(dá)提高人結(jié)直腸癌HT-29/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而抑制細(xì)胞增殖和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該作用與抑制PCNA、Bcl-2蛋白而促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。楊茂鵬等[25]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度的人參皂苷Rg3對(duì)人大腸癌高侵襲細(xì)胞系Lovo/5-Fu具有抑制轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)耐藥作用的生理機(jī)制，Lovo/5-Fu細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶類的耐藥性下降(P<0.05)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性減低(P<0.05)，細(xì)胞的穿膜能力減低(P<0.05)，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Caspase-8信號(hào)通路誘導(dǎo)Lovo/5-Fu細(xì)胞發(fā)生凋亡或通過(guò)上調(diào)大腸癌抑癌基因nm23的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。Lu C[26]等研究表明茯苓酸能有效抑制胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成。茯苓酸在胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-49P中誘導(dǎo)G1、G2/M期和抑制G0期阻滯，通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。Gu等[27]運(yùn)用多藥耐藥的肝細(xì)胞系BEL-7402/5-FU細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明蟾蜍提取物通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和增加Bax/Bcl-xl的比例來(lái)誘導(dǎo)凋亡，從而導(dǎo)致BEL-7402/5-FU細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的化療敏感性的廣泛增強(qiáng)。顧政一等[28]發(fā)現(xiàn)貝母有效成分(貝母素乙)能通過(guò)提高人胃癌長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞株(SGC-7901/VCR)對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，降低P-gp的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)藥物外排及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥產(chǎn)生明顯的逆轉(zhuǎn)作用。貝母素乙與5-氟尿嘧啶聯(lián)合給藥可致Caspase-3表達(dá)升高誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡。

中藥對(duì)信號(hào)通路的激活是通過(guò)調(diào)控通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增值，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但中藥的作用形式及中藥的調(diào)控方式具有多樣性，因此也需要更多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

4 討論與展望

腫瘤耐藥的發(fā)生是復(fù)雜的多因素現(xiàn)象，在臨床治療上非常容易出現(xiàn)，嚴(yán)重影響化療及靶向藥物的臨床療效。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)整體觀，以中醫(yī)病機(jī)辨證論治腫瘤，最重要的是對(duì)疾病整體的宏觀把控，同時(shí)不可忽視建立對(duì)局部微環(huán)境的認(rèn)識(shí)。因此，中醫(yī)藥治療消化道腫瘤是通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)改善腫瘤微環(huán)境，達(dá)到治療目的。

盡管中醫(yī)藥的治療有很多優(yōu)勢(shì)，但是自身的局限性也不容忽視。首先，中藥有效成分復(fù)雜，在臨床運(yùn)用中多以復(fù)方制劑居多，因此很難闡明具體機(jī)制。其次，中藥講究藥材相互之間配伍運(yùn)用，且在煎煮過(guò)程中成分的改變或者藥物之間相互作用很難評(píng)估，因此無(wú)法明確具體的作用靶點(diǎn)。再者，在臨床中，中藥的治療缺乏循證醫(yī)學(xué)依據(jù)較高的臨床研究，無(wú)論單藥或者復(fù)方研究，無(wú)法統(tǒng)一中藥的干預(yù)時(shí)間及具體藥物，無(wú)法獲得如西醫(yī)治療所謂的一線、二線等的用藥規(guī)范，因此大多數(shù)中藥對(duì)腫瘤治療耐藥的相關(guān)研究只停留在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。但中藥的研究方式絕不只是照搬西醫(yī)研究方案，隨著學(xué)科間的互相合作，中醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，尋找更為合適的臨床多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑，突出中醫(yī)中藥特色，安全有效地將中醫(yī)藥治療運(yùn)用到臨床實(shí)踐中，推動(dòng)中醫(yī)藥走向世界需要所有人的努力。