郭倩 申晨 申阿東

結核分枝桿菌是一種胞內(nèi)致病菌，由其感染所引起的人類結核病被稱為是全球頭號傳染病殺手。長久以來，巨噬細胞、樹突細胞等吞噬細胞被認為是結核分枝桿菌生長的主要宿主細胞[1]，經(jīng)由呼吸道等入侵的結核分枝桿菌可通過多種配體-受體途徑被宿主吞噬細胞識別和吞入[2-3]，通過吞噬細胞的固有殺傷能力和隨后啟動T淋巴細胞免疫為主的獲得性免疫反應對結核分枝桿菌進行殺傷和清除。目前的研究表明，結核分枝桿菌不僅能夠在吞噬細胞內(nèi)存活，還能夠感染以宿主造血干細胞和間充質(zhì)干細胞為代表的干細胞，并在其中潛伏和增殖[4-6]。

干細胞是一類具有自我復制和自我更新能力的多潛能細胞，其通常被描述為位于不可逆細胞分化等級最高的離散細胞群，可以通過特定細胞表面標記物對其進行區(qū)分和分類。根據(jù)發(fā)生學來源可分為胚胎干細胞和造血干細胞，根據(jù)可以分化產(chǎn)生細胞類型的數(shù)量，可分為單能、多能和全能干細胞。造血干細胞和間充質(zhì)干細胞屬于多能干細胞。

干細胞具有自我更新、產(chǎn)生低水平活性氧、表達藥物外排泵等能力[7-8]，有助于結核分枝桿菌發(fā)生藥物逃避和持久生存；同時，其可以高度遷移/穿梭于骨髓、循環(huán)血和結核肉芽腫之間[9-10]，有助于結核分枝桿菌發(fā)生血源性播散。因此，干細胞對于維持結核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的休眠和傳播具有十分重要的意義[11]。

一、結核分枝桿菌持久感染損傷造血干細胞增殖和轉(zhuǎn)錄

造血干細胞是血液系統(tǒng)中一類具有造血功能的異質(zhì)性成體干細胞，其差異表達白細胞分化抗原簇(cluster of differentiation, CD) 45和CD34等表面分子。正常情況下，大部分造血干細胞在骨髓中處于靜止狀態(tài)，僅有一小部分為造血提供需要。但當出現(xiàn)失血、感染等應激情況時，造血干細胞會被迅速激活，在骨髓中增殖并隨后進入外周血。造血干細胞在胸腺激素的誘導下可分化成具有免疫活性的T淋巴細胞，活化的T細胞在結核分枝桿菌感染個體的抗結核細胞免疫應答中具有重要作用。骨髓外T細胞可通過產(chǎn)生細胞因子(如白細胞介素-2、γ-干擾素等)以確保造血干細胞分化血細胞的平衡輸出和自我更新的終生維持[12-13]。

結核分枝桿菌可能直接感染造血干細胞并在其內(nèi)潛伏或增殖。有研究人員發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細胞移植后的個體患活動性結核病的風險是普通人的2～40倍[14]，其原因一方面可能是移植前受體體內(nèi)休眠的結核分枝桿菌在移植后由于免疫功能處于抑制狀態(tài)而被激活，另一方面也提示一些移植供者的造血干細胞可能攜帶結核分枝桿菌[15]。Tornack 等[6]在小鼠淋巴細胞活化信號分子相關受體家族(SLAM)CD150+的造血干細胞亞群中找到了結核分枝桿菌感染造血干細胞的直接證據(jù)——上述細胞內(nèi)均能夠檢測出結核分枝桿菌的核酸。由于上述細胞中的結核分枝桿菌能夠表達休眠生存調(diào)節(jié)子(dormancy survival regulon，DosR)和熱休克蛋白X(HspX)等休眠相關基因，提示結核分枝桿菌感染造血干細胞并在其內(nèi)休眠。在結核分枝桿菌侵入宿主細胞后，長期持久抗原刺激可誘導T細胞分泌多種細胞因子[16]，其中γ-干擾素和白細胞介素-2表達水平的平衡被認為在維持造血干細胞穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[17]。Li等[18]構建小鼠感染模型，用結核分枝桿菌毒力蛋白——早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)構建的融合蛋白對小鼠分別進行瞬時灌注刺激(對照組)和持續(xù)灌注刺激(實驗組)。12周后發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠CD4+T細胞產(chǎn)生的γ-干擾素濃度高于對照組，白細胞介素-2濃度低于對照組，γ-干擾素濃度的持續(xù)增高降低了細胞譜系分化抗原 (-)和Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族蛋白c-Kit(+)造血干細胞/造血祖細胞的增殖活性，損害造血干細胞的增殖和自我更新，繼而導致造血干細胞耗竭[18-19]。此外，γ-干擾素的高水平表達還會通過上調(diào)堿性亮氨酸拉鏈結構域轉(zhuǎn)錄因子Batf2[20]和干擾素調(diào)節(jié)因子IRF8[21]的表達，誘導造血干細胞及造血祖細胞向髓系細胞分化[21]；而補充白細胞介素-2可通過激活調(diào)節(jié)性T細胞和下調(diào)γ-干擾素恢復造血祖細胞的增殖活性，維持造血干細胞正常造血[17-18]。

二、結核分枝桿菌感染減弱了間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用

間充質(zhì)干細胞作為一種來源于發(fā)育早期中胚層的非造血干細胞，具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過細胞間的相互作用及分泌細胞因子來抑制T細胞的增殖及介導的免疫反應。而可與之相混淆的另一概念“間充質(zhì)基質(zhì)細胞”被認為主要具有顯著的分泌、免疫調(diào)節(jié)等功能[22]；盡管間充質(zhì)干細胞和間充質(zhì)基質(zhì)細胞早在50多年前就已被發(fā)現(xiàn)，且國際細胞和基因治療學會及間充質(zhì)基質(zhì)細胞委員會也明確闡述了兩者的區(qū)別和不可互換性[23]，并分別以英文字母縮寫MSCs和MSC指代，但是有研究對這兩個術語沒有進行明確的區(qū)分，間充質(zhì)干細胞也被指代間充質(zhì)基質(zhì)細胞，例如，Saalbach和Anderegg[24]探討間充質(zhì)細胞多分化能力時，其描述與間充質(zhì)干細胞的概念相一致。因此，筆者在文中所述間充質(zhì)干細胞不除外間充質(zhì)基質(zhì)細胞。

Beamer等[4]和Das等[11]猜測骨髓間充質(zhì)干細胞可能是休眠期結核分枝桿菌長期存活的宿主細胞之一且參與結核病的發(fā)病機制，繼而通過用綠色熒光蛋白熒光標記結核分枝桿菌的方法對這一猜測進行驗證，發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌可在體外感染間充質(zhì)干細胞，其中低親和力神經(jīng)生長因子受體(NGFR/CD271, 腫瘤壞死因子受體超家族成員)陽性的間充質(zhì)干細胞是結核分枝桿菌最容易感染的間充質(zhì)干細胞類型。此外，研究也表明，在異煙肼和利福平抗結核治療過程中，實驗小鼠肺和脾中的結核分枝桿菌含量快速減少，但仍有少量的結核分枝桿菌可在間充質(zhì)干細胞中持久存活，這表明結核分枝桿菌感染的間充質(zhì)干細胞為結核分枝桿菌持久存活提供了一個相對適宜的細胞內(nèi)環(huán)境，而且被感染的間充質(zhì)干細胞內(nèi)處于休眠期的結核分枝桿菌仍然具有再感染健康組織的能力[4]。

由于γ-干擾素和α-干擾素等炎性細胞因子在結核分枝桿菌感染后增高[25]，巨噬細胞內(nèi)結核分枝桿菌的生存壓力較大；而間充質(zhì)干細胞具有自我更新、相對靜止及只產(chǎn)生低水平內(nèi)源性活性氧等多種特性，其為結核分枝桿菌的潛伏提供了有利條件。一方面，結核分枝桿菌減弱間充質(zhì)干細胞的自噬和一氧化氮介導的殺傷作用; 另一方面，脂質(zhì)介質(zhì)前列腺素E2有助于骨髓間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出親細菌的特性[10]，而結核分枝桿菌具有富含脂質(zhì)的細胞壁且能通過促進間充質(zhì)干細胞中脂質(zhì)合成并留在脂質(zhì)體內(nèi)以逃避宿主適應性免疫反應[11]。此外，結核分枝桿菌還可通過上調(diào)自身DosR等休眠相關基因的持續(xù)表達進入休眠狀態(tài)，休眠的結核分枝桿菌對常規(guī)抗結核藥品反應差，通常僅可通過誘導自噬消除[26]。間充質(zhì)干細胞也可被招募至肉芽腫周圍[10]，被結核分枝桿菌感染的間充質(zhì)干細胞可通過自噬和一氧化氮介導的殺傷作用來限制結核分枝桿菌的存活[27]。而與駐留在巨噬細胞內(nèi)的結核分枝桿菌不同，間充質(zhì)干細胞中的結核分枝桿菌對抗結核藥品的耐受性非常好，這可能和缺氧、低水平一氧化氮、藥物轉(zhuǎn)運蛋白表達較高和空泡型H+ATP酶表達低[10]等有關。因此，或許可以通過增強間充質(zhì)干細胞的自噬能力或采用體外擴增的間充質(zhì)干細胞輔助治療，從而將患者機體內(nèi)的慢性炎癥轉(zhuǎn)化為有益的免疫反應，改善其臨床預后。

三、干細胞在結核病預防及免疫治療中的應用

(一)造血干細胞在結核病免疫治療中的應用

1.造血干細胞表面蛋白可用于開發(fā)新疫苗：卡介苗是一種能夠增強免疫、預防結核病最直接也唯一被認可的方法，卡介苗接種后進入骨髓，改變了造血干細胞和多能祖細胞的轉(zhuǎn)錄微環(huán)境[21]，并誘導分化產(chǎn)生針對結核分枝桿菌的記憶T細胞，對預防結核病尤其是嬰幼兒期播散性結核病具有重要作用[28]。目前，卡介苗發(fā)揮免疫防御作用的機制并不完全清楚。Kaufmann等[21]通過構建小鼠模型，發(fā)現(xiàn)卡介苗可使細胞譜系分化抗原陰性且Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族蛋白c-Kit和淋巴細胞抗原6復合體A雙陽性細胞(LKS+細胞)增殖相關基因表達上調(diào)，并促進CD150-且Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族蛋白c-Kit和淋巴細胞抗原6復合體A雙陽性細胞(LKS+細胞)及CD48+的多能祖細胞向髓系分化，從而間接調(diào)控造血干細胞向造血祖細胞及造血祖細胞向單核細胞的分化，即卡介苗能夠提高巨噬細胞對結核分枝桿菌的固有免疫、增強巨噬細胞活性以及T淋巴細胞的活化，這些細胞可提供比初始單核/巨噬細胞更有力的抗結核防御作用，具有較強的殺菌能力，并且這種具有強殺菌能力的單核/巨噬細胞在體內(nèi)具有一定持久性，提示識別造血干細胞標志性蛋白可作為開發(fā)抗結核和其他傳染病疫苗的一種新策略。

2.造血干細胞基因修飾預防結核分枝桿菌感染：Hetzel 等[29]研發(fā)了一種造血干細胞基因治療方法，使用特異性表達γ-干擾素受體1基因(Ifngr1)的慢病毒載體，在卡介苗感染前將基因矯正的造血干細胞移植到Ifngr1缺失的小鼠體內(nèi)，結果發(fā)現(xiàn)，接受移植的小鼠巨噬細胞可穩(wěn)定表達Ifngr1，還可預防嚴重卡介苗病，并恢復肺和脾巨噬細胞的抗分枝桿菌活性，保護小鼠免受嚴重的結核分枝桿菌感染，是一種基于造血干細胞免疫基因修飾預防感染的策略。

(二)間充質(zhì)干細胞通過免疫調(diào)節(jié)限制結核分枝桿菌感染

間充質(zhì)干細胞是一種新型免疫細胞，具有免疫調(diào)節(jié)、組織修復和抗菌等功能，可通過自噬、分泌自由基、表達清道夫受體和甘露醇受體來限制結核分枝桿菌的存活[27]。雷帕霉素可誘導間充質(zhì)干細胞自噬，增強間充質(zhì)干細胞對結核分枝桿菌的吞噬殺傷作用[30]。間充質(zhì)干細胞還可以通過釋放活性氧和NO來抑制胞內(nèi)結核分枝桿菌的活性[27]。

此外，間充質(zhì)干細胞可以在體外誘導增殖，采用體外擴增的自體間充質(zhì)干細胞進行移植治療，可將體內(nèi)慢性炎癥反應轉(zhuǎn)化為有益的免疫反應。Choi等[31]采用膿腫分枝桿菌模擬結核分枝桿菌感染小鼠建模，將小鼠隨機分為實驗組和對照組并分別注射體外擴增的間充質(zhì)干細胞和磷酸鹽平衡液。結果發(fā)現(xiàn)，注射間充質(zhì)干細胞小鼠的荷菌量較少且存活時間>15 d的概率較大，且注射劑量越大存活率越高。另一項研究表明，間充質(zhì)干細胞對膀胱結核有一定輔助治療作用[32]；耐藥和多耐藥結核病患者在接受自體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞治療后，胸部X線攝影檢查結果和患者病情得到顯著改善[33]。Skrahin等[34]在一項研究中指出，自體骨髓間充質(zhì)干細胞輔助治療與臨床不良事件及急性毒性反應無明顯關系，僅可能出現(xiàn)暫時性發(fā)熱,其對結核病患者似乎是安全的。因此，間充質(zhì)干細胞有望成為限制結核分枝桿菌感染和結核病病情發(fā)展的潛在治療靶點。

(三)胚胎干細胞與抗結核新藥研發(fā)

胚胎干細胞在體外特定培養(yǎng)條件下可分化為與經(jīng)典巨噬細胞相似的巨噬樣細胞；該巨噬樣細胞不僅轉(zhuǎn)錄組學和免疫學特征與經(jīng)典巨噬細胞相似、能夠分泌炎性因子(如NO、α-干擾素等)，還能夠抑制甚至殺死結核分枝桿菌。Han等[35]通過誘導胚胎干細胞分化增殖為巨噬樣細胞，并在此基礎上篩選出了一種被稱為“10-DEBC”的新型抗結核分枝桿菌藥物，為阻礙結核病的發(fā)生發(fā)展奠定基礎。因此，干細胞不僅有可能作為結核病的新型免疫治療藥物，也可以為結核病的新藥研發(fā)提供篩選模型。

四、總結

作為一類新型免疫細胞，干細胞既能夠成為結核分枝桿菌的潛伏存活場所又具有一定的限制結核分枝桿菌生長的能力。盡管研究表明，干細胞可作為免疫靶點或免疫治療制劑用于調(diào)節(jié)與結核病相關的感染和炎癥，也可能為結核病的新藥或疫苗研發(fā)提供篩選模型。但是，目前國內(nèi)關于干細胞與結核病的研究尚處于起步階段，在將干細胞應用到結核病的臨床防治前，仍需要進行大量的科學研究和臨床試驗來探索其有效性及安全性。