鐘董蘭 何翃閎 潘陽陽 楊珊珊 王軍乾 楊 貽 余四九 徐庚全

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070)

牦牛主要生活在海拔3000米以上的高原地區(qū)，對高寒低氧環(huán)境有很強的適應性，為促進牧民的經(jīng)濟和文化繁榮發(fā)揮了重要的作用[1-2]。但牦牛的繁殖率低是牧區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的一大難題[3]，因此，研究牦牛生殖系統(tǒng)具有重要意義。輸卵管是雌性生殖系統(tǒng)的主要組成部分，是精子儲存和獲能、輸送卵子、受精以及早期胚胎發(fā)育等的主要場所[4-5]。根據(jù)結構和功能，輸卵管分為峽部、壺腹部和漏斗部，管壁結構均包括黏膜、肌層和漿膜層[6-7]。排卵時，于輸卵管峽部貯存的精子獲能后緩慢向壺腹部運行；同時輸卵管漏斗部是卵子撿拾的部位，通過漏斗部肌肉的收縮和輸卵管傘的運動將卵子吸入輸卵管，再通過纖毛細胞的擺動將卵子運送至壺腹部，從而使精子和卵子在壺腹部完成受精[8-9]。因此，輸卵管對受精起著重要作用。

整合素是細胞表面受體家族成員之一，鑒于該家族對細胞和組織保持結構完整的重要性，將這些分子命名為整合素[10]。整合素主要存在于多種細胞表面，與細胞外基質(zhì)結合并從中傳遞機械和化學信號，有助于指導受精、著床、胚胎發(fā)育、免疫應答、維持組織結構的完整性、凝血、創(chuàng)傷修復、腫瘤生長和轉移等一系列生理和病理過程[11]。整合素家族至少由24個成員組成，是18個α和8個β亞基組合成的Ⅰ型跨膜糖蛋白[12]。根據(jù)β亞基的不同，可以將整合素分為8個亞家族，整合素β3是其中一個亞家族[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人的妊娠早期，整合素β3在輸卵管的表達水平較高，表明它對早期妊娠的維持具有重要作用[5]。Van Waes[14]和楊筱祎等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在人的生殖過程中，整合素能夠促進輸卵管黏膜分泌營養(yǎng)成分、促進精子頭部穿透進入卵母細胞以及促進受精卵穿透蛻膜層和胎盤滋養(yǎng)層。由此推測，整合素β3在輸卵管中發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，整合素αv可特異性識別精氨酸-甘氨酸-冬氨酸(RGD)三肽氨基酸序列，參與細胞間的黏附，使精子和卵子在輸卵管中黏附融合，從而介導受精[16]。甘肅省牛羊胚工程技術研究中心前期研究發(fā)現(xiàn)，整合素αv在牦牛繁殖周期各階段輸卵管不同部位中有表達并存在顯著差異，主要表達于牦牛輸卵管的纖毛細胞、分泌細胞、基細胞、肌層和漿液腺中，推測整合素αv在牦牛受精和早期胚胎的發(fā)育中發(fā)揮作用[17]。整合素β3和整合素αv同屬于整合素家族，且整合素β3也在卵子撿拾、受精和早期胚胎發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用，但整合素β3與牦牛輸卵管相關的研究尚鮮見報道[5]。因此，本試驗通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)與蛋白免疫印跡(Western-blotting, WB)檢測整合素β3在牦牛繁殖周期各階段輸卵管不同部位中的表達，并通過免疫組織化學法對其進行定位，以期為進一步探索牦牛的生殖繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品采集 在青海省西寧市百德屠宰場挑選處于繁殖周期各階段的健康母牦牛各6頭，頸動脈放血致死，分別采集卵泡期后期(卵巢上有優(yōu)勢卵泡，且>6 mm)，黃體期后期(卵巢上有多個黃體)同側，妊娠期妊娠側的輸卵管，用生理鹽水沖洗干凈并修剪[18]。一部分用于RNA的提取，儲存于-80℃超低溫冰箱；另一部分用于免疫組織化學試驗，將組織固定于4%的多聚甲醛溶液中。

1.1.2 主要試劑及儀器 TransZol、Evo M-MLV反轉錄試劑盒、Go Taq?Green Master Mix 2×(美國Promega 公司)；Taq PCR Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTMEraserTM(美國TaKaRa公司)；Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody、SP試劑盒、蛋白裂解液(索萊寶生物有限公司，北京)；整合素β3抗體(bs-0342R)、β-actin Antibody(親科生物研究中心有限公司，江蘇)；曝光液、DAB顯色液(Beyotime 公司，上海)；熒光定量PCR儀，DP71顯微照相裝置(日本Olympus公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計 根據(jù)牛(Bos taurus)整合素β3基因(NM_001206490.3)和β-actin(NM_173979.3)的序列，用Primer Premier 6.0軟件設計引物，于上海生工合成，β-actin基因作為內(nèi)參基因。

1.2.2 RNA的提取和反轉錄 將輸卵管組織樣品充分研磨，用TransZol提取總RNA，再用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列及長度Table 1 Primer sequence and length

1.2.3 整合素β3基因在繁殖周期各階段母牦牛輸卵管不同部位中的擴增 以反轉錄后的牦牛繁殖周期各階段輸卵管各個部位cDNA為模板，對整合素β3和β-actin進行普通PCR擴增，再將普通PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠進行核酸電泳。反應體系為20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，F(xiàn)ree Water 8 μL。整合素β3和β-actin除退火溫度不同外(整合素β3 54℃和β-actin56℃)，其余反應條件一致，反應條件為：95℃預變性4 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸15 s，72℃終延伸5 min，40個循環(huán)。

1.2.4 qRT-PCR檢測整合素β3基因在繁殖周期各階段母牦牛輸卵管不同部位中的表達 分別將不同時期的輸卵管按照峽部、壺腹部和漏斗部分為9組，每組3個復孔。反應總體系為20 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMEraserTM10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL，無菌去離子水7.4 μL。反應條件：95℃預變性300 s，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸5 min，40個循環(huán)。每個樣品重復6次。

1.2.5 蛋白樣品的制備 將-80℃冰箱儲存的卵泡期、黃體期和妊娠期的輸卵管各部位樣品迅速轉移到用錫箔紙包被的研缽中，加入液氮用研杵充分研磨至粉末狀，各稱取0.1 g至1.5 mL離心管中，并加入蛋白裂解液，冰浴搖床裂解1.5 h，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 WB檢測整合素β3蛋白在繁殖周期各階段母牦牛輸卵管不同部位中的表達 將蛋白和4×蛋白上樣緩沖液按照3∶1的比例混合，進行蛋白變性，保存于-20℃。變性后的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyarcylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳，濕轉法轉膜，脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃過夜(整合素β3抗體∶PBST=1∶400；β-actin Rabbit mAb∶PBST=1∶3 000)，二抗室溫搖床40 min(Goat anti-rabbit IgG∶PBST=1∶2 000)。膜上滴加化學發(fā)光液，掃描成像儀掃描，用Image J 6.0檢測灰度值，計算整合素β3蛋白的相對表達量。

1.2.7 整合素β3蛋白在繁殖周期各階段母牦牛輸卵管不同部位的免疫組化定位 常規(guī)方法制作4 μm石蠟切片，下行酒精脫蠟；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復；后續(xù)按照SP試劑盒進行組織染色，其中一抗反應時，整合素β3抗體與PBS的稀釋比例為1∶250；DAB顯色液顯色，之后蘇木精染色，脫水，透明，封片，顯微鏡拍照觀察整合素β3的表達位置。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0軟件采用Sidak法對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，每組6次重復，結果表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 整合素β3基因在繁殖周期各階段母牦牛輸卵管各部位中的擴增

PCR結果顯示，目的基因整合素β3和內(nèi)參基因β-actin分別在198 bp和174 bp處條帶單一明亮(圖1)，驗證反轉錄后的cDNA良好，可以用于后續(xù)試驗。

注：M：DL2000 DNA Marker；1～3依次為卵泡期輸卵管的峽部、壺腹部、漏斗部；4～6依次為黃體期輸卵管的峽部、壺腹部、漏斗部；7～9依次為妊娠期輸卵管的峽部、壺腹部、漏斗部。Note: M: DL2000 DNA Marker. 1-3: Fallopian tube isthmus, ampullary and infundibulum in the follicular phase. 4-6: Fallopian tube isthmus, ampullary and infundibulum in the luteal phase. 7-9: Fallopian tube isthmus, ampullary and infundibulum in the pregnancy phase.圖1 β-actin 和整合素β3基因PCR產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 PCR products of electrophoretic analysis of β-actin and integrin β3 gene

2.2 qRT-PCR檢測整合素β3基因在繁殖周期各階段母牦牛輸卵管不同部位中的表達

由圖2可知，整合素β3和β-actin基因的熔解峰相對單一，表明整合素β3和β-actin引物特異性較好。由圖3可知，整合素β3基因在牦牛繁殖周期輸卵管不同部位均有表達，在繁殖周期各階段，峽部的基因表達量均顯著高于壺腹部和漏斗部。在峽部中，整合素β3在妊娠期的基因表達量顯著高于卵泡期和黃體期；在壺腹部和漏斗部中，卵泡期的基因表達量均顯著高于黃體期和妊娠期。

圖2 β-actin和整合素β3基因的熔解曲線Fig.2 Melting curve of β-actin and integrin β3 gene

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as Fig 5.圖3 整合素β3基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of integrin β3 gene

2.3 WB檢測整合素β3蛋白的相對表達量

WB結果顯示，整合素β3蛋白在繁殖周期各階段輸卵管的不同部位均有表達(圖4和圖5)。其中在繁殖周期各階段，整合素β3蛋白在峽部的表達量均顯著高于壺腹部和漏斗部。在峽部，整合素β3蛋白在妊娠期的表達量最高，黃體期的表達量最低；在壺腹部和漏斗部，卵泡期的表達量均最高。

注：1：卵泡期輸卵管峽部；2：卵泡期輸卵管壺腹部；3：卵泡期輸卵管漏斗部；4：黃體期輸卵管峽部；5：黃體期輸卵管壺腹部；6：黃體期輸卵管漏斗部；7：妊娠期輸卵管峽部；8：妊娠期輸卵管壺腹部；9：妊娠期輸卵管漏斗部。Note: 1: Fallopian tube isthmus in the follicular phase. 2: Fallopian tube ampullary in the follicular phase. 3: Fallopian tube infundibulum in the follicular phase. 4: Fallopian tube isthmus in the luteal phase. 5: Fallopian tube ampullary in the luteal phase. 6: Fallopian tube infundibulum in the luteal phase. 7: Fallopian tube isthmus in the pregnancy phase. 8: Fallopian tube ampullary in the pregnancy phase. 9: Fallopian tube infundibulum in the pregnancy phase.圖4 整合素β3和β-actin蛋白的檢測結果Fig.4 The Western-blotting expressions of integrin β3 and β-actin antibody

圖5 整合素β3 和 β-actin 蛋白的檢測結果Fig.5 Detection and analysis of integrin β3 and β-actin protein

2.4 整合素β3蛋白在繁殖周期各階段輸卵管不同部位中的分布

免疫組織化學結果顯示，整合素β3蛋白主要分布于牦牛繁殖周期各階段輸卵管峽部、壺腹部和漏斗部的肌層、漿液腺、基細胞、黏膜上皮的分泌細胞、纖毛細胞中，棕褐色表示整合素β3蛋白的陽性表達產(chǎn)物(圖6)。

注：a:卵泡期輸卵管峽部；b:卵泡期輸卵管壺腹部；c:卵泡期輸卵管漏斗部；d:黃體期輸卵管峽部；e:黃體期輸卵管壺腹部；f:黃體期輸卵管漏斗部；g:妊娠期輸卵管峽部；h:妊娠期輸卵管壺腹部；i:妊娠期輸卵管漏斗部；j:輸卵管峽部陰性對照；k:輸卵管壺腹部陰性對照；l:輸卵管漏斗部陰性對照。TM:肌層；LP:固有層；EP:黏膜上皮；P:初級皺襞；S:次級皺襞；T:三級皺襞；C:纖毛細胞；★:分泌細胞；↑:基細胞；▲:漿液腺。Note: a: Fallopian tube isthmus in the follicular phase. b: Fallopian tube ampullary in the follicular phase. c: Fallopian tube infundibulum in the follicular phase. d: Fallopian tube isthmus in the luteal phase. e: Fallopian tube ampullary in the luteal phase. f: Fallopian tube infundibulum in the luteal phase. g: Fallopian tube isthmus in the pregnancy phase. h: Fallopian tube ampullary in the pregnancy phase. i: Fallopian tube ampullary in the pregnancy phase. j: Fallopian tube isthmus negative control. k: Fallopian tube ampullary negative control. l: Fallopian tube infundibulum negative control. TM: Muscular layer. LP: Lamina propria. EP: Mucosal epithelium. P: Primary wrinkles. S: secondry wrinkles. T: Tertiary wrinkles. C: Ciliated cell.★: Secretory cell. ↑: Basal cell. ▲: Serous gland.圖6 整合素β3蛋白在牦牛繁殖周期各階段輸卵管不同部位的分布Fig.6 Distribution of integrin β3 protein in different parts of the fallopian tube at reproductive stages of yak

3 討論

整合素有兩大功能，一是通過識別與結合RGD序列，參與細胞內(nèi)外的雙信號傳導與細胞外基質(zhì)的黏附；二是參與胚胎生長發(fā)育和著床、創(chuàng)傷修復和免疫等多種生理病理過程[19-20]。

有研究表明，整合素β3高表達于輸卵管峽部黏膜上皮，可能參與精子功能的調(diào)節(jié)和授精前的修飾過程，為輸卵管峽部發(fā)揮精子“儲存器”的作用提供了一種分子機制。本研究中的qRT-PCR和WB結果顯示，整合素β3在繁殖周期各階段的輸卵管峽部表達量均顯著高于壺腹部和漏斗部。哺乳動物排卵后，精子表面的細胞外基質(zhì)配體和輸卵管峽部黏膜上皮高表達的整合素結合，使精子內(nèi)某些蛋白激酶的酪氨酸磷酸化，激活精子進入輸卵管壺腹部，與卵子結合并受精[17, 21]。因此，整合素β3在峽部的表達量高可能與儲存精子，早期胚胎的運輸以及發(fā)育有關。本研究中qRT-PCR和WB結果顯示，整合素β3在輸卵管壺腹部和漏斗部也有表達。由前人研究可知[8-9]，輸卵管壺腹部是進行受精的部位，受精卵受精后進一步發(fā)育，被運輸至子宮進行附植。Glander等[22]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵母細胞可以表達多種整合素，整合素通過與精子表面的纖維粘連蛋白(fibronecein, FN)或RGD序列結合，可以調(diào)節(jié)精卵黏附，參與受精過程。同時有研究表明，整合素在生殖過程中可以介導精卵結合[22]，推測整合素β3在壺腹部的表達參與了精卵結合。哺乳動物在每個繁殖周期會排出卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex, COCs)，整合素β3可能參與輸卵管上皮黏膜纖毛細胞和COCs的黏附，而這種黏附在卵子的撿拾中發(fā)揮了重要作用[23-24]。還有研究表明，COCs外延的細胞外基質(zhì)內(nèi)含有FN、層粘連蛋白(laminin, LM)和韌粘素-C，整合素β3可以介導細胞與FN、LM等細胞外基質(zhì)的黏附[25]。因此，輸卵管傘對卵子的撿拾可能是依賴漏斗部纖毛細胞的整合素β3與COCs的細胞外基質(zhì)結合所完成的。

在動物體內(nèi)，輸卵管是精子獲能、受精及胚胎早期發(fā)育的場所，輸卵管上皮細胞及其分泌物對胚胎早期發(fā)育有重要作用[26]。在胚胎早期發(fā)育及運輸方面，纖毛細胞和分泌細胞提供保護和營養(yǎng)，并參與運輸[27]。在本研究中，免疫組化結果顯示整合素β3在輸卵管上皮細胞中有表達，與前人的研究結果一致[28]。目前已知，細胞因子、粘附分子、激素及免疫等各個方面都影響胚胎的發(fā)育和著床，其中整合素在胚胎著床、發(fā)育中發(fā)揮著至關重要的作用[29]。已知多種動物胚胎的附植受到整合素β3的調(diào)節(jié)[30-31]。Van Waes[14]和Illera[32]研究表明整合素β3參與小鼠胚胎附植過程。研究表明輸卵管和配子或胚胎運動之間的適當時空協(xié)調(diào)是成功妊娠的關鍵，根據(jù)整合素β3在輸卵管中的表達推測它可能參與了這種協(xié)調(diào)作用[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，整合素β3均在牦牛繁殖周期各階段輸卵管不同部位中表達且存在表達差異，推測整合素β3與牦牛受精，精子和早期胚胎的運輸、發(fā)育有關，為研究整合素β3在牦牛生殖過程中的作用提供了理論依據(jù)。

4 結論

整合素β3在牦牛繁殖周期各階段輸卵管的不同部位中均有表達，在輸卵管峽部中的表達量顯著高于壺腹部和漏斗部，整合素β3主要分布于輸卵管峽部、壺腹部和漏斗部的肌層、纖毛細胞、分泌細胞、肌細胞和漿液腺中。可知整合素β3參與了牦牛的精子以及早期胚胎的運輸、發(fā)育和受精等重要生殖過程，但相關機制有待進一步研究。