黑藏羊不同部位肌纖維組織學(xué)特征的差異分析

周 力，吳占月，張峰碩，桂林生，侯生珍

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

肌纖維作為骨骼肌肌肉的基本構(gòu)成單位，其類型及組成對肉質(zhì)特性具有明顯的調(diào)控作用[1]。不同的肌纖維類型具有不同形態(tài)特征、收縮以及代謝特征[2]。根據(jù)免疫組化的方法可以將其劃分為I型（慢速氧化型）、IIA型（快速氧化型）、IIB型（快速酵解型）和IIX型（中間型肌纖維）4種類型[3]，其收縮速率大小為IIB>IIX>IIA>I[4-5]。

據(jù)報道，當(dāng)氧化型肌纖維比例高時，可以改善肌肉色澤，提高嫩度，從而提高肌肉品質(zhì)[6]，這在青海牦牛試驗上有過類似的報道[7]。在不同部位豬肉上也發(fā)現(xiàn)[8]，相較于含更多ⅡB型肌纖維，含有更多Ⅰ型肌纖維中血紅素鐵與高鐵肌紅蛋白含量會更高，顏色偏紅，同時具有更高的pH值與持水力。以上試驗結(jié)果均說明肌纖維特性與肉質(zhì)性狀間的關(guān)系緊密，同時在不同部位間也存在一定的差異。此外，關(guān)于蘇尼特羊的研究進一步證實[9]，Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數(shù)量比例與MyHCⅠ、MyHCⅡA基因的表達(dá)量呈正相關(guān)，ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例與MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表達(dá)量亦呈正相關(guān)，其中ⅡB型肌纖維數(shù)量比例與MyHCⅡB基因的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。這進一步表明肌纖維類型以及MyHCs基因的表達(dá)豐度的變化緊密相關(guān)。目前許多研究者對湖羊[10]、灘羊[11]及黑山羊[12]等肉質(zhì)進行了大量的研究，但關(guān)于黑藏羊肌纖維特性和肉品質(zhì)之間關(guān)系的報道極度匱乏。黑藏羊作為藏系綿羊種類中特有的品種資源[13]。其肉質(zhì)是一種高蛋白、低脂肪、礦物質(zhì)含量高，且肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高，屬于當(dāng)前人們所追求的優(yōu)質(zhì)羊肉[14]。然而傳統(tǒng)放牧效率較低，不能滿足市場對畜禽產(chǎn)品的需求，因而對黑藏羊進行舍飼就成了一種必然的趨勢。

基于此，本研究以舍飼條件下黑藏羊背最長肌、臂三頭肌和股二頭肌作為試驗材料，通過ATP酶染色分析黑藏羊的肌纖維特性，并利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)測定肌纖維MyHCs基因的mRNA表達(dá)量，旨在為黑藏羊的肉質(zhì)改進提供理論支持，同時也為我國優(yōu)質(zhì)地方肉羊資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取20只體況良好、發(fā)育健康且平均體重為（10.28±0.43）kg的2月齡青海黑藏羊公羔，在青海貴南縣黑藏羊繁育中心進行為期128 d（預(yù)試期8 d，正試期120 d）的集中飼養(yǎng)。日糧配方參考中國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）進行配制[15]，每天早上08：00和下午17：30進行飼喂，自由飲水，自由采食全混合日糧（total mixed ration，TMR），全混合日糧中精料補充料和粗飼料比例為5∶5，粗飼料由燕麥青貯和燕麥青干草組成（按干物質(zhì)各占1/2計）。TMR日糧營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 TMR日糧營養(yǎng)成分含量（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Dietary nutrient content of TMR （DM basis） %

1.2 樣品采集和制片

試驗結(jié)束時，選取5只黑藏羊（禁食12 h、禁水2 h）按照頸靜脈方式進行放血屠宰。立即采取左半胴體的背最長肌、臂三頭肌以及股二頭肌組織樣，沿著樣品肌纖維的方向，切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm的肉塊，在預(yù)冷的異戊烷中脫水干燥30 s，經(jīng)液氮速凍，制片時將肌肉塊放入-25℃的冰凍切片機內(nèi)切片，厚度為8～10 μm。再利用ATP酶組織化學(xué)法對黑藏羊不同部位的肌肉樣品進行染色[16]。根據(jù)ATP酶染色后顏色最深（黑色）的是Ⅰ型肌纖維，顏色最淺（白色）是ⅡB型肌纖維，介于兩者顏色之間（棕褐色）是ⅡA型肌纖維的標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌纖維特性分析

試驗應(yīng)用顯微鏡彩圖分析軟件（Leica Qwin v3）在20×10倍下觀察并分析肌纖維特性。每個樣本制作4張切片，每張片子隨機選擇3～5個組織完整的視野進行拍照，使總肌纖維數(shù)目大于1 500根[17]。肌纖維橫截面最長兩點距離與最短兩點距離之和的平均值，作為肌纖維直徑。圈出每個視野內(nèi)面積，并統(tǒng)計出每個視野中肌纖維的根數(shù)，然后換算成每平方毫米的根數(shù)，即為被測樣本的肌纖維密度。通過多次測量視野內(nèi)各型肌纖維的橫截面積，求其平均值作為肌纖維橫截面積。測出視野內(nèi)不同類型肌纖維的數(shù)量，計算每種類型肌纖維的數(shù)量比例。測量每種類型肌纖維的橫截面積，求出每種類型肌纖維的面積比例。

1.3.2 MyHCs基因相對表達(dá)量測定

屠宰后，分別采集約100 mg黑藏羊背最長肌、臂三頭肌以及股二頭肌的組織樣，立即裝入無酶凍存管置于液氮中速凍。使用Trizol法提取不同部位肌肉的總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，再通過微孔板分光光度計測定其吸光度（OD）值，對符合要求的RNA按照FastQant RT Kit（with gDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：1.6 μL cDNA 模板，2×SYBR Rremix ExTaq 10μL，上下游引物各0.4μL （10μmol/L），50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加 RNase-free ddH2O 補足到20 μL。擴增后經(jīng)熔解曲線檢測特異性，反應(yīng)均設(shè)空白對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。選擇肌球蛋白重鏈Ⅰ（myosin heavy chainⅠ，MyHCⅠ）、肌球蛋白重鏈 ⅡA（myosin heavy chainⅡA，MyHC ⅡA）、肌球蛋白重鏈ⅡB（myosin heavy chainⅡB，MyHCⅡB）及肌球蛋白重鏈ⅡX（myosin heavy chainⅡX，MyHCⅡX）作為目的基因，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因，引物由艾博生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，基因序列設(shè)計引物見表2。

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Primer sequences used for q RT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗相對定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法[18]進行計算，原始數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2020進行初步處理，采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件中One-way ANOVA進行方差分析和顯著性檢驗，所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑藏羊不同部位肌纖維的相關(guān)指標(biāo)分析

肌纖維直徑分析結(jié)果如表3所示。黑藏羊背最長?。↙D）和臂三頭?。˙F）中ⅡA型、ⅡB型肌纖維直徑顯著低于股二頭?。═F）（P<0.05），而背最長?。↙D）和臂三頭?。˙F）中ⅡA型、ⅡB型肌纖維差異不明顯（P>0.05）。不同部位肌肉間Ⅰ型肌纖維直徑無顯著差異（P>0.05）。

表3 黑藏羊不同部位肌纖維直徑的比較Table 3 Comparison of muscle fiber diameter in different parts of black Tibetan sheep μm

肌纖維橫截面積分析結(jié)果如表4所示。黑藏羊股二頭?。═F）中Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型肌纖維橫截面積顯著高于背最長?。↙D）（P<0.05），但與臂三頭?。˙F）中Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維橫截面積差異不顯著（P>0.05）。

表4 黑藏羊不同部位肌纖維橫截面積的比較Table 4 Comparison of cross-sectional areas of muscle fibers in different parts of black Tibetan sheep μm2

肌纖維密度分析結(jié)果如表5所示。黑藏羊Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維密度表現(xiàn)為：背最長?。↙D）>臂三頭肌（BF）>股二頭?。═F），但都差異不顯著（P>0.05）。

表5 黑藏羊不同部位肌纖維密度的比較Table 5 Comparison of muscle fiber density in different parts of black Tibetan sheep N·μm-2

肌纖維數(shù)量比例分析結(jié)果如表6所示。背最長肌（LD）中Ⅰ型肌纖維數(shù)量比例為12.55%，分別比臂三頭?。˙F）、股二頭?。═F）高出了0.21%和0.63%，但各組間都差異不顯著（P>0.05）。股二頭?。═F）中ⅡA型肌纖維數(shù)量比例顯著低于背最長?。↙D）（P<0.05），較臂三頭?。˙F）差異不顯著（P>0.05）。不同部位肌肉間ⅡB型肌纖維數(shù)量比例差異不顯著（P>0.05）。

表6 黑藏羊不同部位肌纖維數(shù)量比例Table 6 Muscle fiber quantity proportion of black Tibetan sheep in different parts %

肌纖維面積比例分析結(jié)果如表7所示。黑藏羊Ⅰ型肌纖維面積比例以背最長肌（LD）中最高，分別比臂三頭肌 （BF）和股二頭?。═F）高于1.64%、2.48%，其中背最長?。↙D）與股二頭?。═F）差異顯著（P<0.05）。不同部位肌肉間ⅡA型和ⅡB型肌纖維面積比例差異不顯著（P>0.05）。

表7 黑藏羊不同部位肌纖維面積比例Table 7 Muscle fiber area ratio of black Tibetan sheep in different parts %

2 黑藏羊不同部位肌肉相關(guān)基因的表達(dá)

不同部位肌肉中MyHCs基因的表達(dá)量結(jié)果如圖1所示。背最長肌MyHCⅡA基因的表達(dá)量高于臂三頭肌、股二頭肌，其中背最長肌與股二頭肌間差異顯著（P<0.05）。MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表達(dá)量表現(xiàn)為背最長肌<臂三頭肌<股二頭肌（P>0.05），而MyHCⅠ基因的表達(dá)量則相反（P>0.05）。由此可見，黑藏羊MyHCⅡA基因的表達(dá)量在不同部位肌肉中存在較大差異。

圖1 黑藏羊不同部位肌肉中MyHCs基因的表達(dá)量（n=5）Figure 1 Expression of MyHCs gene in different parts of black Tibetan sheep

3 討論

肌纖維類型組成與其肉質(zhì)性狀密切相關(guān)[19]。影響骨骼肌中肌纖維組織學(xué)特性的因素有許多，如年齡、品種、性別、激素、活動量以及飼糧類型等，其中部位也是一個重要方面[20]。諸多試驗研究證實，不同部位肌肉中肌纖維類型組成通常存在較大的差異[21-23]。因此，若能了解動物肌肉中肌纖維類型分布規(guī)律對于研究機體生長、發(fā)育、代謝以及肉質(zhì)特性均具有重要的意義[24]。在豬上研究表明[25]，肌肉的嫩度、色澤與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維比例呈正相關(guān)，但與ⅡB型肌纖維比例呈負(fù)相關(guān)。在西門塔爾公牛上試驗發(fā)現(xiàn)[26]，肌纖維特性影響肉品質(zhì)，特別是肌肉的質(zhì)構(gòu)特性，提高Ⅰ型纖維比例和降低ⅡB型纖維比例能夠改善肉質(zhì)嫩度。侯艷茹等[27]曾報道稱，與舍飼相比，放牧飼養(yǎng)能夠通過提高AMPKα2的mRNA相對表達(dá)量，增強機體線粒體生物合成水平和氧化代謝能力，促使肌纖維類型由酵解型（ⅡB型+ⅡX型）向氧化型（Ⅰ型+ⅡA型）轉(zhuǎn)化，繼而改善肌肉品質(zhì)。本研究利用ATPase堿孵育法對黑藏羊不同部位肌肉肌纖維類型組成進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同部位肌肉中均檢測到Ⅰ、ⅡA和ⅡB 3種肌纖維類型，背最長肌氧化型肌纖維數(shù)量比例>臂三頭肌氧化型肌纖維數(shù)量比例>股二頭肌氧化型肌纖維數(shù)量比例，這與上述人員研究結(jié)果基本類似。說明肌肉中氧化性肌纖維所占比例越高，肌肉品質(zhì)越好，而酵解型肌纖維則相反。

肌纖維類型轉(zhuǎn)化與MyHCs基因表達(dá)對肉品質(zhì)的調(diào)控具有重要作用[28]。尹麗卿等[29]試驗表明，蘇尼特羊背最長肌、股二頭肌及臂三頭肌的MyHCⅠ基因表達(dá)量與剪切力值均呈負(fù)相關(guān)，而MyHCⅡB和MyHCⅡX基因表達(dá)量與剪切力值呈正相關(guān)，MyHC-ⅡA基因表達(dá)量和a*值呈顯著正相關(guān)。侯普馨等[30]進一步證實，MyHCⅠ和MyHCⅡA基因mRNA相對表達(dá)量均與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維數(shù)量比例和面積比例呈正相關(guān)；MyHCⅡB基因和MyHCⅡX基因mRNA相對表達(dá)量均與ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例和面積比例呈正相關(guān)。由此可知，MyHCs基因表達(dá)量與ATPase組織化學(xué)染色法對肌纖維的分型結(jié)果基本都是一致的。而本試驗通過RT-qPCR技術(shù)對與黑藏羊肌纖維中MyHCs的基因表達(dá)量進行檢測，發(fā)現(xiàn)背最長肌MyHCⅡA基因的表達(dá)量高于臂三頭肌、股二頭肌，其中背最長肌與股二頭肌間差異明顯。表明不同部位肌肉中MyHCs基因表達(dá)水平存在一定的差異性。提示黑藏羊的肌纖維特性可以作為衡量不同肌肉部位品質(zhì)的重要指標(biāo)，如何提高不同部位肌肉中氧化性（Ⅰ型+ⅡA型）肌纖維的所占比例來改善羊肉品質(zhì)是團隊未來研究的重要方向。

4 結(jié)論

綜述，在相同舍飼條件下，黑藏羊不同部位的肌纖維組織特性存在較大的差異，整體考慮，黑藏羊背最長肌的肉質(zhì)最好，其次是臂三頭肌，最后為股二頭肌。這為今后肉塊分割增值技術(shù)和等級評價體系的建立提供理論依據(jù)。