石 馨,惠 明,田 青,黃繼紅

(河南工業(yè)大學 生物工程學院,河南 鄭州 450001)

隨著社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展,人們對生活質(zhì)量的要求日益提高,消費者越來越追求天然的產(chǎn)品。在食品工業(yè)中,利用生物手段生產(chǎn)風味物質(zhì)或改善食品原料風味將是未來發(fā)展的主流趨勢。酯酶,即通常意義上的羧酸酯酶,能夠催化酯鍵合成和水解,是一類極具潛力的酶。酯酶催化酯合成時,催化酸的羧基和醇的羥基脫水縮合生成酯類和其他風味物質(zhì);酯酶催化水解時,催化酯鍵產(chǎn)生醇類和脂肪酸類物質(zhì)[1]。酯酶廣泛存在于動物、植物和微生物中,可以作為生物催化劑用于制藥工業(yè)、化學工業(yè)、食品工業(yè)和乳制品工業(yè)等領(lǐng)域[2-3],其中一些酯酶還有助于食品風味的產(chǎn)生,尤其對白酒有增香作用[4]。

1 酯酶的種類

根據(jù)酶學國際生物化學和分子生物學協(xié)會的規(guī)定,酯酶屬于水解酶的亞組1(EC3.1),按照水解酯鍵的不同類型再進一步分為亞型(EC3.1.1.1)。通常意義上的羧酸酯酶,主要指水解羧基類酯,共有20種(從EC3.1.1.1到EC3.1.1.20)。根據(jù)酯酶的底物特異性不同[5],可將其分為非特異酯酶和特異性酯酶。非特異性酶如羧酸酯水解酶,以脂肪族和芳香族醇為底物,可以作用于乙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三丁酸酯和乙酸苯酯等,特異性酯酶又可分為醇特異性和酸特異性。醇通常是一元醇或多元醇、脂肪族醇或芳香族醇,酸通常是有機酸或無機酸。酯酶和脂肪酶雖然都是可以作用于酯鍵的酶,但二者最主要的區(qū)別就是底物特異性不同,酯酶傾向于水解短鏈底物(碳原子數(shù)<10),脂肪酶則主要作用于長鏈底物(碳原子數(shù)>10)。根據(jù)來源不同[6-7],可將酯酶分為動物源酯酶、植物源酯酶和微生物酯酶,因微生物具有易培養(yǎng)、周期短和不易受環(huán)境氣候的影響等優(yōu)勢,所以關(guān)于微生物酯酶的研究相對較多[8]。自然界中能產(chǎn)生酯酶的微生物資源十分豐富,從分類上看主要有真菌、細菌以及個別放線菌,主要菌種如表1所示。

表1 部分產(chǎn)酯酶菌種

2 酯化作用中酯酶的催化特性

2.1 反應(yīng)介質(zhì)的影響

根據(jù)目前的研究結(jié)果,非極性有機溶劑更適合酯酶的酯化反應(yīng)[9],溶劑的存在會使反應(yīng)平衡轉(zhuǎn)向酯生成的方向,盡可能地使酯完全轉(zhuǎn)移到有機相中[10]。疏水性溶劑作為酶反應(yīng)介質(zhì)通常優(yōu)于親水性溶劑,因為后者更容易從酶分子中剝離緊密結(jié)合的水,這也是影響催化活性至關(guān)重要的因素。同時,由于疏水性溶劑對酶基本呈惰性以及酶在脫水狀態(tài)下的構(gòu)象呈剛性,不會導致水溶液中的酶發(fā)生不可逆失活的普遍共價反應(yīng),因此酶在無水有機溶劑中具有可預(yù)測的極端耐熱性[11]。

2.2 酶的用量和反應(yīng)條件的影響

在反應(yīng)體系中,酶的用量并非越多越好。如果反應(yīng)體系中酶量很少,底物質(zhì)量濃度足夠高,增加用酶量會使反應(yīng)速度加快;如果酶足夠多,再增加用酶量,不僅不會提高催化反應(yīng)速度,而且會產(chǎn)生一些弊端。比如過高的酶量會使溶液黏度增加,妨礙底物擴散,從而降低酯化反應(yīng)速度;在有機相中,酶量過多,會導致進入酶的活性部位的底物缺乏,并且在較高的酶質(zhì)量濃度下生物催化劑的均勻性難以保持,因此產(chǎn)量不會顯著增加[12]。酯酶的最適反應(yīng)條件與反應(yīng)介質(zhì)有關(guān),在有機相和水相中不同。有機相中,酶的熱穩(wěn)定性有所提高,所以酯酶催化溫度一般比在水相中高一些。

3 酯酶結(jié)構(gòu)及催化機理

目前酯酶蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到初步闡明,屬于α/β水解酶家族,其折疊示意如圖1所示。由于其結(jié)構(gòu)特殊,使其具有了許多生物學功能,比如水解、病原體防御和能量代謝等。大多數(shù)的酯酶在三維結(jié)構(gòu)中都具有特征性的α/β水解酶折疊,即α螺旋和β折疊。盡管其序列具有多樣性,但以絲氨酸(Ser)為活性位點、以組氨酸、谷氨酸或是天冬氨酸組成(Ser-His-Asp/Glu)的催化三聯(lián)體和五肽結(jié)構(gòu)(Gly-X-Ser-X-Gly)在大多數(shù)情況下是保守穩(wěn)定的[13],主要是因為α/β水解酶的折疊結(jié)構(gòu)為脂肪酶的活性位點提供了一個穩(wěn)定的支架[14-15]。在蛋白質(zhì)二級水平上,不同微生物脂肪酶的結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在α螺旋和β折疊的數(shù)量、α螺旋的空間分布和β折疊扭曲角度的差異[16]。

圖1 α/β水解酶折疊示意圖Fig.1 Schematic presentation of the α/β-hydrolase fold

酯酶的水解通過2步完成:首先形成一個?；拿钢虚g體,通過一個質(zhì)子從絲氨酸轉(zhuǎn)移到組氨酸,從而使絲氨酸羥基變得更具親核性,組氨酸和谷氨酸或是天冬氨酸之間形成氫鍵而變得穩(wěn)定,由底物與具有活性的絲氨酸結(jié)合,生成一個穩(wěn)定的四面體中間體,隨后此中間體解體形成?；笍秃衔?此過程中釋放絲氨酸和底物中的乙醇;然后被水分子激活組氨酸攻擊?；鶑秃衔?重復第一步并釋放底物中酸的部分,被保留下的絲氨酸殘基為谷氨酸的空間位置的確定提高結(jié)構(gòu)支持,從而穩(wěn)定了該催化三聯(lián)體。脂肪酶和酯酶雖然都作用于酯鍵,但二者的區(qū)別在于界面活化現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)分析表明這種界面活化是因為一個疏水結(jié)構(gòu)域覆蓋了脂肪酶的活性部位,而酯酶不存在這種現(xiàn)象,酯酶往往優(yōu)先水解簡單酯,如乙酸乙酯,通常只水解短于六碳的脂肪酸的甘油三酯[17-19]。

4 酯酶在風味合成中的應(yīng)用

風味的形成是一個生化過程,無論是通過正常新陳代謝積累的風味物質(zhì),還是通過細胞破壞產(chǎn)生的風味,都要有2個先決條件:1) 形成風味物質(zhì)的底物;2) 催化風味物質(zhì)形成過程中的酶系。短鏈脂肪酸酯由于其典型的果味氣味和高揮發(fā)性而被廣泛用于食品、飲料、化妝品和制藥工業(yè)中[20-21]。目前,生物酶法是合成風味的一種新方法,通過生物合成生成的產(chǎn)物為天然產(chǎn)物,更容易被大眾接受,這種方法被認為是有望成為工業(yè)化生產(chǎn)的一條途徑[22]。而目前大多數(shù)的風味化合物都是由化學合成或從天然資源中提取得到,天然提取的香料酯提取量較少,因此應(yīng)用于工業(yè)用途上往往過于昂貴。商業(yè)上使用的低分子酯通常是直接通過酸醇酯化生成,現(xiàn)已生成多種脂肪族和芳香族的香味酯,如乙酸乙酯、丁酸異戊和月桂酸丁酯。

1972年,美國學者利用酯酶給黃油增香,將黃油乳化后加酯酶保溫催化,此時黃油可以釋放脂肪酸,獲得的酯化液香氣是未酯化時的150倍[23]。短鏈特異性酯酶和廣譜脂肪酶可以使乳脂產(chǎn)生各種風味物質(zhì)。各種脂肪酶系統(tǒng)的范圍和可能的組合尚未被充分探索,脂肪分解技術(shù)的未來進展極大可能發(fā)生于更廣泛的脂肪基質(zhì)。酯酶技術(shù)中的2個主要變量底物組成和酶的特異性可以相互作用,增加潛在的風味特征[24]。比如,酯酶活性對乳酪中香氣物質(zhì)的釋放起著至關(guān)重要的作用,乳酪香氣主要取決于脂肪酶的活性,將甘油三酯分解為甘油和脂肪酸。游離脂肪酸是脂肪分解的主要產(chǎn)物,可以對奶酪質(zhì)地產(chǎn)生影響,有助于直接和間接地表征許多奶酪的風味,這些物質(zhì)通常也是許多合成芳香族化合物的前體物質(zhì)[25]。宋云花[26]篩選出一株高產(chǎn)丁酸乙酯的乳酸菌,該菌所產(chǎn)酯酶可以促進干酪成熟過程中的三丁酸甘油酯和乙醇形成丁酸乙酯,顯著增強干酪的水果風味。

5 酯酶對白酒產(chǎn)酯的影響

近年來,不少學者利用酯酶技術(shù)來提高白酒中風味物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù),效果十分顯著,在酒廠中也得以使用。在白酒的生產(chǎn)中,酯類物質(zhì)是區(qū)分白酒香型的重要因素,是白酒香氣的主體香味成分。酯類是濃香型白酒中質(zhì)量分數(shù)最高的芳香物質(zhì),約占60%。其中,己酸乙酯是構(gòu)成濃香型主體香的主要物質(zhì),尤其突出己酸乙酯的氣味特征[27]。濃香型白酒在窖泥地窖發(fā)酵過程中獲得了獨特的風味,窖泥中的微生物通過代謝活動產(chǎn)生的小分子物質(zhì)是這些風味形成的關(guān)鍵前體[28],不同的微生物群落也會影響風味物質(zhì)的形成。

通過醇酸之間的酯化反應(yīng)得到白酒中的酯類物質(zhì),主要有2種方式:

1) 由發(fā)酵過程中的微生物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物形成。比如酵母菌中酯類形成途徑中主要有乙醇或高級醇、脂肪酸、輔酶A和?；D(zhuǎn)移酶等物質(zhì)參與[29-30]。在此過程中,脂肪酸和輔酶A結(jié)合而被活化,形成相應(yīng)的?；o酶A才能和乙醇合成相應(yīng)的乙酯,醇和?；o酶A再在醇?；D(zhuǎn)移酶的作用下生物催化形成相應(yīng)的酯,在白酒發(fā)酵過程中,酵母菌作為完整的發(fā)酵微生物不僅起著主導利用,而且對酒體風格及品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[31],酵母代謝產(chǎn)酯的途徑為

2) 通過游離的酸醇分子在酶類物質(zhì)的催化下發(fā)生反應(yīng)。白酒發(fā)酵過程中添加的酒曲,利用酒曲中酯酶的作用催化而生成相應(yīng)的酯類[32]。液體發(fā)酵時,酯酶可以水解水相中的脂肪,可將酒醅中的脂肪水解成甘油和脂肪酸,脂肪酸與乙醇酯化生成油酸乙酯、亞油酸乙酯等高級脂肪酸。固態(tài)發(fā)酵條件下,酯酶催化己酸、乳酸和丁酸等小分子酸與乙醇作用,生成相應(yīng)的己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等風味物質(zhì)。大曲在白酒發(fā)酵過程中提供了重要的微生物來源[33],是影響白酒的質(zhì)量和風格的關(guān)鍵因素[34-35]。

白酒風味的形成受多種因素影響,比如:發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可影響酯的生成量;發(fā)酵谷物中存在的微生物及其分泌的酶對酯的合成也產(chǎn)生影響。在發(fā)酵過程中,發(fā)酵谷物中微生物產(chǎn)生的酶將蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等高分子量物質(zhì)分別分解為氨基酸、低聚糖和脂肪酸等低分子量物質(zhì)。微生物利用小分子作為營養(yǎng)物質(zhì),為風味物質(zhì)提供豐富的前體物質(zhì)。酶的活性不僅影響發(fā)酵糧中各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,而且直接影響風味物質(zhì)的種類和數(shù)量,對白酒的品質(zhì)有很大影響。例如,在發(fā)酵過程中,酯酶直接催化乙酸和丙酸與乙醇的酯化反應(yīng),合成乙酸乙酯和丙酸乙酯[36]。根據(jù)吳華昌等[37]的研究,提高發(fā)酵糧中脂肪酶活性,可提高酒中總酯質(zhì)量分數(shù),在發(fā)酵糧中添加纖維素酶可以提高酯的質(zhì)量分數(shù),尤其是乙酸乙酯。由于自然環(huán)境的差異,不同地區(qū)的白酒風味存在明顯差異,不同微生物的特殊作用會影響發(fā)酵谷物中的酶系組成,從而影響酯的形成[38],同時酶活性和前體物質(zhì)的質(zhì)量濃度也是影響酯生產(chǎn)的2個關(guān)鍵因素[39]。

6 結(jié) 論

與其他國家相比,我國對酯酶的研究和開發(fā)起步較晚,可用于商業(yè)化的酯酶種類較少,產(chǎn)酯酶菌株的分離純化難度大,生產(chǎn)效率低。隨著基因工程、宏基因組文庫的建立與發(fā)展,對于酯酶的研究應(yīng)逐步偏向分子層面,比如酯酶分子的純化及高效工程菌株的構(gòu)建。研究發(fā)現(xiàn):部分酯酶存在特殊性,需要進一步的研究和開發(fā),從而使酯酶的應(yīng)用范圍得到進一步的拓展。因此,篩選產(chǎn)酯酶菌株并將其應(yīng)用于食品工業(yè),達到提高產(chǎn)品感官品質(zhì)和經(jīng)濟價值的目的,以及應(yīng)用到釀酒工業(yè)中來改善白酒的品質(zhì)仍然具有廣泛的發(fā)展前景。