尹丹韓,趙奇琦,王紅青,方陳玉,林 捷,李高天,胡弘宇,陸晶芳,肖海龍

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院,浙江 杭州 310022;2.浙江省市場監(jiān)管乳及乳制品監(jiān)管技術(shù)重點實驗室(培育),浙江 杭州 310022)

腸道微生物是寄居在人類腸道內(nèi)微生物群落的總稱,它們作為動物的“第二基因組”與腸道環(huán)境共同構(gòu)成了一個巨大而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)[1]。小鼠和人類有著相似的腸道微生物組成,主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門等[2]。腸道微生物相當于一個器官,在代謝、免疫、內(nèi)分泌過程中扮演著重要的角色,并與機體的其他器官相互作用[3-7]。大量研究表明腸道微生物與代謝性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等具有一定的相關(guān)性[8-11]。

由于外界的環(huán)境影響和宿主自身狀況的變化,腸道微生物組成時刻發(fā)生變化。有學(xué)者認為膳食中的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類成分能影響腸道核心優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)和代謝[12-13]。Qi等[14]用不同種類的蛋白質(zhì)作為唯一的膳食蛋白配制日糧飼喂SD大鼠,發(fā)現(xiàn)不同種類的蛋白對大鼠腸道內(nèi)容物中的菌群結(jié)構(gòu)有顯著影響。隨著人們對健康關(guān)注度的不斷提升,蛋白質(zhì)、氨基酸類產(chǎn)品的消耗量也在日益上升[15-16]。由于富含豐富蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪和多種維生素,羊乳廣受老百姓的喜愛,食用羊乳被認為有很多潛在的健康益處,包括防止感染、促進腸道上皮細胞增殖、改善胃腸道疾病、提高骨密度和血液中維生素A、Ca、煙酸、硫胺素和核黃素水平[17-18]。雖然目前已經(jīng)有不少關(guān)于羊乳營養(yǎng)物質(zhì)及其生物活性方面的研究,但對食用羊乳對腸道微生物影響的研究還很少。筆者以小鼠為研究對象,通過高通量測序技術(shù)探究攝入羊乳后小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化,為羊乳對宿主代謝的影響研究提供依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物為36只6周齡SPF級ICR小鼠(動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2014-0001),雌雄各半,體重均為19～20 g,購自浙江省實驗動物中心。將36只小鼠隨機分成3組,每組3個重復(fù),每個重復(fù)4只小鼠。3組分別為對照組A(A1,A2,A3),試驗組B(B1,B2,B3)和試驗組C(C1,C2,C3),每組12只,雌雄各半。對照組A采用基礎(chǔ)飼料和蒸餾水喂養(yǎng),試驗組采用的飼料與對照A組相同,試驗組在蒸餾水中加入液態(tài)羊乳(蛋白質(zhì)量濃度為3 g/mL),試驗組B,C中羊乳加入的體積分數(shù)分別為30%,60%。喂養(yǎng)周期為20周。

Co60輻照試驗顆粒鼠糧(舒克貝塔1010009),購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司;羊乳,購自本地羊乳生產(chǎn)企業(yè);所有器具、飼料均經(jīng)過滅菌處理;飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替;室內(nèi)溫度為22～25 ℃;濕度為55%～65%;實驗期間小鼠自由采食、進水;保持墊料干燥。實驗中所有操作嚴格按照GB 14923—2010《實驗動物管理條例》執(zhí)行。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試 劑

Stool Genomic DNA kit糞便基因組DNA提取試劑盒,北京康為世紀生物科技有限公司;引物16S rRNA基因V3-V4區(qū)特異性引物341F/806R,上海生工生物公司;高保真酶ExTaq Master Mix,TaKaRa公司;GeneJET Gel Extraction Kit,Thermo Scientific公司;瓊脂糖粉末,北京沃比森科技公司;建庫與上機測序所用試劑MiSeq PE300測序平臺配套試劑盒,Illumina公司。

1.2.2 儀 器

微量移液器,Eppendorf公司;生化培養(yǎng)箱,Binder公司;厭氧工作站,Ruskinn公司;普通PCR儀,Bio-rad公司;電泳儀,Bio-rad公司;液氮罐,Thermo公司;凝膠成像儀,Bio-rad公司;Nano Drop 2000c,Thermo Scientific公司;HiSeqTM 2500測序平臺,Illumina公司。

1.3 樣本采集

于第20周采集小鼠直腸部位糞便,同一重復(fù)的4只小鼠糞便混合均勻后置于無菌離心管中,做上標記,共9個樣本。樣本采集完后立即測試分析,無法立即測試分析的樣本迅速置于液氮中,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠腸道高通量測序分析

取0.2 g糞便或腸道內(nèi)容物樣品,采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取小鼠腸道微生物的基因組DNA,提取方法按說明書操作,DNA濃度用Nanodrop儀器檢測。16S rDNA分析選取相對保守的V3-V4區(qū)域,對V3-V4區(qū)進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后割膠回收并純化,然后用BioTek酶標儀對樣本進行定量。添加標記后采用Illumina MiSeq平臺進行測序,測序堿基準確率為99%,且不容許有模糊堿基。將高通量測序結(jié)果運用Qiime,Pear軟件進行拼接、過濾,去除嵌合體,得到有效序列。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效標簽進行聚類,默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為操作分類單元(OTU)。篩選OTU中出現(xiàn)頻次最高的序列作為OTU的代表序列。對OTU代表序列進行物種注釋,用Uclust方法與Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)進行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)。使用Qiime軟件計算各指數(shù),其中Chao 1指數(shù)反映菌群豐度(Community richness),Shannon指數(shù)反映菌群多樣性(Community diversity),Goods-coverage指數(shù)(測序深度指數(shù))反映測序深度。使用R軟件對腸道菌群豐富度和多樣性進行Tukey檢驗與分析,繪制無度量多維標定法(Non-metric multi-dimensional scaling,NMDS)分析圖。使用LEfSe軟件(Linear discriminant analysis effect size,線性判別分析)進行組間差異性分析。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 小鼠腸道菌群測序結(jié)果

對9份小鼠糞樣進行測序,質(zhì)控后獲得有效序列416 491條,對所有樣品的有效序列進行聚類,以97%的一致性將序列聚類成為OTU。序列共聚類成2 811個OTU,平均每個樣本312個OTU。9個樣本的測序深度指數(shù)均超過99.75%,表示樣品中99.75%以上的序列均被測出,測序結(jié)果及alpha多樣性分析如表1所示,測序結(jié)果代表了樣品中微生物的真實情況。

表1 測序結(jié)果及alpha多樣性分析

2.2 小鼠腸道微生物群落性alpha多樣性分析

為了研究對照組A與試驗組B,C小鼠腸道微生物群落的豐富度和多樣性,對各組別alpha多樣性指數(shù)進行了計算和Tukey檢驗(表1)。由表1可知:Chao 1指數(shù)在對照組A與試驗組B,對照組A與試驗組C之間均存在顯著差異,在試驗組B,C之間差異不明顯,試驗組的微生物群落豐富度均顯著高于對照組;Shannon指數(shù)在對照組A與試驗組B之間均無顯著差異,在對照組A與試驗組C之間存在顯著差異,在試驗組B,C之間存在顯著差異,試驗組C的微生物群落多樣性顯著高于對照組A與試驗組B,對照組A與試驗組B之間的微生物群落多樣性無明顯差異。

2.3 小鼠腸道微生物群落NMDS分析

為了考察試驗組B,C和對照組A之間小鼠腸道微生物群落組成的差異,從OTU水平進行NMDS分析(Non-metric multidimensional scaling,非度量多維尺度分析),用脅強系數(shù)(Stress)來衡量NMDS分析結(jié)果的優(yōu)劣,判斷該圖形是否能準確反映數(shù)據(jù)排序的真實分布。筆者得到的Stress=0.01<0.05,說明結(jié)果具有很好的代表性。不同組別樣品的NMDS分析如圖1所示,由圖1可知:試驗組B,C和對照組A能明顯區(qū)分開,試驗組B,C間的距離相對較近,試驗組C和對照組A間的距離明顯大于試驗組B和對照組A間的距離。因此,與對照組相比,羊乳的添加改變了試驗組小鼠腸道微生物的結(jié)構(gòu),高劑量組的改變比低劑量組明顯。

圖1 不同組別樣品的NMDS分析Fig.1 NMDS analysis on different groups of sample

2.3 羊乳對小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 門水平上小鼠腸道微生物相對豐度

依據(jù)物種注釋結(jié)果,選取每組樣品在門分類水平上最大豐度排名前5位的物種,以柱型圖展示對小鼠腸道微生物組成的分析結(jié)果,門水平上不同組別小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相對豐度比較如表2所示。在門分類水平上最大豐度排名前5位的物種包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和Saccharibacteria菌門。各組樣品優(yōu)勢菌均由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)組成,三者豐度和大于95%。

表2 門水平上不同組別小鼠腸道微生物 群落結(jié)構(gòu)相對豐度

2.3.2 屬水平上小鼠腸道微生物相對豐度

依據(jù)物種注釋結(jié)果,選取每組樣品在門分類水平上最大豐度排名前15位的物種,以柱型圖展示對小鼠腸道微生物組成的分析結(jié)果,屬水平上不同組別小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相對豐度比較如表3所示。對照組A小鼠腸道微生物群落中平均豐度大于1%的有10個屬,分別為乳酸菌屬(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、擬桿菌屬(Bacteroides),另枝菌屬(Alistipes)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)、勞特氏菌屬(Blautia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_UCG-014)和Allobaculum菌屬。試驗組小鼠腸道微生物群落中平均豐度大于1%的有12個屬,兩組的優(yōu)勢菌種類一致,分別為Lactobacillus,Lachnospiraceae_NK4A136_group,Desulfovibrio,Bacteroides,Alistipes,Clostridium_sensu_stricto_1,Prevotella_9,Blautia,Allobaculum,Alloprevotella,Ruminococcaceae_UCG-014和Faecalibacterium屬。

2.3.3 組間腸道微生物群落差異性分析

利用LEfSe分析(Linear discriminant analysis effect size)研究試驗組和對照組小鼠腸道微生物群落的組間差異性。LEfSe是一種發(fā)現(xiàn)和解釋高緯度數(shù)據(jù)生物標識(分類單元、通路和基因)的分析工具,可以實現(xiàn)2個或者多個分組之間的比較,同時也可進行分組內(nèi)部亞組之間的比較,從而找到組間在豐度上有顯著差異的物種(即Biomaker)。該分析首先使用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢測不同分組間豐度差異顯著的物種,然后使用Wilcoxon秩和檢驗上一步的差異物種在不同組間子分組中的差異一致性,最后采用LDA分析(Linear discriminant analysis)對每個組分(物種)豐度對差異效果影響力(LDA分值)進行估算。LDA值分布柱狀圖中展示了不同組中豐度差異顯著的物種,不同顏色代表不同分組,柱狀圖的長度代表差異物種的貢獻度大小(LDA score),筆者設(shè)定篩選參數(shù)為P<0.05,LDA>4,小鼠腸道微生物群落的LEfSe分析如圖2所示。與對照組A相比,試驗組B小鼠腸道微生物群落的Bacteroidetes,Alloprevotella,Lactobacillus和Prevotella_9的相對豐度較高,Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroides,Alistipes和Desulfovibrio的相對豐度較低,它們均具有統(tǒng)計學(xué)意義;與對照組A相比,試驗組C小鼠腸道微生物群落的Bacteroidetes,Alloprevotella,Lactobacillus,Prevotella_9和Faecalibacterium的相對豐度較高,Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroides,Alistipes,Desulfovibrio,Allobaculum和Streptococcus的相對豐度較低,它們均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 小鼠腸道微生物群落的LEf S e分析Fig.2 LEfSe analysis of intestinal microbial community in mice

由圖2可知:所有樣本中Firmicutes和Bacteroidetes都是最主要的兩大門類,該結(jié)論與其他文獻的報道一致[19]。有研究發(fā)現(xiàn):Bacteroidetes是腸道內(nèi)糖和脂肪代謝的重要參與者[20],通過降低Firmicutes和Bacteroidetes的豐度比值,能有效預(yù)防輕度炎癥的發(fā)生,同時降低肥胖風(fēng)險,對宿主的健康有利[21-22]。與對照組相比,試驗組Bacteroidetes的相對豐度顯著提高,Firmicutes的相對豐度顯著下降,因此Firmicutes和Bacteroidetes的豐度比值顯著降低。研究結(jié)果表明攝入羊乳可增加小鼠腸道內(nèi)脂肪和糖的代謝能力。

有文獻報道,在對高脂飲食大鼠脂質(zhì)代謝的研究中發(fā)現(xiàn):Alloprevotella是短鏈脂肪酸的產(chǎn)生菌,在脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,與非酒精性脂肪酸性肝病、脂質(zhì)積累、脂質(zhì)代謝紊亂呈負相關(guān)[23]。因此,推測攝入羊乳可能對抗高脂血癥和降低脂質(zhì)代謝紊亂的風(fēng)險有一定的作用。Lactobacillus是一種公認的腸道益生菌,能抑制病原菌在腸道內(nèi)的定植,并可以產(chǎn)生保護性營養(yǎng)物質(zhì)以防止其他菌的遷移,起到穩(wěn)定腸道菌群的作用[24]。Faecalibacterium和Prevotella_9菌屬可以通過發(fā)酵膳食纖維合成短鏈脂肪酸產(chǎn)丙酸、丁酸,促進腸道合成黏蛋白,修復(fù)腸道黏膜,維持腸道微平衡,促進胰島素響應(yīng)[25]。Bacteroides中某些種被認為可能會影響人類和嚙齒類動物的神經(jīng)炎癥信號及大腦功能[26]。Streptococcus菌大部分屬于條件致病菌,被認為對宿主有害。在已知的研究中,除了部分細菌有相關(guān)功能報道,很多細菌功能仍然不明確。

3 結(jié) 論

基于高通量測序技術(shù)進行了微生物多樣性分析,比較了對照組A、試驗組B,C的微生物群落。alpha多樣性分析顯示對照組A的微生物多樣性顯著低于試驗組B,C;腸道菌群NMDS分析結(jié)果表明:試驗組的腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化,攝入羊乳對小鼠的腸道菌群產(chǎn)生了影響,攝入劑量不同,變化會有一些細微差異。攝入羊乳的小鼠腸道中Bacteroidetes,Alloprevotella,Lactobacillus,Prevotella_9和Faecalibacterium的相對豐度顯著提高,Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroides,Alistipes,Desulfovibrio,Allobaculum和Streptococcus的相對豐度顯著降低。總之,羊乳的攝入增加了小鼠腸道微生物多樣性,一定程度上改善了小鼠腸道環(huán)境。