周 靜， 張德新

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 檢驗(yàn)學(xué)院， 武漢 430065

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)受基因、代謝、環(huán)境和腸道菌群的影響，是一種多病因參與的代謝性疾病，包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)以及NASH相關(guān)肝硬化及其肝細(xì)胞癌[1]。研究[2]報(bào)道，到2030年NAFLD總?cè)藬?shù)預(yù)計(jì)將增長(zhǎng)18.3%，達(dá)到1.009億，患病率為28.4%。氧化應(yīng)激在NAFLD進(jìn)展中扮演著重要角色，可激活多種轉(zhuǎn)錄因子，包括活化核因子κB(NF-κB)、激活蛋白1、p53、缺氧誘導(dǎo)因子1α、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，β-catenin/Wnt和核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)等，導(dǎo)致多種基因表達(dá)[3]。這促進(jìn)肝星狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞活化，加重NAFLD的炎癥、纖維化和凋亡[4]。目前，尚無批準(zhǔn)用于NAFLD的藥物治療方案[5]。研究[6]表明，中藥在抗氧化應(yīng)激防治NAFLD方面取得了一定成果。本文就近年來從氧化應(yīng)激途徑對(duì)中藥活性成分抗NAFLD的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，以了解氧化應(yīng)激在NAFLD的作用機(jī)制以及中藥活性成分抗氧化應(yīng)激機(jī)理，為預(yù)防和控制NAFLD提供科學(xué)依據(jù)。

1 基于氧化應(yīng)激對(duì)NAFLD的機(jī)制探討

氧化應(yīng)激由體內(nèi)自由基、反應(yīng)性代謝產(chǎn)物如活性氧(ROS)/活性氮(RNS)產(chǎn)生以及抗氧化保護(hù)機(jī)制之間失衡導(dǎo)致，偏向于氧化[3]。多項(xiàng)研究表明線粒體功能紊亂[7]、細(xì)胞色素P450酶2E1(CYP2E1)活性升高[8]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9]、氧化酶家族上調(diào)[10]、鐵超載[11]引起的氧化應(yīng)激與NAFLD有關(guān)。

1.1 線粒體功能紊亂 Sim?es等[7]發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙、ROS過度生成、氧化應(yīng)激損傷等相互作用會(huì)促進(jìn)NAFLD的發(fā)生和發(fā)展。ROS主要來源于線粒體電子傳遞鏈，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，最終使得NAFLD發(fā)展的機(jī)制主要有：(1)飲食攝入或胰島素抵抗，線粒體脂肪酸β氧化增加，使電子傳遞鏈中電子通量增加，電子傳遞鏈產(chǎn)生的電子不通過細(xì)胞色素C而直接與氧反應(yīng)，使ROS增加[12]，導(dǎo)致線粒體DNA和蛋白亞基受損，進(jìn)而增加氧化應(yīng)激和對(duì)線粒體的氧化損傷，以此惡性循環(huán)[13]；(2)ROS也易氧化線粒體膜磷脂成分，如多不飽和脂肪酸使丙二醛 (malondialdehyde,MDA)和4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)水平升高[14]，從而抑制細(xì)胞色素C氧化酶，誘導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白2，最終導(dǎo)致線粒體功能異常[15]；(3)轉(zhuǎn)錄共激活因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC1α)表達(dá)減少，可能導(dǎo)致抗氧化失活[16]。

1.2 CYP2E1活性升高 NAFLD中ROS的另一個(gè)主要來源是CYP2E1，它是微粒體氧化系統(tǒng)的一種主要酶，可由乙醇、酮體、游離脂肪酸等誘導(dǎo)[17]。CYP2E1在催化生物轉(zhuǎn)化過程中會(huì)產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA、4-HNE等活性醛類物質(zhì)，ROS還可以攻擊核酸和蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)線粒體膜通透性，損害線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶，進(jìn)一步增加電子泄漏和ROS的形成，引起嚴(yán)重的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡[18]。Diesinger等[19]發(fā)現(xiàn)作為CYP2E1活性位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，ω-咪唑烷基衍生物 Ⅰ-ol和 Ⅰ-An部分呈劑量依賴性緩解NAFLD小鼠模型氧化應(yīng)激，可能成為治療NAFLD的一種新途徑。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 脂質(zhì)過載也會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，主要通過激活未折疊蛋白反應(yīng)途徑[20]。未折疊蛋白反應(yīng)通過激活特定下游信號(hào)通路使得ROS生成增加，還可通過需要肌醇的信號(hào)蛋白1(inositol-requiring signaling protein 1,IRE1)途徑激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)使ROS升高，而IRE1可抑制胰島素受體底物活性，加重胰島素抵抗[21]。飽和脂肪酸也會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存的破壞，這可以通過形成細(xì)胞色素C的通透性轉(zhuǎn)換孔作用于線粒體，從而增加ROS和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。Xu等[23]發(fā)現(xiàn)miR-26a過表達(dá)可降低衣霉素或毒胡蘿卜素處理的NAFLD模型細(xì)胞磷酸化真核翻譯起始因子2亞基α(p-eIF2α)、IRE1α和C/EBP 同源蛋白(CHOP)表達(dá)，與高脂飲食喂養(yǎng)的野生型(WT)小鼠相比，肝臟特異性miR-26a轉(zhuǎn)基因小鼠中p-eIF2α、磷酸化PEK內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、結(jié)合免疫球蛋白、CHOP和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶降低，表明miR-26a缺乏加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NAFLD進(jìn)展。

1.4 氧化酶家族上調(diào) 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)在許多病理?xiàng)l件下都是ROS的主要來源，其中肝臟主要的活性氧產(chǎn)生氧化酶NOX1、NOX2(主要產(chǎn)超氧化物)和NOX4(主要產(chǎn)H2O2)[10]。且CYP2E1可以增強(qiáng)NOX活性，促進(jìn)ROS形成[14]。也有研究[24]發(fā)現(xiàn)NASH患者NOX2顯著上調(diào)，攝入黑巧克力(含可可多酚)2周會(huì)降低NASH患者血清可溶性NOX2衍生肽、異前列腺素和細(xì)胞角蛋白18水平，表明NOX2可能是對(duì)抗NASH的一個(gè)靶點(diǎn)。

1.5 鐵超載 鐵是生物必須的微量營(yíng)養(yǎng)素，一旦鐵過量，常蓄積在肝臟、心臟、內(nèi)分泌器官等。通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生ROS，引起臟器或組織的損傷，而肝臟鐵超載可能有助于大泡性脂肪變性的初始發(fā)展和進(jìn)展為NASH[25]。在約1/3的NAFLD患者中發(fā)現(xiàn)了肝臟的鐵蓄積[11]。鐵沉積于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)對(duì)肝臟以及心血管致命和非致命事件的綜合原因特異性危險(xiǎn)比(csHR)為2.4(95%CI:1.0～5.8,P=0.048)和3.2( 95%CI:1.2～8.2，P=0.015)，肝細(xì)胞/網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(HC/RES)混合鐵沉積模式csHR更高，為3.6(95%CI:1.4～9.5,P=0.010)。表明RES與不良結(jié)局相關(guān)，會(huì)增加總體死亡率和肝臟相關(guān)或心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[26]。分析其原因，RES鐵沉積更可能是全身和肝臟炎癥機(jī)制的指標(biāo)，從而推動(dòng)NAFLD的發(fā)展。

2 中藥活性成分抗NAFLD氧化應(yīng)激作用

近年來多種中藥活性成分被證明具有改善NAFLD的作用，主要包括黃酮類、多糖類、多酚類、生物堿類、三萜類、苷類等，多種中藥活性成分不僅有抗炎、抑菌、降脂、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等作用，還具有抗氧化的作用。下文將各中藥活性成分對(duì)NAFLD抗氧化作用進(jìn)行闡述，為后續(xù)中藥防治NAFLD提供參考。

2.1 黃酮類 Zhong等[27]發(fā)現(xiàn)黃芩苷給藥組能顯著降低高脂肪高膽固醇飲食(HFC)誘導(dǎo)的NAFLD小鼠體內(nèi)的MDA、4-HNE、8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)水平，明顯增加谷胱甘肽(glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平，黃芩苷抗氧化應(yīng)激作用可能與同時(shí)抑制CYP2E1和JNK的活化有關(guān)。Ou等[28]發(fā)現(xiàn)水飛薊賓治療可明顯減輕蛋氨酸及膽堿缺乏飲食(MCD)誘導(dǎo)的NASH小鼠模型的肝脂肪變性，降低模型組CYP2E1和4-HNE的組織水平，提高SOD水平，水飛薊賓在這項(xiàng)研究中顯示出抗氧化作用，與上調(diào)依賴于Nrf2的抗氧化劑基因谷氨酰半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(GCLM)，谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)，醌氧化還原酶1(NQO1)，血紅素加氧酶1(HMOX1)和谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)有關(guān)，表明水飛薊賓可能充當(dāng)新型Nrf2誘導(dǎo)劑。劉皎皎等[29]利用高脂飲食喂養(yǎng)雄性SD大鼠建立NAFLD模型，發(fā)現(xiàn)虎杖苷以劑量依賴方式提高大鼠肝臟SOD和GST水平，降低MDA水平，提示虎杖苷具有明顯的抗氧化作用，能有效抑制NAFLD大鼠模型肝臟脂質(zhì)過氧化。Porras等[30]發(fā)現(xiàn)槲皮素不僅能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝基因表達(dá)、降低CYP2E1的過度表達(dá)，還能逆轉(zhuǎn)腸道微生物失調(diào)、抑制內(nèi)毒素血癥介導(dǎo)的TLR-4-NF-κB的炎癥反應(yīng)、降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、CHOP表達(dá)。

2.2 多糖類 黃芪多糖能改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型肝損傷，降低MDA，提高血清總SOD活性，護(hù)肝作用優(yōu)于辛伐他汀組，具有抗氧化性[31]。舒濤等[32]發(fā)現(xiàn)玉米須多糖能夠明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠體質(zhì)量、TG、TC和ROS水平，能顯著升高miR-146a且下調(diào)NOX4的表達(dá)水平從而緩解肝臟脂肪累積以及氧化應(yīng)激損傷，表明玉米須多糖對(duì)NAFLD大鼠的保護(hù)作用與調(diào)控miR-146a/NOX4/ROS通路有關(guān)。Li等[33]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可顯著降低T2DM合并NAFLD小鼠的體質(zhì)量、MDA和TNFα水平，增加SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和Nrf2及下游靶基因HO-1的蛋白表達(dá)，表明靈芝多糖通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路，以減輕模型小鼠肝臟脂肪變性、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。郭怡瓊等[34]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠的TG、TC、MDA水平，升高HDL、SOD水平，枸杞多糖改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變性和降低氧化應(yīng)激損傷與上調(diào)PGC1α有關(guān)。

2.3 酚類 Gheibi等[35]通過檢測(cè)NAFLD模型大鼠血清TG、HDL、LDL以及肝臟MDA、SOD、GSH-Px、總抗氧化劑能力(total antioxidant capacity,TAC)、NO水平，發(fā)現(xiàn)與未治療組相比，姜黃素和去氧膽酸均可顯著降低血清NO、TAC和GSH-Px、SOD的水平，共同給藥組降低更加明顯，表明姜黃素單用和聯(lián)合去氧膽酸均能降低NAFLD肝臟脂肪變性，提高抗氧化能力，聯(lián)合使用效果更佳。也有學(xué)者[36]比較洛伐他汀，姜黃素、小檗堿在治療NAFLD中的作用，發(fā)現(xiàn)姜黃素、小檗堿均能降低模型小鼠的TG、TC、LDL、MDA水平，提高HDL、GSH-Px水平，且姜黃素聯(lián)用小檗堿對(duì)改善NAFLD大鼠氧化應(yīng)激效果優(yōu)于洛伐他汀。白藜蘆醇(10和20 μmol/L)可以降低HepG2細(xì)胞的脂肪變性，通過線粒體膜電位和染色發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇顯著降低了游離脂肪酸混合物處理HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激[37]。Xia等[38]發(fā)現(xiàn)綠茶多酚(200 mg/kg)干預(yù)能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型的空腹血糖、胰島素抵抗、肝臟脂肪以及TNFα、IL-6、MDA水平。相比之下，肝臟中的SOD升高。綜上，多酚類具有強(qiáng)大的抗氧化能力。

2.4 生物堿類 小檗堿干預(yù)降低了高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠血清TG、TC和LDL水平，增加了HDL水平，能逆轉(zhuǎn)模型小鼠SIRT3的下調(diào)并降低長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶(LCAD)脫乙?；?，將SIRT3敲除后，小檗堿這種有益作用顯著減弱，進(jìn)一步證明小檗堿通過激活 SIRT3 促進(jìn)LCAD脫乙酰化來促進(jìn)線粒體β氧化[39]。丁靜等[40]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠降低ROS、MDA表達(dá)，通過促進(jìn)NRf2核轉(zhuǎn)位和NRf2 mRNA表達(dá)而對(duì)NAFLD小鼠模型肝臟發(fā)揮保護(hù)作用。Chen等[41]發(fā)現(xiàn)川芎嗪可降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型MDA和ROS水平，提高GSHpX活性，辛伐他汀組提高了SOD和GSH-pX水平，MDA未增高，川芎嗪與辛伐他汀組都能通過抑制TNFα/(p-NF-κB)/ ROS信號(hào)通路而發(fā)揮對(duì)NAFLD小鼠肝臟的保護(hù)作用。費(fèi)雯婕等[42]發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿干預(yù)組與二甲雙胍組均能顯著降低NAFLD細(xì)胞模型MDA和ROS生成，提高了總SOD、GSH-Px活性，表明氧化苦參堿能提高HepG2細(xì)胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激損傷。另有學(xué)者[43]發(fā)現(xiàn)，荷葉堿治療能使高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型肝臟中的SOD和GSH-Px的活性以及磷脂酰膽堿和1-?；视土姿崮憠A的水平增加，而降低MDA水平和CYP2E1、CYP3A4和脂肪酸去飽和酶2的表達(dá)，表明荷葉堿抗氧化機(jī)制可能與抑制肝臟中CYP酶的表達(dá)有關(guān)，從而改善NAFLD大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解肝臟脂肪變性。

2.5 三萜類 Cheng等[44]用人參皂苷Rg2處理油酸與棕櫚酸誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞NAFLD模型后，可有效抑制ROS過量生成，促進(jìn)抗氧化基因包括GCLC、GCLM、Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)、HOMX1、和 Nrf2表達(dá)，表明人參皂苷Rg2能糾正原代肝細(xì)胞的氧化還原失衡，可能與激活SIRT1有關(guān)。另一研究[45]表明人參皂苷Rg1預(yù)防氧化應(yīng)激的作用可能是通過PPARα減少脂質(zhì)過氧化，同時(shí)降低該NAFLD模型小鼠肝臟中GPR78、CHOP和Caspase- 12的表達(dá)來減輕肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。人參皂苷Rg1亦可上調(diào)PPARα轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而靶向改善脂肪代謝[46]。Yang等[47]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)可明顯促進(jìn)NAFLD小鼠模型鐵的積累，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的上調(diào)和鐵蛋白重鏈1的下調(diào)，銀杏內(nèi)酯B能顯著降低NAFLD細(xì)胞和動(dòng)物模型的TG、TC、MDA、游離脂肪酸、Fe2+、ROS水平，升高SOD、GSH-Px ，其減輕NAFLD模型的氧化應(yīng)激水平和鐵超載的機(jī)制與激活Nrf2通路有關(guān)。黃強(qiáng)等[48]用不同劑量積雪草苷干預(yù)NAFLD模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各劑量組以不同程度降低模型小鼠的TG、TC水平以及CYP2E1的表達(dá)，其中高劑量組(45 mg/kg)能顯著降低MDA水平，提高SOD活性，表明積雪草苷對(duì)NAFLD具有一定的抗氧化作用，其減輕肝臟脂質(zhì)過氧化作用機(jī)制可能與抑制CYP2E1信號(hào)通路有關(guān)。

2.6 苷類 Shen等[49]通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)NAFLD模型，用梔子苷干預(yù)后，能顯著降低大鼠模型TG、TC、LDL、VLDL水平，提高HDL、SOD水平，梔子苷改善NAFLD大鼠和HepG2細(xì)胞脂肪變性，抑制氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制與Nrf2通路有關(guān)。Ma等[50]發(fā)現(xiàn)芍藥苷治療降低了NAFLD大鼠模型肝臟脂肪變性，提高了小鼠模型肝臟和血清的SOD活性，降低了MDA、ROS產(chǎn)生并抑制肝臟中CYP2E1的表達(dá)，芍藥苷預(yù)防氧化應(yīng)激的潛在作用可能與減少自由基產(chǎn)生或增加自由基清除活性有關(guān)。許瓊梅等[51]發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷治療組能降低NAFLD模型大鼠的血清TG、TC、LDL水平，提高HDL，改善大鼠肝臟的脂肪變性，同時(shí)龍膽苦苷治療組SOD、GSH-Px升高，MDA降低，其抗氧化應(yīng)激作用與增強(qiáng)p-AMPK、Nrf2蛋白水平有關(guān)。各中藥活性成分對(duì)NAFLD的抗氧化作用總結(jié)如表1。

3 小結(jié)與展望

NAFLD所涉及的病理機(jī)制復(fù)雜，而氧化應(yīng)激是NAFLD發(fā)病過程中的重要部分，因此抗氧化應(yīng)激損傷成為治療NAFLD的關(guān)鍵。中藥抗氧化應(yīng)激作用以防治NAFLD的機(jī)制主要有改善肝臟脂肪變性，提高抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平，增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化。但目前研究多集中于細(xì)胞和動(dòng)物階段，檢測(cè)指標(biāo)以TG、TC、SOD、MDA為主，研究指標(biāo)相對(duì)單一，且缺少臨床試驗(yàn)研究，另外，不同中藥活性成分配伍研究較少。因此，探索特異性指標(biāo)，從多角度、多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑深入研究中藥活性成分抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，組合不同中藥活性成分復(fù)方，可為預(yù)防和治療NAFLD提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：周靜負(fù)責(zé)查找文獻(xiàn)，分析資料，撰寫論文初稿；張德新負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

表1 中藥活性成分對(duì)NAFLD的抗氧化作用