乳源抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌多靶點(diǎn)抑菌機(jī)制

李鈺芳，楊 昆，顧韋維，趙 瓊，黃艾祥，施婭楠

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

金黃色葡萄球菌屬于有害的革蘭氏陽(yáng)性病原體，是世界第三大食源性微生物[1-2]，多重耐藥金黃色葡萄球菌在動(dòng)物產(chǎn)品中檢出率較高[3-4]，特別是在生奶和奶制品中[5-6]，目前由多重耐藥金黃色葡萄球菌引發(fā)的公共衛(wèi)生問(wèn)題十分嚴(yán)峻[7]。抗菌肽因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)以及多靶點(diǎn)抗菌不易產(chǎn)生耐藥性的原因[8]，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

目前研究認(rèn)為，抗菌肽的抑菌作用機(jī)制主要分為膜結(jié)構(gòu)破壞模式和非膜結(jié)構(gòu)破壞模式[9]，郭娟等[10]發(fā)現(xiàn)抗菌肽P-1通過(guò)影響粉紅單端孢（Trichothecium roseum）壁膜通透性、抑制蛋白和核酸的合成3個(gè)方面共同作用達(dá)到抑菌效果；鐘亨任等[11]發(fā)現(xiàn)抗菌肽Brevinin-GR23通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞與DNA相互作用，干擾DNA的轉(zhuǎn)錄；4 種富含脯氨酸的pyrrhocoricin、drosocin、apidaecin和Bac7均能與細(xì)菌的熱休克蛋白Dnak和分子伴侶GroEl結(jié)合，抑制其活性[12-13]；Miao Jianyin等[14]報(bào)道，經(jīng)抗菌肽F1處理后埃希氏大腸桿菌蛋白表達(dá)受到影響，31個(gè)差異蛋白通過(guò)影響其三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、甘油磷脂代謝和細(xì)胞周期的途徑，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、折疊以及蛋白與其他生物大分子間（包括蛋白、核酸、脂質(zhì)等）相互作用，是機(jī)體快速高效適應(yīng)環(huán)境的保證，包括蛋白的磷酸化、乙?；㈢牾；?、丙二?；⑻腔?、2-羥基異丁?；?、丙?；取＝陙?lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多生命活動(dòng)、生理功能、疾病的發(fā)生不僅與蛋白質(zhì)的豐度相關(guān)，更重要的是還與各類(lèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾有關(guān)。目前對(duì)致病菌蛋白修飾的研究主要集中在各種修飾對(duì)菌體分泌毒素、菌體耐藥基因等的影響以及酸、堿、鹽、金屬離子等對(duì)致病菌蛋白修飾的影響[15-16]，對(duì)蛋白修飾介導(dǎo)的抗菌肽抑菌機(jī)理的研究報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)所用抗菌肽BCp12為自主研發(fā)，利用貫筋藤凝乳酶酶解檳榔江水牛乳后，基于活菌親和吸附聯(lián)合反相高相液相色譜純化，得到單一色譜峰，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，該色譜峰中包含了4個(gè)肽段，經(jīng)活性篩選確定目標(biāo)活性肽BCp12，其氨基酸序列為YLGYLEQLLRLK，是一種αs1酪蛋白源抗菌肽。該抗菌肽穩(wěn)定性好，具有廣譜抗菌效果，對(duì)哺乳動(dòng)物顯示低溶血性和低毒性[17-18]，但對(duì)多重耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌效果及抑菌機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以乳制品中分離出的多重耐藥金黃色葡萄球菌（對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、頭孢西丁顯示耐藥性）為靶標(biāo)菌，明確BCp12對(duì)其壁膜損傷、核酸合成、蛋白合成及蛋白翻譯后修飾4個(gè)方面的影響，以期從膜透化致死和非膜靶向致死兩方面闡明BCp12對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制，旨在為乳源抗菌肽、天然食品防腐劑的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

抗菌肽BCp12分離純化于貫筋藤凝乳酶酶解的檳榔江水牛酪蛋白，由安徽國(guó)平藥業(yè)有限公司合成，純度為98.798%。

金黃色葡萄球菌DC.RB-015（Staphylococcus aureus）由云南省疾病預(yù)防控制中心提供。

LB肉湯 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；正十六烷、碘化丙啶（polyimide，PI）、溴化乙錠（ethidium bromide，EB） 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×） 北京蘭杰柯科技有限公司；革蘭氏陽(yáng)性菌蛋白提取試劑盒 上海貝博生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠速配試劑盒 美國(guó)GenScript公司；一抗（賴(lài)氨酸乙?；贵wPTM-101、賴(lài)氨酸琥珀酰化抗體PTM-419、賴(lài)氨酸2-羥基異丁酰化抗體PTM-802、賴(lài)氨酸丙二?；贵wPTM-902） 杭州景杰生物科技有限公司；二抗（Pierce抗體） 美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZM-60KCS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；FlexSEM1000掃描電子顯微鏡 日本日立高新公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子公司；C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD Biosciences公司；全波長(zhǎng)熒光酶標(biāo)儀美國(guó)Biotek公司；BioPowerPacTM電泳儀、Chem1DOC MF電泳自動(dòng)成像儀 美國(guó)Biorad公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的測(cè)定

參照曹海鵬等[19]的方法測(cè)定BCp12的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。取對(duì)數(shù)期的菌體，用0.02 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌菌體3 次后制備成菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL），加入96 孔板內(nèi)。用二倍稀釋法將BCp12稀釋后加入菌懸液中，空白對(duì)照組為等量無(wú)菌水。將96 孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育18 h，測(cè)定OD600nm值，以抗菌肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，拐點(diǎn)即為MIC。

參照付云等[20]的方法將BCp12加入到金黃色葡萄球菌菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL）中，使其終質(zhì)量濃度為MIC。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔2 h進(jìn)行取樣，測(cè)定OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，空白對(duì)照組為等量無(wú)菌水代替抗菌肽加入菌懸液中。

1.3.2 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌壁膜影響的測(cè)定

1.3.2.1 菌體細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定

參照Hou Lixia[21]和Prasath[22]等的方法稍作修改，離心收集對(duì)數(shù)期菌體，用PBS洗滌3 次后用0.1 mol/L KNO3溶液重懸（菌液濃度為108CFU/mL），取不同質(zhì)量濃度BCp12溶液與菌懸液等體積混合，使BCp12終質(zhì)量濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、3/2 MIC、2 MIC，對(duì)照組為等量無(wú)菌水。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD405nm值（記為A0）；然后吸取體積為1.2 mL的菌懸液，向其中加入200 μL十六烷，漩渦2 min，靜置15 min，直至菌懸液和十六烷兩相溶液完全分層，小心吸取水相，測(cè)定OD405nm值（記為A1）。細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性用細(xì)胞吸附率表征，計(jì)算公式如下。

1.3.2.2 菌體細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

根據(jù)陳飛龍[23]的方法測(cè)定細(xì)胞膜完整性，離心收集對(duì)數(shù)期菌體，PBS洗滌3 次后重懸得到菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL），加入BCp12使其終質(zhì)量濃度為MIC，以加入無(wú)菌水組作為對(duì)照，置于37 ℃搖床中，120 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的PI溶液，4 ℃避光靜置孵育15 min，用流式細(xì)胞儀記錄被PI著染的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。

1.3.2.3 透射電子顯微鏡觀(guān)察菌體微觀(guān)結(jié)構(gòu)

參照孫亞楠[24]的方法稍作修改，離心收集對(duì)數(shù)期金黃色葡萄球菌，用PBS緩沖液洗滌3 次，并重懸（菌液濃度為108CFU/mL），實(shí)驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度為MIC的BCp12，對(duì)照組加入等量的無(wú)菌水，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h，離心去上清液，PBS洗滌3 次后再離心收集菌體沉淀。菌體沉淀加2.5%戊二醛固定12 h，將固定好的金黃色葡萄球菌離心后除去固定液，PBS洗滌3 次后加入鋨酸固定2 h，用PBS洗滌3 次得到菌體沉淀。分別依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇脫水，每次脫水時(shí)間為10 min。然后用包埋劑浸透菌體室溫靜置2 h，包埋過(guò)夜，再于60 ℃靜置48 h后取出，切片染色后透射電子顯微鏡下觀(guān)察、拍照。

1.3.3 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌DNA和蛋白合成影響的測(cè)定

1.3.3.1 抗菌肽對(duì)菌體DNA的影響

參照李莉蓉[25]的方法稍作修改，離心收集對(duì)數(shù)期菌體，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒參照其說(shuō)明書(shū)提取菌體DNA，用蒸餾水將菌體DNA稀釋為50 μg/mL，加入96 孔板內(nèi)，每孔加入50 μL DNA溶液和0.75 μL 100 μg/mL EB溶液，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，加入50 μL不同質(zhì)量濃度的BCp12溶液，對(duì)照組用50 μL無(wú)菌水代替BCp12溶液，混勻之后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在激發(fā)波長(zhǎng)535 nm及發(fā)射波長(zhǎng)550～700 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.3.3.2 抗菌肽對(duì)菌體蛋白合成的影響

參照寧亞維等[26]的方法稍作修改，離心收集對(duì)數(shù)期菌體用PBS洗滌3 次并重懸（菌液濃度為108CFU/mL），分別加入不同質(zhì)量濃度的BCp12溶液，使其終質(zhì)量濃度分別達(dá)到MIC和2 MIC，對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌水，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，離心收集菌體沉淀，參照革蘭氏陽(yáng)性菌蛋白提取試劑盒的步驟對(duì)其總蛋白進(jìn)行提取，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。每個(gè)樣品取等量蛋白到離心管中，加入5 μL 4×蛋白上樣緩沖液，再加入2% SDS使總體積為20 μL，依次上樣1 μL預(yù)染蛋白Marker和20 μL蛋白樣品，調(diào)節(jié)電流至35 mA開(kāi)始電泳，待樣品跑至膠底部，將膠板取下銀染2 h，加入脫色液脫色至背景無(wú)色、條帶清晰后放置凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察。

1.3.4 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白翻譯后修飾的影響

參照杭天蓉[27]的方法稍作修改，離心收集對(duì)數(shù)期菌體用PBS洗滌3 次并重懸（菌液濃度為108CFU/mL），加入BCp12使其終質(zhì)量濃度為MIC，對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌水，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，離心收集菌體沉淀，參照革蘭氏陽(yáng)性菌蛋白提取試劑盒的步驟對(duì)菌體總蛋白進(jìn)行提取，將提取的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至2 mg/mL，進(jìn)行SDS-PAGE（分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%），通過(guò)電轉(zhuǎn)印跡將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。室溫用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的TBS緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）對(duì)膜封閉2 h。加入一抗（賴(lài)氨酸乙?；贵w、賴(lài)氨酸琥珀酰化抗體、賴(lài)氨酸2-羥基異丁?；贵w、賴(lài)氨酸丙二?；贵w），1∶1 000稀釋?zhuān)跤^(guò)夜。用TBST緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl、0.1% Tween 20）洗滌3 次后，37 ℃加二抗羊抗鼠IgG，1∶5 000稀釋?zhuān)跤? h。將膜用TBS緩沖液重新洗滌，再加入熒光底物孵育5 min后進(jìn)行曝光處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均做3 次平行，使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用獨(dú)立T檢驗(yàn)（兩尾法），P≤0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

如圖1A所示，BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為2 mg/mL；如圖1B所示，在24 h內(nèi)BCp12能夠顯著抑制菌體的生長(zhǎng)（P≤0.05、P≤0.01），BCp12處理組細(xì)菌生長(zhǎng)8 h開(kāi)始與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P≤0.05），生長(zhǎng)至16 h趨于穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，從短芽孢桿菌發(fā)酵液中提取出的抗菌肽Tostadin對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為32 μg/mL[28]，從巴西樹(shù)蛙表皮提取得到的抗菌肽HS-1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有顯著抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為11.7 μmol/L（0.025 mg/mL）[29]，與其相比，BCp12的MIC較大，但BCp12是一種新型乳源抗菌肽，采用酶法水解得到，安全性較高。

圖1 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of antimicrobial peptide BCp12 on S. aureus

2.2 抗菌肽BCp12對(duì)菌體壁膜的損傷機(jī)制

2.2.1 抗菌肽BCp12對(duì)菌體細(xì)胞表面疏水性的影響

如圖2所示，質(zhì)量濃度大于等于MIC的BCp12作用于金黃色葡萄球菌后，細(xì)胞表面的疏水性顯著降低（P≤0.001），從對(duì)照組的86.6%降為MIC BCp12處理組的73.1%，且BCp12對(duì)菌體細(xì)胞表面疏水性的影響呈濃度依賴(lài)性。有研究表明，家蠅抗菌肽Hf-1處理6 種細(xì)菌后，其表面疏水性由43.71%～45.14%降至2.00%～34.57%[21]，螺旋藻抗菌肽SP-1作用于大腸桿菌后其表面疏水性由70.03%降至20.86%[30]，說(shuō)明抗菌肽降低了細(xì)菌表面疏水性，所得結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。郭文杰等[31]提出抗菌肽表面富含正電荷，抗菌肽YD1、Melittin和Bac8c通過(guò)其表面的正電荷與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌表面的負(fù)電荷結(jié)合并黏附于細(xì)菌表面，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜從而殺滅細(xì)菌。BCp12與細(xì)胞膜的結(jié)合過(guò)程及抑菌活性的發(fā)揮可能與其誘導(dǎo)的細(xì)胞表面疏水性的變化有關(guān)。

圖2 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of antimicrobial peptide BCp12 on the cell surface hydrophobicity of S. aureus

2.2.2 抗菌肽BCp12對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響

如圖3所示，經(jīng)BCp12處理后，完整細(xì)胞比例由對(duì)照組的72.8%降至實(shí)驗(yàn)組的47.6%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞膜損傷率為52.4%，BCp12會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性顯著降低（P≤0.05）。細(xì)胞膜受損主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性增加，而PI不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷后才可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與核酸結(jié)合發(fā)出熒光，Chia等[32]發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Litoria caerlea和抗菌肽Litoria geninaculata通過(guò)破壞活細(xì)胞細(xì)胞膜完整性發(fā)揮抑菌作用，陳飛龍[23]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗菌肽處理的細(xì)胞膜損傷率由對(duì)照組的0.53%升高至實(shí)驗(yàn)組10.32%（P≤0.05），與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明抗菌肽能夠破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，引起內(nèi)容物外泄，致使細(xì)胞死亡。

圖3 流式細(xì)胞儀分析抗菌肽BCp12處理后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性Fig. 3 Effect of antimicrobial peptide BCp12 on the membrane integrity of S. aureus as analyzed by flow cytometer

2.2.3 抗菌肽BCp12對(duì)菌體微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響

利用透射電子顯微鏡可以直接觀(guān)察到S. aureus細(xì)胞膜的損傷情況及超微結(jié)構(gòu)的變化。如圖4A所示，未經(jīng)BCp12處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞呈球形，形態(tài)完整飽滿(mǎn)，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，其胞內(nèi)呈現(xiàn)黑色，是蛋白質(zhì)、DNA等內(nèi)容物被重金屬染色造成的；由圖4B可知，經(jīng)MIC BCp12處理后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞出現(xiàn)皺縮并發(fā)生嚴(yán)重的形變，細(xì)胞顏色變淺，部分細(xì)胞的內(nèi)容物丟失出現(xiàn)空腔。Hartmann等[33]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌經(jīng)抗菌肽PGLa處理后，透射電子顯微鏡觀(guān)察到金黃色葡萄球菌細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞器完全溶解，細(xì)胞質(zhì)丟失甚至出現(xiàn)空腔，從而使染色的細(xì)胞顏色變淺；Yang Shen等[34]通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LCWAP處理金黃色葡萄球菌后，細(xì)菌細(xì)胞膜被部分破壞并隨細(xì)胞質(zhì)流出，說(shuō)明抗菌肽能夠破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，造成細(xì)胞質(zhì)外泄；Fitriyanti等[35]通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察到抗菌肽CecropinP1導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜破裂致使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，進(jìn)而造成細(xì)胞死亡，與本研究結(jié)果一致。說(shuō)明BCp12會(huì)破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄形成空腔，致使細(xì)胞死亡。

圖4 透射電子顯微鏡觀(guān)察抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of antimicrobial peptide BCp12 on the microstructure of S. aureus observed by TEM

2.3 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌DNA和蛋白合成的影響

2.3.1 抗菌肽BCp12對(duì)菌體DNA的影響

如圖5所示，對(duì)照組菌體DNA的熒光強(qiáng)度明顯高于實(shí)驗(yàn)組，并且熒光強(qiáng)度隨著B(niǎo)Cp12質(zhì)量濃度的增加而下降，說(shuō)明BCp12存在會(huì)與EB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA使EB-DNA復(fù)合物體系熒光強(qiáng)度下降。有研究表明，EB是一種可以和DNA結(jié)合的熒光染料，其結(jié)合方式有兩種，當(dāng)它與DNA嵌插結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)它通過(guò)靜電作用與DNA結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度不變[36-37]，唐亞麗發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽MDpep5和MDpep9能與細(xì)菌DNA結(jié)合使熒光強(qiáng)度降低，可進(jìn)一步影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)功能，達(dá)到迅速抑菌、殺菌的作用[38]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 抗菌肽BCp12與EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合金黃色葡萄球菌DNAFig. 5 Antimicrobial peptide BCp12 and ethidium bromide (EB)competitively bound to DNA of S. aureus

2.3.2 抗菌肽BCp12對(duì)菌體蛋白合成的影響

由圖6A可知，經(jīng)BCp12處理的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P≤0.001）。由圖6B可知，對(duì)照組的蛋白條帶清晰完整，而經(jīng)BCp12處理后金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白條帶出現(xiàn)不同程度的缺失現(xiàn)象，其中，菌體經(jīng)MIC BCp12處理后，蛋白條帶缺失較多的部分主要集中在分子質(zhì)量為15～35 kDa之間，當(dāng)BCp12質(zhì)量濃度上升至2 MIC時(shí)，分子質(zhì)量在10～35、55、100 kDa處的蛋白條帶幾乎消失，說(shuō)明增大BCp12質(zhì)量濃度，金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度急劇降低，金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成完全受到抑制。付云等[20]研究了抗菌肽SP-AP-1和Iturin A對(duì)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)抗菌肽能夠造成分子質(zhì)量為17、20、25～35 kDa的蛋白質(zhì)含量降低，蛋白條帶顏色顯著變淺，從而導(dǎo)致菌體死亡。

圖6 抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白的影響Fig. 6 Effect of antimicrobial peptide BCp12 on the protein profile of S. aureus

2.4 抗菌肽BCp12對(duì)菌體蛋白翻譯后修飾的影響

經(jīng)過(guò)修飾后，含有賴(lài)氨酸的蛋白性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或酶活性發(fā)生改變，可發(fā)揮控制菌體生長(zhǎng)代謝的作用。如圖7所示，金黃色葡萄球菌蛋白存在大量的賴(lài)氨酸乙?；㈢牾；⒈；揎?，而賴(lài)氨酸2-羥基異丁?；揎棽幻黠@。已有研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌、歐文氏菌、腸炎沙門(mén)桿菌、枯草芽孢桿菌內(nèi)蛋白質(zhì)存在明顯的賴(lài)氨酸乙酰化、琥珀?；揎?，菌體蛋白質(zhì)與能量代謝途徑中關(guān)鍵代謝酶存在翻譯后修飾，這些發(fā)生修飾的蛋白質(zhì)/酶在蛋白質(zhì)降解、毒力因子表達(dá)、碳源代謝、線(xiàn)粒體能量代謝、脂肪酸合成、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[39]。在哺乳動(dòng)物中，賴(lài)氨酸丙二?；揎椗c能量代謝密切相關(guān)，但在原核生物中作用仍知之甚少。Tan Minjia等[40]闡明了大腸桿菌的丙二?；揎椬V，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的丙二酰化在調(diào)節(jié)大腸桿菌能量代謝途徑和蛋白質(zhì)功能中起重要作用。Xie Jianping等[41]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中大量的代謝酶和抗生素抗性蛋白發(fā)生賴(lài)氨酸琥珀?；?，揭示了琥珀?；诮Y(jié)核分枝桿菌中的病理及生理代謝中的作用。

圖7 免疫印跡分析抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白修飾的影響Fig. 7 Effect of antimicrobial peptide BCp12 on protein modification in S. aureus evaluated by Western blot

本研究利用MIC BCp12處理金黃色葡萄球菌后，發(fā)現(xiàn)菌體的生長(zhǎng)受到抑制，通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)組菌體的4 種賴(lài)氨酸?；揎棾潭?，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的蛋白丙二?；揎棸l(fā)生了明顯的下調(diào)，乙?；揎椝皆谝欢ǔ潭壬弦舶l(fā)生變化，而對(duì)賴(lài)氨酸琥珀?；?-羥基異丁?；揎椀挠绊懖幻黠@。Reynolds等[42]報(bào)道了牙齦卟啉單胞菌中用于能量產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝酶在某些賴(lài)氨酸殘基上被賴(lài)氨酸乙酰化，證實(shí)賴(lài)氨酸乙?；谘例l卟啉單胞菌的代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，對(duì)它的增殖至關(guān)重要。Fan Ben等[43]研究得到賴(lài)氨酸丙二?；赡苡绊懱嵌噫呒t霉菌中心能量代謝和糖多孢紅霉菌的生物合成途徑。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素能與青霉素結(jié)合蛋白PBPs的轉(zhuǎn)肽酶功能域（TPase domain）選擇性結(jié)合，使其乙酰化而滅活TPase，阻斷細(xì)菌肽聚糖合成，進(jìn)而殺滅金黃色葡萄球菌[44]。相關(guān)研究報(bào)道也指出sirtuin 5（sirt5）作為蛋白質(zhì)脫?；福艽呋コg后修飾，例如賴(lài)氨酸殘基上的琥珀?；捅；揎?，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝[45]。Jin Qi等[46]研究了毛廯菌不同生長(zhǎng)階段蛋白質(zhì)水平和乙?；揎椝剑⑼ㄟ^(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，外源添加賴(lài)氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（k (lysine) acetyltransferase，KATs）抑制劑和組蛋白賴(lài)氨酸去乙酰酶（histone deacetylases，KDACs），可以顯著影響真菌細(xì)胞的存活，為新型抗真菌藥物的研制提供了直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是抗菌肽作用機(jī)制研究、抗菌藥物研發(fā)、菌體分泌毒素研究中尚未被充分重視的一大方向，對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的深入研究，有助于了解生命活動(dòng)特征、鑒定作用靶點(diǎn)、揭示代謝通路，為抗菌類(lèi)藥物、食品防腐劑研發(fā)提供思路。

3 結(jié) 論

抗菌肽BCp12能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。BCp12破壞細(xì)胞壁膜通透性，菌體形變嚴(yán)重，部分細(xì)胞內(nèi)容物外泄形成空腔；BCp12以嵌插方式與金黃色葡萄球菌的DNA結(jié)合，阻礙菌體遺傳信息正常表達(dá)，影響蛋白合成，尤其對(duì)分子質(zhì)量15～35 kDa的蛋白質(zhì)抑制明顯；金黃色葡萄球菌蛋白存在大量的賴(lài)氨酸乙酰化、琥珀?；?、丙二酰化修飾，其中MIC BCp12處理組菌體的丙二?；揎椣抡{(diào)。基于本研究結(jié)果，可以得出抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用是通過(guò)影響其壁膜通透性、抑制DNA和蛋白的合成、阻礙菌體賴(lài)氨酸丙二酰化修飾共同作用的結(jié)果。