紅豆皮多酚提取物對兩種致病菌的抑菌活性及作用機理

賈 睿，蔡 丹，葛思彤，任世達，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

食源性致病菌污染是影響食品安全和引發(fā)公共衛(wèi)生事件的潛在威脅因素，常見的致病菌包括大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌等，這些致病菌具有較強的耐受干燥、酸、鹽、熱等環(huán)境因素的能力，導致其可以在食品生產(chǎn)、加工和貯藏過程中長期生存?；瘜W來源的抑菌劑是有效的防控方式，但其在抑制腐敗微生物和致病菌生長的同時，可能存在安全隱患并可能使致病微生物產(chǎn)生耐藥性，從而引發(fā)了較多爭議[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蒼山子中的槲皮素對金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌具有較強的抑菌活性[2]；柑橘類水果中的柚皮素具有抑制鼠傷寒沙門氏菌的作用[3]；茶葉中的茶多酚可顯著抑制革蘭氏陽性菌生長[4]。這些天然產(chǎn)物提取物除了表現(xiàn)出抑制致病菌活性外，還具有綠色、安全、高效等特點，往往采用單獨或與蛋白、多糖混合成膜噴灑、包埋或涂抹等方式應用于食品的抑菌中。

糧食副產(chǎn)物中富含具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，如酚類化合物。酚類化合物具有調(diào)節(jié)血糖、預防動脈粥樣硬化、抗氧化和抗炎等多種生理活性，研究表明大麥提取物中的大麥多酚對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等均有抑制生長作用[5-7]。紅豆（Vigna angularis）是一種一年生半纏繞草本植物，《本草綱目》中記載其有助于抗水腫、腹瀉和嘔吐等[8]。紅豆在現(xiàn)代糧食加工過程中常會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——紅豆皮，紅豆皮中富含三萜皂苷、酚類化合物、植物甾醇和色素等生物活性物質(zhì)，其中的酚類化合物被認為是生物活性最高的代謝產(chǎn)物之一，主要包含兒茶素苷、槲皮素苷、楊梅素3-鼠李糖苷、花色苷和原花青素二聚體等[9-10]。目前國內(nèi)外研究多集中于紅豆皮成分以及抗氧化活性方面，對于紅豆皮多酚提取物的抑菌活性及抑菌機理鮮見報道。

綜上，本實驗以紅豆皮為原料，采用超聲波輔助醇提法制備紅豆皮多酚提取物，分析其對李斯特菌、沙門氏菌兩種食源性致病菌的抑菌活性，并探究其抑菌機理，以期為糧食源抑菌劑的開發(fā)與應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆皮取自吉林農(nóng)業(yè)大學小麥和玉米深加工國家工程實驗室；李斯特菌ATCC19119（ListeriainnocuaATCC19119）（G+）、沙門氏菌ATCC14028（SalmonellaATCC14028）（G－）均取自吉林農(nóng)業(yè)大學。

膜電位熒光探針DiBAC4(3) 北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ATP檢測試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。所有試劑均為國產(chǎn)分析純；液相色譜試劑均為色譜級。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱、DL-CL-ND超凈工作臺哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；Autoclave 4001136高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FLUO star Omega全自動多功能酶標儀 德國BMG Labtech公司；Z36HK超高速冷凍離心 德國Hermle公司；FD-1B-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司；HD-3紫外檢測器、BSZ-100自動部分收集器、玻璃層析柱（1.8 cm×30 cm） 上海滬西分析儀器廠；GeminiSEM場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆皮多酚提取物的制備

根據(jù)Luo Jiaqiang等[11]的方法并略作修改制備紅豆皮多酚提取物。稱取紅豆皮粉末2.000 g，置于200 mL燒杯中，以料液比1∶30加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液，攪拌均勻。然后在室溫條件下，360 W超聲處理30 min，樣液取出后立即離心20 min（4 000 r/min），取上清液，通過45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮粗提物。利用AB-8大孔樹脂進行純化（上樣液質(zhì)量濃度2.5 mg/mL、上樣液體積330 mL、流速1 mL/min、體積分數(shù)70%乙醇溶液洗脫），將純化液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，冷凍干燥后得到粉末狀紅豆皮多酚提取物，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Folin-Ciocalteu法測定紅豆皮多酚提取物的多酚含量，根據(jù)文獻[12]方法略作修改。繪制沒食子酸標準曲線：配制質(zhì)量濃度分別為0、4、8、12、16、20、24 μg/mL的沒食子酸溶液，吸取各質(zhì)量濃度溶液1 mL，加入Folin-Ciocalteu試劑2.5 mL以及質(zhì)量分數(shù)15%的Na2CO3溶液2 mL于比色管中，加去離子水定容至10 mL，搖勻，在黑暗處靜置2 h，然后在96 孔板酶標儀中于765 nm波長處測定吸光度，得到標準曲線線性回歸方程：y=0.015 8x+0.046 6，R2=0.9988。精確吸取適量紅豆皮多酚提取物干粉配制的溶液50 μL，按上述方法處理并測定吸光度。通過標準曲線方程計算出溶液中多酚的質(zhì)量濃度，每組做3個平行。根據(jù)下式計算出紅豆皮提取物的多酚含量為（145.28±2.21）mg/g。

式中：ρ為紅豆皮多酚的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為紅豆皮提取物干粉的質(zhì)量/g。

1.3.2 高效液相色譜測定紅豆皮多酚組成

為了進一步分析純化后紅豆皮多酚類物質(zhì)的組成成分，將純化后的紅豆皮多酚提取物溶于色譜級甲醇中，稀釋至1 mg/mL，通過0.45 μm有機濾膜過濾，并使用Zorbox SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），通過高效液相色譜儀對紅豆皮多酚提取物混合液的組成成分進行分析。色譜參數(shù)：柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；流動相A：甲醇；流動相B：體積分數(shù)0.5%冰醋酸。洗脫條件：0～5 min，5% A；5～10 min，8% A；10～20 min，12% A；20～30 min，20% A；30～40 min，40% A；40～50 min，50% A；50～60 min，60% A；60～65 min，70% A；65～70 min，80% A。比較樣品色譜峰保留時間與標準品保留時間，判定紅豆皮多酚提取物中單體酚的組成。

1.3.3 紅豆皮多酚提取物最小抑菌濃度的測定

參考Kanatt等[13]的二倍等度稀釋96 孔板法測定紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028兩種供試菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將兩種細菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600nm=0.6）（培養(yǎng)條件后同），紅豆皮多酚提取物用二倍稀釋法通過LB液體培養(yǎng)基稀釋至不同質(zhì)量濃度（5 000、2 500、1 250、625、312、156 mg/mL），將50 μL對數(shù)期菌液與50 μL不同質(zhì)量濃度多酚提取物溶液于96 孔板內(nèi)混合均勻后，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，通過酶標儀測定菌液OD600nm，以沒有菌體生長（未檢測到OD600nm）所對應的多酚提取物終質(zhì)量濃度為MIC。以無菌水和10 μg/mL氨芐西林分別為陰性和陽性對照。

1.3.4 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌生長曲線影響的測定

使用Taukoorah等[14]的方法，取培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌50 mL和不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液，加入到100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，使紅豆皮多酚提取液的終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、1 MIC、2 MIC。以終質(zhì)量濃度0.01 g/mL的氨芐西林作為陽性對照。置于37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)，并從0 h開始，每小時取一次樣，測定OD600nm。以培養(yǎng)時間與OD600nm的關系繪制生長曲線。

1.3.5 菌體細胞膜完整性的測定

將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min下離心5 min，收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次，離心后用生理鹽水重懸至107CFU/mL。將5 mL菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度（2 MIC、4 MIC）多酚提取物溶液混合，并在37 ℃下孵育，以相同體積的生理鹽水作為陰性對照。分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 h和6 h，離心（4 ℃、5 000 r/min、5 min）去除菌體，得到上清液，經(jīng)0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾。過膜后按照BCA試劑盒說明測定蛋白質(zhì)量濃度。同時利用紫外分光光度計測定上清液OD260nm，通過OD260nm來確定細胞內(nèi)核酸的泄漏情況[15-16]。

1.3.6 菌體細胞膜電位的測定

將兩種供試菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，取50 mL菌液離心（4 ℃、5 000×g、5 min）并將菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌3～4 次，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌液濃度至107CFU/mL。用二甲基亞砜將DiBAC4(3)溶解后加至黑色不透明96 孔板中，加入125 μL菌液和終濃度1 μmol/L的DiBAC4(3)熒光探針，在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min，之后加入125 μL紅豆皮多酚提取物溶液，使其終質(zhì)量濃度分別達到0（對照）、1 MIC、2 MIC。利用多功能酶標儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為492 nm和515 nm條件下測定相對熒光強度，以相對熒光強度表征細胞膜電位[17]。

1.3.7 菌體細胞內(nèi)ATP含量的測定

將兩種供試菌接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，取50 mL菌液離心（4 ℃、5 000 r/min、5 min）收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌3 次，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL，取菌懸液1 mL加入1 mL紅豆皮多酚提取物溶液，使紅豆皮多酚提取物終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、1 MIC、2 MIC，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。按照ATP檢測試劑盒說明書處理樣品，利用多功能酶標儀測定熒光相對發(fā)光值，以相對發(fā)光值表征菌體細胞內(nèi)ATP含量[18]。

1.3.8 菌體細胞外堿性磷酸酶活力的測定

將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。將5 mL菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液混合，使其終質(zhì)量濃度分別為1 MIC、2 MIC，并在37 ℃下孵育0、3、6、9 h和12 h。將混合物以8 000 r/min離心10 min后，根據(jù)試劑盒說明測定堿性磷酸酶活力。

1.3.9 菌體形態(tài)的觀察

根據(jù)Chen Mingshun等[19]的方法加以改進觀察菌體形態(tài)。將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。向5 mL菌懸液中加入5 mL不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、1 MIC、2 MIC，培養(yǎng)12 h后4 ℃、8 000 r/min條件下離心，沉淀用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，4 ℃、8 000 r/min離心并棄上清液，用體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液4 ℃過夜固定。隨后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗，依次用體積分數(shù)20%、60%、80%、90%和100%乙醇進行梯度脫水。脫水結(jié)束后，用乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）溶液置換20 min，最后用體積分數(shù)100%叔丁醇置換兩次。置換后將樣品進行干燥處理，干燥后的樣品進行離子濺射儀噴鍍后，通過加速電壓為5 kV的場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行微觀形貌觀察。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

采用Wang Chenjie等[20]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）。將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。取5 mL菌懸液，加入5 mL相應質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取液，使其終質(zhì)量濃度1 MIC，以等體積無菌水和10 μg/mL氨芐西林為陰性和陽性對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h，在8 000 r/min下離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌菌體兩次后重懸于無菌生理鹽水（107CFU/mL）中，取5 μL菌液加入等體積上樣緩沖液，在100 ℃水浴中加熱10 min。采用質(zhì)量分數(shù)12%的分離膠和質(zhì)量分數(shù)5%的濃縮膠進行電泳，利用質(zhì)量分數(shù)0.1%的考馬斯亮藍R250染色，凝膠脫色好后用凝膠成像儀進行觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆皮多酚組成分析結(jié)果

如表1所示，紅豆皮多酚中含量相對較高的多酚化合物是槲皮素與金絲桃苷。據(jù)報道，槲皮素是一種具有抗菌和抗氧化活性的黃酮類化合物[21-22]，同時在癌癥治療中具有促進癌細胞凋亡和抑制癌細胞增殖的作用[23-24]。金絲桃苷也具有多種藥用特性，如抗炎、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等[25]。蘆丁是一種黃酮類化合物，廣泛存在于蕓香葉、煙葉和橙皮等植物中[26]；山柰酚是一種黃酮醇類化合物，能夠有效抑制癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[27]；表兒茶素是兒茶素類化合物，屬于黃烷醇化合物，與兒茶素互為同分異構(gòu)體，具有預防癌癥、止瀉、止血、抗真菌及以預防胃潰瘍等作用，同時表兒茶素可以通過抑制葡萄球菌生物膜的形成達到抗菌的效果[28-29]。此外，紅豆皮多酚還含有多種酚酸，包括沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸，這些酚酸具有如抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性[30]。因此，從紅豆皮多酚組成分析結(jié)果可知，紅豆皮富含多酚類物質(zhì)，可作為一種天然抗氧化劑和抗菌劑的良好來源。

表1 紅豆皮多酚組分Table 1 Polyphenol composition of adzuki bean seed coat

2.2 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌的最小抑菌濃度

如表2所示，紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的MIC分別為625 μg/mL和2 500 μg/mL?？梢钥闯?，紅豆皮多酚提取物對革蘭氏陽性和陰性細菌的生長均具有抑制作用。但是，其效果因微生物類型和紅豆皮多酚提取物濃度而異，可能主要與菌體細胞壁結(jié)構(gòu)的差異有關，革蘭氏陽性菌只有單層細胞壁，而革蘭氏陰性菌則具有外膜和獨特的胞質(zhì)間隙，因此，與革蘭氏陰性菌相比，多酚更容易破壞單層細胞壁，抑制菌體的核酸合成以及能量代謝等生物學功能[31]。

表2 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的MICTable 2 MICs of adzuki bean seed coat polyphenols against Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.3 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌生長曲線的影響

由圖1可知，與對照處理相比，1 MIC條件下兩種食源性致病菌的生長對數(shù)期均相對滯后，而2 MIC組OD600nm的增長速率與1 MIC組OD600nm相比趨勢明顯降低，說明在2 MIC下，紅豆皮多酚提取物對供試菌的生長能力有更強的抑制作用。陽性對照組完全抑制了菌體生長，2 MIC組與其抑制效果接近。

圖1 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119 和沙門氏菌ATCC14028生長曲線的影響Fig. 1 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on the growth curves of Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.4 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌細胞膜完整性的影響

抑菌物質(zhì)在破壞菌體細胞膜完整性的過程中，還增加了菌體細胞膜的滲透性，導致細胞內(nèi)容物流失[16]。Chen Lin等[32]發(fā)現(xiàn)，細胞膜受損的李斯特菌能引起細胞內(nèi)組分大量流失。從圖2可以看出，在不同質(zhì)量濃度紅豆皮多酚提取物的作用下，李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細菌上清液中的蛋白質(zhì)和核酸水平隨時間延長逐漸提升。結(jié)果表明，在不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物作用下，李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的細胞壁膜通透性增加，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸存在不同程度的泄漏，且添加高質(zhì)量濃度紅豆皮多酚提取物組的細菌核酸和蛋白質(zhì)泄漏程度更劇烈。

圖2 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028胞外蛋白質(zhì)和核酸水平的影響Fig. 2 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on extracellular protein and nucleic acid contents of Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.5 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌細胞膜電位的影響

靜息膜電位是反映細胞存活情況最重要的參數(shù)之一。DiBAC4(3)是一種測定膜極化變化的熒光膜電位染料，其本身無熒光，當進入細胞與細胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合后才發(fā)出熒光，熒光強度增加，即膜電位增加，表明細胞發(fā)生去極化[33-34]。圖3為不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的細胞膜電位的影響。經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理后，李斯特菌ATCC19119的相對熒光強度與對照組相比分別增加了3.76 倍和6.91 倍，沙門氏菌ATCC1402的相對熒光強度與對照組相比分別增加了3.58 倍和5.59 倍，即細胞發(fā)生去極化。

圖3 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌 ATCC19119（A） 和沙門氏菌ATCC14028（B）細胞膜電位的影響Fig. 3 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on membrane potential in Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.6 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌細胞內(nèi)ATP含量的影響

當細胞受損或死亡時，菌體細胞中的ATP含量會迅速下降，故ATP含量可以反映細胞的存活狀態(tài)[20]。ATP含量的降低可能是細胞質(zhì)ATP釋放量增加和質(zhì)子泵ATP酶的水解速率上升所致[35]。在正常條件下，菌體細胞中ATP的含量相對穩(wěn)定。經(jīng)抑菌劑處理后，菌體細胞膜受損，導致細胞膜變得不穩(wěn)定，細胞內(nèi)ATP合成速率降低，細胞內(nèi)ATP水平降低。圖4為紅豆皮多酚提取物分別對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細胞內(nèi)ATP含量的影響。與對照組相比，經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理的李斯特菌ATCC19119細胞內(nèi)ATP的相對發(fā)光值分別降低了74.68%、89.88%；經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理的沙門氏菌ATCC14028細胞內(nèi)ATP的相對發(fā)光值分別降低了69.56%、87.12%。與對照組相比，紅豆皮多酚提取物處理后菌體細胞中的ATP含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并且隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，菌體細胞中的ATP含量降低更明顯，說明紅豆皮多酚能夠影響菌體的生命活動，促進或?qū)е戮w死亡。

圖4 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119（A）和沙門氏菌ATCC14028（B）胞內(nèi)ATP含量的影響Fig. 4 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on intracellular ATP contents of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

2.7 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌菌體堿性磷酸酶活力的影響

堿性磷酸酶存在于細菌的細胞膜和細胞壁之間，因此未經(jīng)處理的菌懸液中應無堿性磷酸酶活性。因此，可通過檢測細菌懸液中堿性磷酸酶的泄漏情況來反映細胞壁的通透性[36-37]。如圖5所示，與對照相比，經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理后李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細胞堿性磷酸酶活力明顯增加，且堿性磷酸酶活力隨處理時間的延長或者紅豆皮多酚提取物質(zhì)量濃度的增加而升高，表明紅豆皮多酚提取物會導致細胞壁通透性增加，破壞菌體細胞壁完整性。

圖5 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119（A）和沙門氏菌ATCC14028（B）堿性磷酸酶活力的影響Fig. 5 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on alkaline phosphatase activity of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

2.8 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌菌體形態(tài)的影響

用掃描電子顯微鏡觀察紅豆皮多酚處理后李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細胞的細胞膜完整性和形態(tài)變化。如圖6、7所示，未經(jīng)處理的李斯特菌和沙門氏菌菌體細胞分別呈橢球狀和短桿狀，表面相對完整，沒有明顯的皺紋和裂紋。而經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理的菌體細胞受到嚴重破壞，在菌體細胞表面上能夠觀察到明顯的褶皺和凹陷，且細胞發(fā)生黏附和聚集。這些結(jié)果表明紅豆皮多酚能夠破壞兩種菌體細胞的細胞膜，導致菌體的死亡和瓦解。

圖6 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119形態(tài)的影響Fig. 6 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on cell morphology of Listeria ATCC19119

圖7 紅豆皮多酚提取物對沙門氏菌ATCC14028形態(tài)的影響Fig. 7 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on cell morphology of Salmonella ATCC14028

2.9 SDS-PAGE分析結(jié)果

菌體細胞膜蛋白在維持細胞膜通透性方面起著重要作用。細胞膜蛋白的損傷可能導致菌體細胞膜中酶系統(tǒng)完整性的破壞。Nakayama等[38]發(fā)現(xiàn)表沒食子酸阻斷了大腸桿菌細胞外膜蛋白的孔通道，抑制外膜的被動轉(zhuǎn)運，從而抑制大腸桿菌的生長。如圖8所示，經(jīng)1 MIC紅豆皮多酚提取物處理的李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌株的蛋白條帶灰度與陰性對照組相比降低，李斯特菌ATCC19119中48～135 kDa蛋白條帶灰度明顯降低，沙門氏菌ATCC14028中25～35 kDa和48～100 kDa蛋白條帶灰度明顯降低，且李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌株的蛋白含量與紅豆皮多酚提取物處理時間呈負相關。

圖8 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119（A）和沙門氏菌ATCC14028（B）蛋白組成的影響Fig. 8 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on the protein composition of cell membranes of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

3 結(jié) 論

本實驗通過高效液相色譜法檢測出紅豆皮多酚的13 種單體酚成分。紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌體細胞具有有效的抑菌活性，其對李斯特菌ATCC19119的MIC為625 μg/mL，對沙門氏菌ATCC14028的MIC為2 500 μg/mL。此外，通過分析經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理后的細菌細胞內(nèi)容物蛋白質(zhì)和核酸的含量變化發(fā)現(xiàn)，二者均明顯減少，因此可以推斷紅豆皮多酚的作用機制是破壞細胞膜通透性，從而導致核酸和蛋白質(zhì)的損失。SDS-PAGE結(jié)果也可以證明在紅豆多酚的作用下細菌胞內(nèi)蛋白含量減少。同時，紅豆皮多酚會使細胞內(nèi)ATP含量顯著性降低，細菌細胞膜產(chǎn)生去極化現(xiàn)象。綜上，推測紅豆皮多酚的作用會導致細胞裂解和死亡，這與細胞膜通透性的增加有關。通過掃描電子顯微鏡觀察到的菌體表面褶皺和凹陷的現(xiàn)象也能夠支持上述假設。然而，考慮到食品的安全性，在將紅豆皮多酚應用于食品生產(chǎn)前還需進行安全性實驗，優(yōu)化使用劑量并分析其對食品感官特性產(chǎn)生的影響。