‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠腸道屏障和腸道菌群的影響

歐陽(yáng)建，李秀平，周 方，盧丹敏，黃建安，曾呈理，謝前途，鐘維標(biāo)，劉仲華,*

（1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.浙江省平陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 平陽(yáng) 325400；3.浙江子久文化股份有限公司，浙江 平陽(yáng) 325400）

肥胖是指可損害健康或增加死亡率的過(guò)量脂肪累積，與高血脂、糖尿病和非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的發(fā)展密切相關(guān)[1]。隨著人們飲食習(xí)慣的改變和生活水平的提高，高脂食物攝入的增加已成為肥胖及非酒精性脂肪肝等代謝性疾病發(fā)生的主要原因。長(zhǎng)期高脂飲食誘導(dǎo)肥胖與腸道菌群關(guān)系密切，高脂飲食干預(yù)可降低腸道菌群的豐富度和多樣性，改變機(jī)體的氧化還原狀態(tài)，損傷腸道黏膜屏障功能，最終誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生[2]。

茶作為一種天然植物健康飲料，與腸道菌群和腸道屏障有著復(fù)雜的相互作用，能有效調(diào)節(jié)肥胖和相關(guān)代謝紊亂。微生物能將茶葉中的多酚和多糖等物質(zhì)分解為短鏈脂肪酸和酚酸等代謝物，增強(qiáng)腸道屏障作用，有效發(fā)揮抗肥胖功能；同時(shí)，茶葉中的代謝物能夠調(diào)節(jié)腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能，間接參與宿主的能量吸收與生理代謝，從而有效調(diào)控肥胖[3-5]。然而，茶葉調(diào)節(jié)腸道菌群和腸道屏障與預(yù)防肥胖的機(jī)制目前仍不清楚。

黃茶是我國(guó)特有的茶類，其獨(dú)特的悶黃工藝形成了干茶金黃、湯色杏黃、葉底嫩黃的“三黃”品質(zhì)[6]。目前有研究表明，君山銀針和黃大茶等在調(diào)節(jié)血脂和改善肝組織損傷等方面具有良好效果[7-8]，卻鮮有研究涉及黃茶調(diào)節(jié)肥胖與腸道屏障和菌群之間的關(guān)系?！疥?yáng)黃湯’作為黃茶中的代表性名茶，對(duì)其健康功效研究較少，其調(diào)節(jié)肥胖的效果目前更是鮮有研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬選取有代表性的‘平陽(yáng)黃湯’為材料，建立肥胖模型，評(píng)估‘平陽(yáng)黃湯’調(diào)控高脂飲食大鼠肥胖的效果及與腸道屏障和菌群的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)4～5 周齡雄性SD大鼠40 只，體質(zhì)量（180±10）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。所用脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%高脂飼料（編號(hào)23300，供能21.32 kJ/g）和脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%正常飼料（編號(hào)23302，供能15.05 kJ/g）購(gòu)自江蘇南通特洛菲飼料有限公司，主要成分包括玉米淀粉、豆油、蔗糖、纖維素等。

茶樣‘平陽(yáng)黃湯’由平陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提供。

甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；瘦素（leptin，LEP）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液、CY3-TSA、自發(fā)熒光猝滅劑等武漢塞維爾公司；21733-1-AP閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）抗體 美工Proteintech公司；閉鎖蛋白（ab216327）抗體 美國(guó)Abcam公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、Modulyod-230冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo公司、DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；MIKRO 22R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Eclipse C1正置熒光顯微鏡日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樣干粉制備

取適量‘平陽(yáng)黃湯’茶樣，按照茶水比1∶10在沸水浴中浸提20 min，直接過(guò)濾，冷卻后于－20 ℃冰箱中預(yù)凍12 h后真空冷凍干燥48 h。收集茶粉，密封包裝，－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ‘平陽(yáng)黃湯’感官評(píng)價(jià)和理化成分測(cè)定

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》對(duì)茶樣進(jìn)行感官審評(píng)，對(duì)茶葉的外形、湯色、香氣和滋味等感官品質(zhì)進(jìn)行特征描述；水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 8305—2002《茶 水浸出物測(cè)定》測(cè)定；茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》測(cè)定；游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》測(cè)定；可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)按蒽酮-硫酸比色法測(cè)定。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心批準(zhǔn)并符合動(dòng)物倫理規(guī)范。將40 只SPF級(jí)SD大鼠在（25±2）℃條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為5 組：正常飲食（ND）組、高脂模型（HFD）組、‘平陽(yáng)黃湯’低劑量（HFD-L）組、‘平陽(yáng)黃湯’中劑量（HFD-M）組、‘平陽(yáng)黃湯’高劑量（HFD-H）組，每組8 只。參照實(shí)驗(yàn)室前期研究[9]，將制備所得茶粉按高、中、低劑量分別為300、150、75 mg/kgmb進(jìn)行灌胃處理。大鼠在籠內(nèi)自由飲水進(jìn)食，每日固定時(shí)間對(duì)ND組大鼠灌胃超純水，飼喂正常飼料；HFD組灌胃超純水，飼喂高脂飼料；‘平陽(yáng)黃湯’組灌胃用超純水溶解相應(yīng)劑量的‘平陽(yáng)黃湯’水提物，飼喂高脂飼料，每周稱體質(zhì)量，并記錄體質(zhì)量和攝食量，建立肥胖預(yù)防模型。

‘平陽(yáng)黃湯’持續(xù)灌胃8 周后，將待取樣的大鼠放置于干凈、鋪有無(wú)菌濾紙的籠內(nèi)，待其排便后立即收集糞便樣本，置于無(wú)菌EP管內(nèi)，－80 ℃冰箱保存用于后續(xù)的微生物分析。取樣完畢后大鼠禁食12 h，每只大鼠注射1%戊巴比妥鈉麻醉，主動(dòng)脈取血。收集各組大鼠脂肪、肝臟和腸道，－80 ℃保存，備用。

1.3.4 大鼠身體指標(biāo)和進(jìn)食量測(cè)定

大鼠體質(zhì)量每周稱量1 次，另外每日給各組大鼠添加新鮮飼料，并于第2天同一時(shí)間稱取剩余飼料量，計(jì)算每日攝食量，并按式（1）計(jì)算能量轉(zhuǎn)化率。

用4 ℃生理鹽水沖洗大鼠附睪脂肪和腎周脂肪表面血漬，濾紙吸干表面水分后稱質(zhì)量，按公式（2）計(jì)算脂肪指數(shù)。

1.3.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

主動(dòng)脈取血于EP管中，在4 ℃下3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，放置于－80 ℃冰箱中保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TG、TC、GSH、LEP、ADP、TNF-α、IL-6水平以及SOD、CAT、LPS的活力。

1.3.6 大鼠肝臟TG和TC水平測(cè)定

準(zhǔn)確稱取肝臟組織質(zhì)量，加入9 倍體積的無(wú)水乙醇于冰水浴條件下機(jī)械研磨，3 000 r/min離心后取上清液測(cè)定肝臟勻漿TG和TC含量，結(jié)果以每克蛋白計(jì)。

1.3.7 大鼠肝臟和結(jié)腸組織切片病理學(xué)觀察

取大鼠肝臟和結(jié)腸的相同部位于4%多聚甲醛溶液中固定，然后對(duì)肝臟進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）和油紅O染色，對(duì)結(jié)腸進(jìn)行HE和過(guò)碘酸雪夫染色（periodic acid-Schiff，PAS）染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化并拍照[10]。

1.3.8 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)腸組織緊密連接蛋白的表達(dá)水平

將石蠟包埋的結(jié)腸組織切片脫蠟、水化，置于EDTA修復(fù)緩沖液中抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性CAT，甩干磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），胎牛血清封閉30 min，加入第1種一抗4 ℃孵育過(guò)夜，玻片于PBS中洗滌（5 min、3 次），加入對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育50 min，玻片于PBS中洗滌（5 min、3 次），加CY3-TSA孵育10 min后，玻片于PBS中洗滌（5 min、3 次），進(jìn)行微波處理除去已結(jié)合到組織上的一抗、二抗；然后加入第2種一抗于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，玻片于PBS中洗滌（5 min、3 次），甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，自發(fā)熒光猝滅，封片，同一背景視野下鏡檢拍照。用Image-pro Plus 6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性區(qū)域的平均積分光密度（integral optical density，IOD）。

1.3.9 糞便微生物菌群分析

將收集的大鼠糞便進(jìn)行液氮處理后，采用十二烷基硫酸鈉方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并檢測(cè)其濃度和純度，然后使用稀釋后的基因組DNA為模板，以細(xì)菌正向引物（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG）和反向引物（805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后使用Illumina平臺(tái)測(cè)序（天根生化科技（北京）有限公司），所得序列使用Uclust v1.2.22軟件進(jìn)行聚類得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[11]。在菌群OTU水平上計(jì)算Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估菌群多樣性，同時(shí)對(duì)物種豐度進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）及分類注釋。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用方差分析和最小顯著性差異法檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘平陽(yáng)黃湯’感官評(píng)價(jià)和理化成分分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所選用‘平陽(yáng)黃湯’樣品色澤黃褐較潤(rùn)，有清香，湯色淺黃、明亮，滋味醇爽，葉底黃亮；其水浸出物、茶多酚、游離氨基酸和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42.29%、19.40%、5.27%和9.44%，基本符合黃茶的主要品質(zhì)化學(xué)特征[12]。

2.2 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量和脂肪質(zhì)量的影響

由圖1A、B可知，大鼠經(jīng)過(guò)8 周飼養(yǎng)后，HFD組大鼠體質(zhì)量及其增長(zhǎng)量極顯著高于ND組大鼠（P＜0.01），表明長(zhǎng)期高脂飲食易使體質(zhì)量增加；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，HFD-L、HFD-M和HFD-H組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量均極顯著降低（P＜0.01），其中HFD-M組與ND組接近，HFD-H組甚至低于ND組。

由圖1C、D可知，‘平陽(yáng)黃湯’水提物對(duì)高脂飲食大鼠的日常食物攝入量和能量轉(zhuǎn)化率均有不同程度的抑制作用，隨著劑量的增加，其抑制作用增強(qiáng)。HFD-M和HFD-H組的日攝食量極顯著低于HFD組（P＜0.01）。

高脂飲食引起的肥胖往往伴隨脂肪組織的堆積，為此研究‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠脂肪組織的影響。由圖1E～H可知，與ND組相比，HFD組大鼠附睪、腎周脂肪的質(zhì)量及脂肪指數(shù)均極顯著升高（P＜0.01）；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’水提物干預(yù)后，高脂飲食大鼠脂肪質(zhì)量和脂肪系數(shù)均出現(xiàn)不同程度的下降，其中HFD-L、HFD-M和HFD-H組附睪和腎周脂肪質(zhì)量以及HFD-H組附睪和腎周脂肪指數(shù)均極顯著降低（P＜0.01）。

圖1 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠體質(zhì)量、攝食量和脂肪組織的影響Fig. 1 Effect of Pingyang yellow tea on body weights, food intake and adipose tissues in rats

2.3 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠血脂和肝臟脂質(zhì)的影響

由圖2可知，與ND組相比，HFD組大鼠血清和肝臟TG、TC水平均極顯著升高（P＜0.01）；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，大鼠血清和肝臟TG、TC水平出現(xiàn)不同程度下降，其中HFD-H組大鼠血脂和肝臟脂質(zhì)指標(biāo)均極顯著下降（P＜0.01）。說(shuō)明‘平陽(yáng)黃湯’能有效調(diào)控高脂飲食引起的血脂水平紊亂和肝臟脂肪積累。

圖2 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠血脂和肝臟脂質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of Pingyang yellow tea on serum and liver lipids in HFD-fed rats

2.4 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，與ND組相比，HFD組大鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)空泡化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟內(nèi)有大量脂質(zhì)聚集。與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，大鼠肝臟脂滴明顯減少，肝細(xì)胞脂肪變性程度和炎癥減弱，細(xì)胞排列較整齊，其中HFD-H組肝細(xì)胞排列整齊，沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿均勻。說(shuō)明‘平陽(yáng)黃湯’能有效調(diào)控高脂飲食引起的肝臟病變和脂質(zhì)代謝紊亂。

圖3 各組大鼠肝臟HE和油紅O染色切片（×100）Fig. 3 HE-stained and oil red-stained sections of rat liver tissues from each treatment group (× 100)

2.5 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠血清脂肪因子、炎癥因子和氧化應(yīng)激水平的影響

由圖4A、B可知，與ND組相比，HFD組大鼠血清LEP和ADP質(zhì)量濃度均極顯著升高（P＜0.01）；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后大鼠血清LEP質(zhì)量濃度有不同程度的下降，其中HFD-L和HFD-M組LEP質(zhì)量濃度有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性變化（P＞0.05），HFD-H組LEP質(zhì)量濃度極顯著下降（P＜0.01）；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’各干預(yù)組ADP質(zhì)量濃度均極顯著下降（P＜0.01），且與ND組接近。這表明‘平陽(yáng)黃湯’能有效緩解高脂飲食引起的血清脂肪因子水平升高。

由圖4C～H可知，與ND組相比，HFD組大鼠血清TNF-α、IL-6和LPS水平均極顯著升高（P＜0.01），血清SOD、CAT和GSH水平極顯著降低（P＜0.01），這表明高脂飲食易誘發(fā)大鼠全身性炎癥和氧化應(yīng)激。與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，大鼠血清TNF-α、IL-6和LPS水平呈不同程度的下降，其中HFD-M和HFD-H組的血清TNF-α、IL-6和LPS水平極顯著下降（P＜0.01）。與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，大鼠血清SOD、CAT和GSH水平呈不同程度的升高，其中HFD-H組極顯著升高（P＜0.01）。這表明‘平陽(yáng)黃湯’水提物能有效緩解高脂飲食誘發(fā)的全身性炎癥和氧化應(yīng)激。

圖4 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠血清脂肪因子、炎癥因子和氧化應(yīng)激水平的影響Fig. 4 Effect of Pingyang yellow tea on serum adipocytokines,inflammatory cytokines and oxidative stress levels in rats

2.6 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，與ND組相比，HFD組大鼠腸道細(xì)胞排列紊亂，絨毛破裂且存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)組大鼠結(jié)腸形態(tài)得到不同程度的改善，其中HFD-L組細(xì)胞排列較整齊，絨毛脫落減少，絨毛完整性高，基本沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。大鼠腸道PAS染色切片顯示，與ND組相比，HFD組腸道杯狀細(xì)胞明顯減少且分布不均；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)組結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量均有不同程度的恢復(fù)，其中HFD-H組恢復(fù)效果明顯。這表明‘平陽(yáng)黃湯’能有效改善高脂飲食大鼠的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖5 大鼠結(jié)腸組織HE和PAS染色切片（×100）Fig. 5 HE-stained and PAS-stained sections of colon tissues from rats (× 100)

2.7 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠結(jié)腸組織腸道屏障的影響

腸道緊密連接蛋白主要位于腸道上皮細(xì)胞，是維持腸道完整性的重要部分。由圖6可知，與ND組相比，HFD組大鼠ZO-1和閉鎖蛋白的表達(dá)均極顯著下降（P＜0.01）；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，3 組高脂飲食大鼠ZO-1蛋白表達(dá)水平均極顯著增加（P＜0.01），HFD-M和HFD-H組大鼠閉鎖蛋白表達(dá)極顯著增加（P＜0.01）。這表明‘平陽(yáng)黃湯’能有效修復(fù)高脂飲食引起的腸道屏障損傷。

圖6 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)大鼠緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of Pingyang yellow tea on the expression of tight junction proteins

2.8 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠腸道菌群的影響

2.8.1 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

大鼠糞便微生物基因組16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。如圖7A、B所示，與ND組相比，HFD組大鼠Shannon指數(shù)顯著下降（P＜0.05），Simpson指數(shù)下降但無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都有不同程度改善，但改善效果不顯著（P＞0.05）。

對(duì)大鼠腸道微生物門水平的物種豐度進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果圖7C所示，ND組與HFD組離散程度較大但顯著分離，‘平陽(yáng)黃湯’各干預(yù)組與HFD組分離趨勢(shì)較明顯。門水平的分類學(xué)結(jié)果（圖7D、E）表明，大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。與ND組相比，HFD組的厚壁菌門相對(duì)豐度降低；與HFD組相比，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，HFD-L、HFD-M和HFD-H組厚壁菌門相對(duì)豐度降低，擬桿菌門相對(duì)豐度升高。此外，與ND組相比，HFD組F/B比值（厚壁菌門/擬桿菌門相對(duì)豐度比值）增加（P＞0.05）；與HFD組相比，HFD-M和HFD-H組F/B比值下降（P＞0.05）。如圖7F所示，阿克曼菌屬（Akkermansia）、Blautia、顫螺菌屬（Oscillospira）、擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬（Clostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、多爾氏菌屬（Dorea）為大鼠腸道微生物屬水平的優(yōu)勢(shì)菌屬。以上結(jié)果表明‘平陽(yáng)黃湯’可以改善肥胖導(dǎo)致的腸道菌群變化，有效調(diào)節(jié)組間腸道菌群的變化，這與線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）所示的腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌得分結(jié)果趨勢(shì)（圖7G）一致。

圖7 ‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠腸道微生物的影響Fig. 7 Effect of Pingyang yellow tea on intestinal microbiome in rats

2.8.2 大鼠腸道中特定微生物變化與機(jī)體指標(biāo)的相關(guān)性

為進(jìn)一步分析高脂飲食和‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)大鼠腸道菌群的影響，選取相對(duì)豐度排名前85的OTU，分析‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后高脂飲食大鼠腸道菌群OTU的變化。結(jié)合圖8A和表1可知，OTU0009、OTU0004、OTU0003和OTU0005的相對(duì)豐度變化表明，‘平陽(yáng)黃湯’能有效逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的腸道菌群變化。與腸道屏障功能相關(guān)的部分腸道微生物與機(jī)體指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果（圖8B）表明，梭菌屬相對(duì)豐度與體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、血清TG濃度、血清TC濃度和血清IL-6濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；F/B比值與體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、腎周脂肪質(zhì)量、血清TG和TNF-α水平呈正相關(guān)（P＞0.05）；阿克曼菌屬相對(duì)豐度與體質(zhì)量、血清TG濃度、TC濃度、血清TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)；毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）相對(duì)豐度與體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、血清TC濃度、血清LPS水平和IL-6質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)（P＞0.05）。

表1 各組大鼠腸道微生物中相對(duì)豐度排名前85的OTU對(duì)應(yīng)的細(xì)菌分類學(xué)信息Table 1 Taxonomic information of top 85 most abundant bacterial OTUs in rat gut microbiota

續(xù)表1

圖8 大鼠腸道微生物相對(duì)豐度及與機(jī)體指標(biāo)的相關(guān)性Fig. 8 Changes of intestinal microorganisms in rats and correlation with body indexes

3 討 論

世界范圍內(nèi)肥胖發(fā)病率越來(lái)越高，肥胖已成為全球性的健康問(wèn)題[13]。肥胖一旦形成就很難控制，然而目前市場(chǎng)上常用的減肥藥物和節(jié)食措施副作用較大，因此尋求健康有效的植物資源用于防治肥胖是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[14]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及研究表明，多種黃茶能顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪沉積和體質(zhì)量增加，有效調(diào)控高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。然而，目前鮮有研究證實(shí)‘平陽(yáng)黃湯’對(duì)高脂飲食大鼠的預(yù)防肥胖作用。

高脂飲食誘導(dǎo)肥胖形成的過(guò)程中往往伴隨著體內(nèi)能量代謝失衡和脂質(zhì)代謝紊亂[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘平陽(yáng)黃湯’能顯著抑制高脂飲食大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)和白色脂肪（附睪脂肪和腎周脂肪）增加，降低脂肪指數(shù)和能量轉(zhuǎn)化率，改善血脂和血清脂肪因子水平，降低血清炎癥和氧化應(yīng)激因子水平，減少肝臟的脂質(zhì)堆積和損傷。這些結(jié)果表明‘平陽(yáng)黃湯’能有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖形成和代謝紊亂。

腸道屏障是指腸道上皮能夠防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入人體其他部位的結(jié)構(gòu)和功能的總和[16]。腸道屏障完整性的破壞與代謝紊亂密切相關(guān)，其中由于腸道屏障完整性受損而引起的代謝性內(nèi)毒素血癥被認(rèn)為是導(dǎo)致胰島素抵抗和肥胖的主要原因。腸道上皮層受損會(huì)降低腸道的緊密連接性，增加腸道通透性，致使腸道內(nèi)革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的LPS通過(guò)腸道上皮進(jìn)入血液進(jìn)行全身循環(huán)，LPS與Toll樣受體結(jié)合后導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加，引發(fā)機(jī)體全身炎癥，最終導(dǎo)致肥胖的發(fā)生[17-18]。因此，維持腸道屏障的完整性和緊密性是預(yù)防肥胖的重要方向。腸道組織病理切片顯示，‘平陽(yáng)黃湯’可有效調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠腸道黏膜形態(tài)，改善腸道炎癥和黏膜完整性。腸道緊密連接主要由跨膜蛋白、連接復(fù)合蛋白和肌動(dòng)蛋白構(gòu)成，其中ZO-1和閉鎖蛋白是緊密連接蛋白中的重要蛋白，可作為腸道物理屏障的標(biāo)志物[19-20]。免疫熒光分析結(jié)果表明，‘平陽(yáng)黃湯’可顯著恢復(fù)高脂飲食大鼠的ZO-1和閉鎖蛋白表達(dá)，增強(qiáng)腸道的緊密連接和物理屏障功能。同時(shí)，‘平陽(yáng)黃湯’可有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)的腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白可以在腸黏膜上形成一層致密和滲透性強(qiáng)的黏液，構(gòu)成腸道化學(xué)屏障，防止微生物和有毒物質(zhì)的侵入[21]。此外，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后，大鼠血清中LPS、TNF-α和IL-6水平顯著降低，表明‘平陽(yáng)黃湯’能有效減少腸道內(nèi)LPS溢出，抑制代謝性內(nèi)毒性和系統(tǒng)性炎癥，這可能是由于黃茶中的兒茶素物質(zhì)有效改善了腸道炎癥和腸道屏障，抑制全身系統(tǒng)性炎癥的進(jìn)一步發(fā)展[3]。以上結(jié)果表明，‘平陽(yáng)黃湯’可以通過(guò)增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量，提高緊密連接蛋白的表達(dá)，維護(hù)腸道屏障的完整性，有效預(yù)防高脂飲食引起的代謝性內(nèi)毒素和系統(tǒng)性炎癥。

腸道菌群一直被認(rèn)為與肥胖密切相關(guān)[22-23]。無(wú)菌動(dòng)物和微生物移植實(shí)驗(yàn)表明腸道菌群是肥胖和肥胖相關(guān)代謝紊亂形成和發(fā)展的重要起因[24]。本實(shí)驗(yàn)探究了‘平陽(yáng)黃湯’在預(yù)防高脂飲食大鼠肥胖過(guò)程中對(duì)腸道菌群的影響。通常肥胖的形成往往伴隨著腸道菌群多樣性的改變[25]?；诙鄻有灾笖?shù)和PLS-DA分析表明，高脂飲食大鼠腸道微生物的多樣性與ND組相比顯著下降，‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后其腸道微生物群落多樣性得到有效改善，群落組成改變，說(shuō)明腸道菌群的組成與肥胖的形成密切相關(guān)。在門水平上，高脂飲食誘導(dǎo)微生物厚壁菌門相對(duì)豐度增加，擬桿菌門相對(duì)豐度下降，導(dǎo)致F/B比值升高，中、高劑量的‘平陽(yáng)黃湯’可以有效降低F/B比值，從而緩解F/B比例升高導(dǎo)致的能量吸收增加[26]。

LDA得分和屬水平分類學(xué)的分析結(jié)果表明，‘平陽(yáng)黃湯’能促進(jìn)與肥胖預(yù)防相關(guān)有益菌的增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)。阿克曼菌屬作為一種降解黏蛋白的細(xì)菌，可有效增強(qiáng)脂肪組織代謝和腸黏膜屏障作用，緩解代謝性內(nèi)毒素血癥，改善高脂飲食引起的肥胖[27]。本實(shí)驗(yàn)中，‘平陽(yáng)黃湯’能明顯提高高脂飲食大鼠腸道阿克曼菌屬相對(duì)豐度，相關(guān)性分析結(jié)果顯示阿克曼菌屬相對(duì)豐度與體質(zhì)量、血清TC濃度、血清TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。擬桿菌屬相對(duì)豐度在‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后明顯上升，其可以將腸道內(nèi)未消化的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而給腸上皮細(xì)胞提供能量，調(diào)節(jié)腸道菌群，這可能跟黃茶中茶多糖的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[28-30]。梭菌屬作為厚壁菌門中非常重要的一類菌，是導(dǎo)致機(jī)體能量攝入過(guò)度的主要原因，而本研究結(jié)果表明‘平陽(yáng)黃湯’干預(yù)后其相對(duì)豐度提高，相關(guān)性分析結(jié)果顯示其與血清中的炎癥因子水平呈負(fù)相關(guān)，這可能與梭菌屬能促進(jìn)腸道中LPS的吸收有關(guān)[31]。這些結(jié)果表明‘平陽(yáng)黃湯’能有效調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠的腸道菌群紊亂。

綜上所述，研究表明‘平陽(yáng)黃湯’可以顯著降低高脂飲食大鼠的脂肪累積和血脂水平，改善肝組織脂肪性損傷，有效緩解全身慢性炎癥和氧化應(yīng)激水平，提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障作用，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，促進(jìn)與肥胖預(yù)防相關(guān)有益菌的增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)，從而有效預(yù)防肥胖。