脫水香菇不同貯藏水分活度下細(xì)菌菌落演替規(guī)律及關(guān)鍵菌控制

蘇安祥，浦浩亮，胡秋輝，徐 輝，劉建輝，謝旻皓，裴 斐，楊文建

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

香菇味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多糖等生物活性成分[1]，具有細(xì)胞保護(hù)[2]、改善肥胖[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]等多種功能，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。香菇是我國產(chǎn)量最大的食用菌品種，據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2019年我國香菇產(chǎn)量1 115.94萬 t，占所有食用菌總產(chǎn)量的28%。包括香菇在內(nèi)的食用菌加工產(chǎn)品主要以脫水產(chǎn)品為主，2019年干貨類食用菌創(chuàng)匯額23.08億 美元，占食用菌出口創(chuàng)匯總金額的64%。香菇的脫水加工方式有熱風(fēng)干燥[5]、脈沖氣體射流干燥[6]、微波干燥[7]、冷凍干燥[7]以及聯(lián)合干燥[7]等方式，目前研究主要集中在脫水干燥工藝的優(yōu)化[8]、脫水過程中營養(yǎng)成分及風(fēng)味變化[9]等，脫水香菇在貯藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律及控制技術(shù)研究鮮有報(bào)道。

目前，香菇的脫水工藝已相對成熟，但是脫水香菇易吸潮，貯藏期間產(chǎn)品水分的變化是影響脫水香菇品質(zhì)的主要因素[10-11]。同時，在實(shí)際貯運(yùn)過程中，貯藏條件良莠不齊，包裝方式粗放簡陋，僅采用普通塑料包裝甚至無包裝，這都會導(dǎo)致脫水香菇發(fā)生微生物超標(biāo)、食用品質(zhì)劣變等現(xiàn)象[12]。本課題組前期對脫水胡蘿卜[13]、香蔥[14]、雙孢菇[15]等進(jìn)行了貯藏期間品質(zhì)分析研究，發(fā)現(xiàn)微生物污染會導(dǎo)致脫水蔬菜腐爛、產(chǎn)生不良?xì)馕兑约耙l(fā)食品安全問題，并且不同品種蔬菜貯藏期間微生物變化規(guī)律不同。因此研究不同水分活度（water activity，aw）環(huán)境下脫水香菇的細(xì)菌菌落變化規(guī)律，確定關(guān)鍵危害菌并尋找其控制方法，對通過開發(fā)新型包裝、研究適宜貯藏技術(shù)來控制脫水香菇產(chǎn)品質(zhì)量、延長貨架期具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)研究不同aw環(huán)境下貯藏脫水香菇的細(xì)菌菌落變化，篩選影響脫水香菇衛(wèi)生安全的主要危害菌，并針對關(guān)鍵菌進(jìn)行電子束輻照控制，為脫水香菇的品質(zhì)控制、貨架期研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇采購自福建漳州生產(chǎn)基地，經(jīng)江蘇興化脫水食品集團(tuán)脫水處理（熱風(fēng)干燥，溫度60 ℃，風(fēng)速3.5 m/s），獲得最終水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（11.57±0.01）%、aw為（0.33±0.03）的脫水香菇。

金黃色葡萄球菌 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；C7～C33正構(gòu)烷烴、二丙基二硫醚 Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；TIANamp細(xì)菌DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司（北京）；平板計(jì)數(shù)瓊脂、乳酸、苯酚、核酸染色劑、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Tris、Tris-平衡酚、DNA聚合酶、dNTP mixture、電泳loading buffer等 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司；SX500快速自動高壓滅菌儀 日本TOMY Digital Biology公司；SF-CF-2A超凈工作臺 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；VOSHIN-600R無菌均質(zhì)機(jī)無錫沃信儀器有限公司；Power Pac Universal型電泳儀、Mini Protean 3 Cell小型電泳槽 美國Bio-Rad公司；ESS-010-03型電子直線加速器 日本IHI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品貯藏條件設(shè)定

參考已報(bào)道的方法[16-17]配制K2CO3、NaNO2、NaCl和KCl 4 種飽和溶液，制備不同aw（0.43、0.67、0.76和0.84）環(huán)境，將配制好的4 種飽和鹽溶液（200 mL）分別置于干燥器（220 mm口徑）內(nèi)，然后將80 g大小均一、新制備的熱風(fēng)干燥脫水香菇放入，用凡士林密封后置于25 ℃恒溫恒濕箱貯藏50 d，每個aw設(shè)置3 組平行。

1.3.2 脫水香菇的細(xì)菌DNA提取及測序

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》中的方法提取脫水香菇細(xì)菌的菌液。

提取0 d樣品和不同aw環(huán)境下貯藏50 d樣品的細(xì)菌DNA（共5 組樣本），每組樣本取3個平行。使用上述菌液，采用細(xì)菌DNA試劑盒提取脫水香菇細(xì)菌總DNA。將提取的DNA樣本放入凍存管中密封，在V3～V4區(qū)域，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增細(xì)菌DNA序列（上游引物序列：341F 5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；下游引物序列：805R 5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），采用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序[18]。

1.3.3 脫水香菇的細(xì)菌DNA序列數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌DNA序列的數(shù)據(jù)分析通過如下步驟完成：

第一，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，使用FLASH軟件得到拼接的序列，利用Usearch過濾去除非特異性擴(kuò)增片段，從而得到有效序列[19]。

第二，利用UPARSE軟件（v7.0.1001）將過濾后的序列以97%相似性聚類，從而得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并進(jìn)行隨機(jī)抽取[20]。使用Mothur軟件，比對ribosomal database project（RDP）數(shù)據(jù)庫，標(biāo)注OTU表的種屬信息，并統(tǒng)計(jì)樣本在生物分類學(xué)各分類水平下的物種組成和相對豐度[21]?；赗DP數(shù)據(jù)庫，利用Mothur軟件進(jìn)行80%置信水平的分類學(xué)分配[22]。序列過濾的主要步驟是：1）選擇含有條形碼和正向引物的序列，并消除具有單個堿基對的序列；2）去除短于150 bp的序列、含不明確的堿基對或者引物中有兩個以上錯誤匹配的序列；3）條形碼和正向引物的消除。使用Mothur軟件將有效序列聚集到不同物種水平的OTU[23]。

1.3.4 金黃色葡萄球菌侵染脫水香菇

將109CFU/mL金黃色葡萄球菌菌懸液按照質(zhì)量比1∶10的比例均勻接種到脫水香菇中[24]，室溫下風(fēng)干18～24 h，控制水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在10%左右用于殺菌實(shí)驗(yàn)，測得香菇中微生物含量為5.6×108CFU/g，相當(dāng)于8.7（lg（CFU/g））。將80 g均勻接種后的脫水香菇裝入無菌塑料自封袋中，密封后進(jìn)行輻照。

1.3.5 電子束輻照處理金黃色葡萄球菌侵染后的脫水香菇

采用ESS-010-03電子直線加速器對脫水香菇進(jìn)行輻照處理。設(shè)備具體參數(shù)如下：額定能量10 MeV，功率11.7 kW，重復(fù)可變頻率5～50 pps，掃描電流9.8 A，掃描高度520 mm，不均勻度小于5%。將裝有脫水香菇的無菌塑料自封袋密封后用于電子束輻照，輻照劑量分別控制在1、2、3、4、5 kGy，樣品采用半吸收劑量、翻轉(zhuǎn)180°的輻照方式，以保證樣品吸收劑量均勻。每個劑量水平重復(fù)5 次。

1.3.6 金黃色葡萄球菌菌落計(jì)數(shù)

金黃色葡萄球菌總數(shù)參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析（oneway analysis of variance）的最小顯著性差異法（least significant differences，LSDs）對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。使用MURTHOR、R和Lefse軟件進(jìn)行Alpha、Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同aw環(huán)境對脫水香菇細(xì)菌的α多樣性影響

稀釋曲線用來評價(jià)測序量是否足以覆蓋所有類群，并間接反映樣品中物種的豐富程度。圖1A中，樣品的細(xì)菌DNA稀釋曲線隨著抽取Reads數(shù)增加而趨于平穩(wěn)，說明測序深度已經(jīng)覆蓋到脫水香菇細(xì)菌的所有物種，測序數(shù)據(jù)量合理。Shannon稀釋曲線用來評價(jià)測序量是否足夠，并間接反映樣品中物種的豐富程度。由圖1B、C可知，0 d樣品的Alpha多樣性豐富程度最低，aw=0.43、0.67、0.76和0.84環(huán)境下樣品的Shannon指數(shù)遠(yuǎn)高于0 d，并且隨著aw增加而上升。Simpson指數(shù)用來描述從一個群落中連續(xù)兩次抽樣所得到的個體數(shù)屬于同一種的概率[25]。圖1D中可以看出，Simpson指數(shù)隨著aw上升而降低，說明樣品細(xì)菌的多樣性增加。以上結(jié)果表明，脫水香菇貯藏期間細(xì)菌的多樣性隨著環(huán)境aw上升而增加。

2.2 不同aw環(huán)境對脫水香菇細(xì)菌的β多樣性影響

樣品聚類分析可以從整體上描述樣品間的相似性，相似度越高的樣品越會被優(yōu)先聚類。不同處理樣品的聚類分析如圖2A所示，貯藏50 d后，aw=0.43與aw=0.67環(huán)境下的樣品細(xì)菌組成相似度高于0 d樣品和aw=0.84組樣品。主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果（圖2B）顯示，0 d樣品的信號值位于第二象限，但隨著aw的上升，各個樣品的信號值從左向右移動，且aw值越高，其在PCA圖中距離0 d樣品最遠(yuǎn)。說明環(huán)境aw越高，脫水香菇細(xì)菌組成在貯藏過程中變化越大，這與圖2A所示結(jié)果一致。

以上結(jié)果說明高aw環(huán)境促進(jìn)了脫水香菇細(xì)菌的生長，并且細(xì)菌多樣性隨著環(huán)境aw升高而增加。

2.3 不同aw環(huán)境對脫水香菇細(xì)菌科水平組成的影響

熱圖可以對物種和樣本分別進(jìn)行聚類，并且熱圖中可展示每個樣本的細(xì)菌組成，越相似的樣品在聚類樹上的距離越近。這種分析方法能夠直觀地反映出所有樣本在特定生物水平上物種組成的相似性，并且還可以顯示某些菌群分布的特異性。由圖3可知，在科水平上，0 d樣品主要優(yōu)勢細(xì)菌為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）以及明串珠菌科（Leuconostocaceae），其中腸桿菌科的相對豐度達(dá)到50%。以上4 種細(xì)菌廣泛存在于自然界中，其中鏈球菌科和明串珠菌科均屬于乳桿菌目（Lactobacillales）。該目微生物可以利用消耗植物基質(zhì)中的營養(yǎng)成分進(jìn)行生長代謝，可造成多種食品的腐敗[26]。貯藏50 d后，腸桿菌科的相對豐度隨著環(huán)境aw的升高而降低，在aw=0.84的樣品中僅達(dá)到3%左右。鏈球菌科和明串珠菌科相對豐度出現(xiàn)了類似的下降趨勢。然而葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的相對豐度隨著環(huán)境aw增加而上升，這是由于高aw環(huán)境中更利于這兩個科的細(xì)菌生長繁殖[27]。這兩個科的菌株在生長過程中會產(chǎn)生有害代謝物（如生物胺和腸毒素等），能夠?qū)е露喾N食源性疾病[27]。

圖3中聚類分析結(jié)果表明，在aw=0.43和aw=0.67環(huán)境下貯藏脫水香菇細(xì)菌菌相的相似度較高，首先被聚類到一起，之后與aw=0.76樣品聚類，接著與aw=0.84的樣品聚類，最后與0 d樣品聚類。

2.4 不同aw環(huán)境對脫水香菇細(xì)菌屬水平組成的影響

圖4A為脫水香菇在屬水平上的細(xì)菌菌落組成。在貯藏過程中，不同aw環(huán)境屬水平上的菌相發(fā)生明顯變化。0 d樣品，優(yōu)勢菌屬為愛文氏菌屬（Ewingellaspp.）、乳球菌屬（Lactococcusspp.）、魏斯氏菌屬（Weissellaspp.）和假單胞菌屬（Pseudomonasspp.），其中愛文氏菌屬的相對豐度最高，達(dá)到（34.63±2.09）%，乳球菌屬達(dá)到（22.00±2.43）%。這些細(xì)菌是食用菌生產(chǎn)加工過程中常見的細(xì)菌，對香菇的品質(zhì)有重要影響，例如，假單胞菌屬是導(dǎo)致雙孢蘑菇和香菇等食用菌類農(nóng)產(chǎn)品采后腐敗的優(yōu)勢腐敗微生物[28]，愛文氏菌屬中的部分菌株可以引起雙孢蘑菇、香菇等常見菇類一種“內(nèi)柄壞死”的褐變現(xiàn)象[29]。

由圖4B可知，貯藏50 d后，魏斯氏菌屬、乳球菌屬相對豐度下降至5%以下，aw=0.84處理組愛文氏菌屬的相對含量從初始的（34.63±2.09）%降到（0.51±0.14）%。考克氏菌屬（Kocuriaspp.）、短狀桿菌屬（Brachybacteriumspp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）相對豐度隨環(huán)境aw增加而上升，而假單胞菌屬隨著環(huán)境aw增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中考克氏菌屬、短狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬都屬于革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁較厚，可達(dá)20～80 nm。相對于革蘭氏陰性菌假單胞菌，革蘭氏陽性菌機(jī)械抗性與對干燥的抗性更高，在脫水干燥加工過程中更易存活[30]。此外，部分魏斯菌屬可分泌具有抑菌活性的多肽，這類多肽具有抑制腐敗微生物和致病菌生長的能力[31]。魏斯氏菌屬相對豐度降低可能給其他細(xì)菌生長提供了條件。葡萄球菌屬中的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌之一，廣泛存在于自然環(huán)境中，對各種理化因素都有較高的抵抗力，常在干制品中存在并導(dǎo)致食源性疾病[32]。

圖4 脫水香菇在屬水平上的細(xì)菌組成和主要細(xì)菌的相對豐度變化Fig. 4 Bacteria composition in dried Lentinus edodes at the genus level and relative abundance of major genera

2.5 脫水香菇貯藏過程中關(guān)鍵危害菌的篩選

采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)量（LDA effect size，LEfSe）方法，以|LDA|＞2且P＜0.05作為差異篩選閾值，用于篩選最可能解釋組間差異的物種。

圖5A為LEfSe進(jìn)化分支圖，篩選出各組中組間豐度顯著差異（P＜0.05）的物種，每層物種標(biāo)記的注釋從外向內(nèi)表示門、綱、目、科、屬和種。對LEfSe進(jìn)化分支圖中的物種進(jìn)一步篩選得到|LDA|＞2的物種，即為組間豐度顯著差異的物種，得到圖5B。由圖5A、B可知，在細(xì)菌的科水平上組間豐度顯著差異的物種從數(shù)量上總體隨著環(huán)境aw增大而增多。0 d樣品和aw=0.43、0.67和0.76樣品的顯著差異物種數(shù)目分別為5、4、8、10個。此外，與0 d樣品相比，在科水平上，aw=0.84環(huán)境下的樣品有24個科的細(xì)菌的相對豐度具有顯著差異。這些科的細(xì)菌包括紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）等。而在屬水平上，與0 d相比，aw=0.84貯藏的樣品有20個菌屬的豐度具有顯著差異，其中包括考克氏菌屬（Kocuriaspp.）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacterspp.）、片紅球菌屬（Rhodococcusspp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）、副球菌屬（Paracoccusspp.）和鏈球菌屬（Streptococcusspp.）。

圖5 組間線性判別分析效應(yīng)量分析結(jié)果Fig. 5 Effect-size analysis of linear discriminant analysis between groups

綜合考慮脫水香菇貯藏過程中細(xì)菌變化情況及其對食品安全的危害風(fēng)險(xiǎn)，選定金黃色葡萄球菌作為關(guān)鍵危害菌進(jìn)行下一步控制技術(shù)研究。

2.6 電子束輻照對脫水香菇中金黃色葡萄球菌的控制效果

采用殺菌前后微生物減少數(shù)量的對數(shù)來評價(jià)電子束輻照對于金黃色葡萄球菌的殺菌效果。從圖6可以看出不同劑量的電子束輻照對于脫水香菇上金黃色葡萄球菌殺滅效果的影響，總體上呈現(xiàn)輻照劑量越高，殺菌效果越好的現(xiàn)象。1、4 kGy輻照處理侵染樣品的金黃色葡萄球菌數(shù)降低了4.4（lg（CFU/g）），而經(jīng)過4 kGy處理樣品金黃色葡萄球菌數(shù)降低超過6（lg（CFU/g）），5 kGy則可以幾乎殺死全部金黃色葡萄球菌。文獻(xiàn)報(bào)道了其他學(xué)者采用電子束輻照技術(shù)控制金黃色葡萄球菌的效果，王海宏等[33]研究了速凍蘆筍的電子束檢疫殺菌和輻照工藝，接種到速凍蘆筍之后，1.5 kGy的劑量可以使金黃色葡萄球菌數(shù)降低4.39（lg（CFU/g））；岳玲等[34]研究了電子束輻照對冷鮮雞肉的殺菌效果，根據(jù)回歸方程計(jì)算得出1 kGy的電子束輻照使金黃色葡萄球菌數(shù)降低4（lg（CFU/g））；Kim等[35]的研究結(jié)果表明劑量在3 kGy電子束輻照可以使披薩芝士中的金黃色葡萄球菌降低5.14（lg（CFU/g））。以上結(jié)果表明電子束輻照可以有效控制金黃色葡萄球菌，根據(jù)GB/T 18525.5—2001《干香菇輻照殺蟲防霉工藝》中規(guī)定，干香菇輻照殺蟲工藝劑量為0.7～2.0 kGy，防霉工藝劑量為3～5 kGy，不影響香菇品質(zhì)的最高耐受劑量為8 kGy，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，采用5 kGy劑量的電子束輻照可以有效殺滅脫水香菇中金黃色葡萄球菌，且在最高耐受劑量范圍內(nèi)，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 電子束輻照殺菌效果Fig. 6 Killing effect of electron beam irradiation on Staphylococcus aureus in dried Lentinus edodes

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同aw環(huán)境下脫水香菇貯藏期間的細(xì)菌菌落變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)脫水香菇貯藏初期主要菌為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和明串珠菌科（Leuconostocaceae），其中腸桿菌科的相對豐度達(dá)到50%左右。貯藏50 d后，腸桿菌科的相對豐度明顯降低，在aw=0.84的樣品中僅有3%，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的相對豐度上升，其中葡萄球菌是脫水香菇貯藏期間需要重點(diǎn)控制的關(guān)鍵菌。本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌侵染脫水香菇，通過電子束輻照研究了脫水香菇產(chǎn)品微生物污染控制方法，發(fā)現(xiàn)5 kGy劑量的電子束輻照可以殺滅脫水香菇中幾乎全部金黃色葡萄球菌，且在最高耐受劑量范圍內(nèi)，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。