噬菌體裂解酶結(jié)構(gòu)特征、重組策略及其在控制食源性致病菌中的應(yīng)用

黃振華，張昭寰,2,*，童金蓉，吳 倩，劉 靜，劉海泉,3,4，潘迎捷,3,4，趙 勇,3,4,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（上海）水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

食源性致病菌如單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（簡稱單增李斯特菌）、沙門氏菌（Salmonellaspp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等的污染，給全球食品工業(yè)和衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了持久的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)，并帶來高額的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而細(xì)菌耐藥性的不斷出現(xiàn)與傳播以及生物被膜的形成，加劇了食源性致病菌的潛在風(fēng)險,成為全球普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生焦點(diǎn)問題[1]。盡管國內(nèi)外食品衛(wèi)生條件不斷改善，公眾食品安全意識顯著增強(qiáng)，但食源性疾病仍嚴(yán)重影響著食品安全與人類健康[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道[3]，每年依舊約有6億 人在食用污染食品后患病，導(dǎo)致約42萬 人死亡，中低收入國家每年因食品安全問題而在生產(chǎn)力和醫(yī)療費(fèi)用方面損失近1 100億 美元。

傳統(tǒng)的食源性致病菌殺滅與控制技術(shù)中，基于熱加工的技術(shù)有可能破壞食品本身的質(zhì)地與營養(yǎng)，化學(xué)類殺菌技術(shù)不僅容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而且部分消毒處理可促使致病菌進(jìn)入“活的不可培養(yǎng)”狀態(tài)[4]，增加了食品二次污染風(fēng)險。因此，為了保證現(xiàn)代食品工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，迫切需要新型殺菌、控菌技術(shù)的研發(fā)。噬菌體裂解酶是大部分裂性噬菌體在裂解期釋放一種蛋白，具有很強(qiáng)肽聚糖降解活性，與宿主細(xì)菌接觸后能立即破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而快速殺死細(xì)菌[5-6]。許多研究表明噬菌體裂解酶在體內(nèi)外均具有較高的抗菌活性，可以靶向作用于相應(yīng)的食源性致病菌，以細(xì)胞壁為靶點(diǎn)水解肽聚糖中不同的化學(xué)鍵[7]，避免致病菌耐藥性的產(chǎn)生[8]。在食品工業(yè)中，噬菌體裂解酶可作為一種高效、安全[9-10]、易獲取的殺菌控菌策略，以靶向降低食品中特定致病菌的污染水平，如葡萄球菌屬[11]、單增李斯特菌[12]等。而且，因其高度的特異性，噬菌體裂解酶不會破壞食品中有益微生物的群落，并對食品的感官和結(jié)構(gòu)特性不產(chǎn)生有害影響[13-14]。

本文通過綜述噬菌體裂解酶的模塊化結(jié)構(gòu)特征及活性位點(diǎn)，著重討論噬菌體裂解酶的重組策略和方法，介紹噬菌體裂解酶生物學(xué)的關(guān)鍵概念，總結(jié)天然噬菌體裂解酶在控制食源性致病菌方面的應(yīng)用進(jìn)展，并對噬菌體裂解酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行展望，討論將噬菌體裂解酶作為潛在天然抗菌劑添加到某些高風(fēng)險食品中的可能性，旨在為食源性致病菌及其耐藥性的有效控制提供一種行之有效的新策略。

1 噬菌體裂解酶的結(jié)構(gòu)特征與作用位點(diǎn)

1.1 結(jié)構(gòu)特征

在自然界中，革蘭氏陽性菌的噬菌體裂解酶呈現(xiàn)模塊化結(jié)構(gòu)，大小約為25～40 kDa[14-16]。如圖1A所示，革蘭氏陽性菌噬菌體裂解酶包含兩個結(jié)構(gòu)域：N端催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain，CD）和C端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cell walls binding domains，CBD），N端與C端通過一段小肽連接[17]。CD能夠作用于細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖網(wǎng)絡(luò)中大部分化學(xué)鍵[7]，CBD則負(fù)責(zé)將噬菌體裂解酶靶向于底物并賦予其識別宿主細(xì)胞的特異性。例如大多數(shù)靶向葡萄球菌的噬菌體裂解酶具有模塊化結(jié)構(gòu)：包括1個N端的半胱氨酸/組氨酸依賴的酰胺水解酶/肽酶結(jié)構(gòu)域（cysteine,histidine-dependent amidohydrolases/peptidase domain，CHAP）、1個中心酰胺酶結(jié)構(gòu)域和1個細(xì)胞壁結(jié)合域[18]。

革蘭氏陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)可有效阻止外源酶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，為菌體提供一個天然的屏障。研究發(fā)現(xiàn)，大部分革蘭氏陰性菌的噬菌體裂解酶是單域結(jié)構(gòu)，大小約為15～20 kDa[14-16]，如圖1B所示，此類裂解酶中存在兩親性螺旋結(jié)構(gòu)，或攜帶正電荷基團(tuán)，賦予其滲透或破壞細(xì)菌外膜的能力，從而接觸和降解肽聚糖層，最終導(dǎo)致菌體破裂而死亡[19-20]。例如噬菌體裂解酶AcLys的C端形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)使其能夠穿透外膜，而C端的帶正電荷基團(tuán)也增強(qiáng)了其穿透外膜的能力[19]。此外，一些革蘭氏陰性菌的噬菌體裂解酶也呈現(xiàn)模塊化的結(jié)構(gòu)：N端含有CBD、C端含有CD[21]（ 圖1B），這種模塊化結(jié)構(gòu)賦予此類裂解酶更強(qiáng)的裂解活性[21-22]。例如，噬菌體裂解酶OBPgp279在N端有1個CBD、在C端有一個溶菌酶結(jié)構(gòu)域，呈現(xiàn)類似革蘭氏陽性菌的模塊化結(jié)構(gòu)，且裂解活性比T4溶菌酶高160 倍[21]。

圖1 典型噬菌體裂解酶的結(jié)構(gòu)及作用位點(diǎn)[7,14-17]Fig. 1 Structures and action sites of typical phage lysins[7,14-17]

1.2 作用位點(diǎn)

噬菌體裂解酶能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層的主要化學(xué)鍵（圖1C），按作用位點(diǎn)不同，可將其分為4 類[13,17,23]：1）MurNAc酶和溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶，可作用于肽聚糖鏈中的GlcNAc或與其相鄰的MurNAc，溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶雖與MurNAc酶的作用位點(diǎn)相同，但作用方式不同，不會裂解糖苷鍵而形成胞壁酸殘基，只能夠使糖苷鍵脫水。溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶在自然界中比較罕見，只有極少數(shù)相關(guān)報(bào)道，如噬菌體phiKZ的裂解酶gp144[24]；2）內(nèi)β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，可作用于肽聚糖鏈中MurNAc和GlcNAc之間的糖苷鍵；3）酰胺酶，可作用于肽聚糖鏈中MurNAc和L-Ala之間的關(guān)鍵酰胺鍵；4）肽內(nèi)肽酶，可作用于肽聚糖鏈中莖肽和肽間橋氨基酸之間的化學(xué)鍵。

2 噬菌體裂解酶的重組策略

噬菌體裂解酶模塊化結(jié)構(gòu)和獨(dú)立活性為酶的重組進(jìn)化提供了可能，可以此為基礎(chǔ)對天然裂解酶的功能域進(jìn)行刪除衍變和重新組合，并為其與其他抑菌分子的融合重建提供機(jī)會，從而設(shè)計(jì)出具有特殊功能的生物工程裂解酶。噬菌體裂解酶的重組策略能使其具有裂解譜更廣、環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)等新特性，還能實(shí)時地應(yīng)對細(xì)菌耐藥性突變問題。因此，為滿足裂解活性及譜系的需要，可通過多種噬菌體裂解酶功能域的重組，以設(shè)計(jì)活性更高和殺傷范圍更廣或具備靶向性的重組噬菌體裂解酶。為滿足其在不同食品基質(zhì)、不同加工工藝中廣泛的應(yīng)用范圍，可將其與特殊功能片段重組，以設(shè)計(jì)穩(wěn)定性強(qiáng)、溶解性好的重組噬菌體裂解酶。本文進(jìn)一步系統(tǒng)地闡述了嵌合重組、衍生突變、異源融合這3 種噬菌體裂解酶的重組策略（圖2）。

圖2 噬菌體裂解酶的重組方式Fig. 2 Recombination strategies of phage lysins

2.1 嵌合重組

嵌合重組是指通過對預(yù)期細(xì)胞壁CD、CBD進(jìn)行改組而獲得嵌合噬菌體裂解酶的一種重組策略（圖2），具有簡單、易操作等優(yōu)勢，能夠提高噬菌體裂解酶活性、裂解譜系等特性。Idelevich等[25]構(gòu)建了一種新型的嵌合裂解酶PRF-119，對776 株耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）、395 株甲氧西林敏感型金黃色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA）均具有良好的裂解活性。776 株MRSA的半數(shù)抑菌質(zhì)量濃度（50%minimal inhibit concentration，MIC50）和90%抑菌質(zhì)量濃度（90% minimal inhibit concentration，MIC90）平均值均為0.391 g/mL；而398 株 MSSA的MIC50和MIC90平均值分別為0.098 g/mL和0.391 g/mL。研究表明，同類宿主噬菌體裂解酶的嵌合或能擴(kuò)大其裂解譜[26]，而不同類宿主噬菌體裂解酶的嵌合或能改變并拓展其在多種菌屬中的應(yīng)用功效。Fernandes等[27]將糞腸球菌噬菌體裂解酶Lys168和Lys170的CD與葡萄球菌屬噬菌體裂解酶Lys87的CBD進(jìn)行重組，得到Lys168-87和Lys170-87嵌合體，可用于裂解96%以上的受試金黃色葡萄球菌臨床分離株。Dong Qiuhua等[28]將葡萄球菌屬噬菌體裂解酶Ply187的CD與具有腸球菌屬、鏈球菌屬裂解活性的噬菌體裂解酶PlyV12的CBD嵌合，得到Ply187N-V12C，不但具有類似Ply187N的葡萄球菌菌株裂解活性，而且擴(kuò)展到了鏈球菌屬和腸球菌屬，如乳鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿性鏈球菌和糞腸球菌等。此外，噬菌體裂解酶LysK CD的CHAP和酰胺酶可以嵌合成CHAP-酰胺酶[29]，對MRSA252細(xì)胞具有顯著的裂解活性[24]，而單個CHAP與CBD嵌合也能顯著增加其抑菌活性[30]。Mancos等[31]通過將金霉素鏈霉菌噬菌體裂解酶Lyt mu 1/6與T4溶菌酶中可穿透外膜的兩親陽離子肽融合，得到人工噬菌體裂解酶LytAmfi，不僅具有與親本Lyt mu 1/6相似的鏈霉菌裂解活性，而且拓展了其對革蘭氏陰性菌的裂解活性。

重組的噬菌體裂解酶也可用于控制由致病微生物引起的乳腺炎所造成的經(jīng)濟(jì)損失和安全風(fēng)險，Schmelcher等[32]通過將鏈球菌噬菌體裂解酶SA2的內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域分別與溶葡萄球菌酶和葡萄球菌屬噬菌體裂解酶LysK的CBD重組，得到嵌合λSA2-E-Lyso-SH3b和λSA2-E-LysKSH3b，兩種嵌合體均可殺死乳腺炎中具有青霉素抗性的金黃色葡萄球菌。二者聯(lián)合使用時，可以減少乳腺中3.36（lg（CFU/mL））的金黃色葡萄球菌。在加工牛奶中，100 μg/mL的λSA2-E-Lyso-SH3b和λSA2-E-LysK-SH3b可使金黃色葡萄球菌在3 h內(nèi)分別降低3、1（lg（CFU/mL））。Verbree等[33]將溶葡萄球菌素與重組噬菌體裂解酶CHAPK_CWT-LST應(yīng)用于牛奶中金黃色葡萄球菌的殺滅，可在幾分鐘內(nèi)降低到無法檢測的水平，并能夠持續(xù)作用24 h，與對照相比細(xì)菌數(shù)量約降低了9（lg（CFU/mL））。

2.2 衍生突變

研究表明，對噬菌體裂解酶的一些功能域進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)，可以獲得具有抑菌活性的小分子衍生物。例如，對噬菌體裂解酶PlyV12的CBD進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)，可獲得具有預(yù)防和控制MRSA感染的衍生物V12CBD，并能通過核因子κB途徑激活并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)宿主免疫防御能力[9]。而對葡萄球菌屬噬菌體裂解酶Ply187的CD片段進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)，其裂解活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全長的Ply187[28]。Kong等[34]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌噬菌體裂解酶LysPBC2除了具有CD和CBD片段外，還有一個特殊的孢子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（spore binding domain，SBD），由幾個氨基酸殘基組成并部分重疊于CD，單獨(dú)表達(dá)該結(jié)構(gòu)域可靶向作用于蠟樣芽孢桿菌的孢子。

對噬菌體裂解酶的小分子衍生物進(jìn)行凈正電荷數(shù)量改變、疏水性修飾、基因編輯等定向突變，可進(jìn)一步提升衍生物的殺菌效果。噬菌體裂解酶CD衍生物的裂解活性可能與其攜帶凈正電荷數(shù)量相關(guān)，使其能夠通過離子相互作用到達(dá)帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面，并賦予其膜滲透能力。研究發(fā)現(xiàn),增加噬菌體裂解酶LysAm24、LysECD7和LysSi3的C端凈正電荷數(shù)量，可顯著提升其裂解活性[35]。除了增加凈電荷，修飾疏水性氨基酸也可能增強(qiáng)噬菌體裂解酶衍生物的裂解活性。Peng等[36]通過改變氨基酸序列降低噬菌體裂解酶LysAB2衍生肽P3的疏水性，使其具有更強(qiáng)的抑菌活性。而Yan Guangmou等[37]將3～12個疏水氨基酸依次添加到大腸桿菌噬菌體裂解酶Lysep3的C末端，生成了5 種不同疏水性的裂解酶，增強(qiáng)了其體外殺傷大腸桿菌的活性。與以上兩種突變技術(shù)相比，對噬菌體裂解酶衍生物進(jìn)行基因編輯也表現(xiàn)出一定的潛力。Yang Hang等[38]通過編輯噬菌體裂解酶ClyJ的CD和CBD連接肽序列，提高了其溶解性和穩(wěn)定性，并增強(qiáng)了其殺菌活性。Resch等[39]通過在噬菌體裂解酶Cpl-1的C端引入特定半胱氨酸序列構(gòu)建二聚體，增強(qiáng)了其抗菌活性和在環(huán)境中的穩(wěn)定性。

2.3 異源融合

異源融合是指將噬菌體裂解酶（或其部分結(jié)構(gòu)域）與具有外膜穿透性(或局部扭曲脂多糖功能)的外源多肽分子融合，而獲得人工噬菌體裂解酶的一種重組策略。Briers等[40]通過將銅綠假單胞菌噬菌體裂解酶KZ144與一種綿羊來源的螺旋狀抗菌肽SMAP-29融合，獲得人工噬菌體裂解酶Art-085和Art-175，均能更好地透過細(xì)菌外膜，并快速高效清除5（lg（CFU/mL））的多重耐藥銅綠假單胞菌；此外，使用延時顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，Art-175能在1 min內(nèi)刺穿細(xì)菌外膜的肽聚糖層，從而導(dǎo)致內(nèi)膜的膨脹和裂解。

Lukacik等[41]解析了鼠疫耶爾森氏菌外膜轉(zhuǎn)運(yùn)體FyuA的晶體結(jié)構(gòu)，并找到一種靶向這種轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)菌素，即鼠疫菌素。鼠疫菌素具有兩個結(jié)構(gòu)域，一端能與FyuA結(jié)合，另一端與噬菌體T4溶菌酶結(jié)構(gòu)相似。因此，Lukacik等[41]將鼠疫菌素的結(jié)合域與T4溶菌酶N端融合得到重組裂解酶。這種人工噬菌體裂解酶不僅可以殺死特定的耶爾森菌和致病性大腸桿菌，還可以逃避鼠疫菌素免疫蛋白Pim的攻擊。Heselpoth等[42]參考Lukacik[41]、Yan Guangmou[43]等的重組方法，將銅綠假單胞菌的細(xì)菌素S2（PyS2）與噬菌體裂解酶GN4融合，得到人工裂解酶-細(xì)菌素雜交分子PyS2-GN4。這種雜交分子能通過主動運(yùn)輸穿過外膜上的FpvAI蛋白通道，并進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)而接觸到肽聚糖層，導(dǎo)致肽聚糖層破壞、細(xì)胞內(nèi)膜失衡、細(xì)胞質(zhì)滲漏。如圖3所示，F(xiàn)pvAI是外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ExbB、ExbD、TonB1膜蛋白構(gòu)成內(nèi)膜Ton輸入系統(tǒng)，PyS2-GN4的殺菌機(jī)制有以下4 步：1）人工噬菌體裂解酶PyS2-GN4的結(jié)構(gòu)域I能與FpvAI特異性結(jié)合；2）特異性結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象變化并允許FpvAI的一小段無序氨基酸（TonB box，TBB）在周質(zhì)中與TonB1結(jié)合而生成復(fù)合物，導(dǎo)致TBB部分展開并形成通道；3）PyS2-GN4 N端I的非結(jié)構(gòu)化區(qū)域通過新形成的通道，并將其自身TBB與周質(zhì)附近另一個TonB1結(jié)合，隨后誘導(dǎo)其余部分的展開和導(dǎo)入；4）PyS2-GN4在周質(zhì)中重新折疊，并通過水解釋放GN4，作用于肽聚糖層，引起內(nèi)膜失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PyS2-GN4不但能裂解銅綠假單胞菌和多種革蘭氏陰性致病菌，而且還能有效清除生物被膜。

圖3 人工噬菌體裂解酶PyS2-GN4的殺菌機(jī)制[42]Fig. 3 Description of the bactericidal mechanism of PYS2-GN4[42]

Briers等[44]通過將具有模塊化結(jié)構(gòu)的革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶OBPgp279和PVP-SE1gp146與多種不同的異源多肽（陽離子肽、疏水性肽、兩親螺旋肽等）進(jìn)行融合，評價了重組噬菌體裂解酶的活性并探究了異源肽結(jié)合位點(diǎn)的影響。研究表明，這種具有模塊化的噬菌體裂解酶與異源多肽融合后，能夠?qū)ζ淞呀饣钚援a(chǎn)生不同程度的影響。其中，與多陽離子肽融合后，重組的裂解酶可以在30 min內(nèi)使耐藥性銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌數(shù)量降低4～5（lg（CFU/mL））。此外，異源肽在N端與噬菌體裂解酶融合的效果優(yōu)于C端[44]。Gerstmans等[22]提出了一種通用型高通量靶向先導(dǎo)物（H2L）篩選方法，以建立重組噬菌體裂解酶的開發(fā)平臺。通過這種平臺快速構(gòu)建了靶向鮑曼不動桿菌的模塊化重組噬菌體裂解酶（膜滲透肽-連接肽-結(jié)合域-催化域），并得到了近10 000個重組噬菌體裂解酶。

3 噬菌體裂解酶的應(yīng)用研究

2006年，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了一種含有六株噬菌體的雞尾酒制劑ListexTMP100，用于控制即食肉類中單增李斯特菌的污染[45]。美國Intralytix公司的研究表明，EcoShield PXTM噬菌體對大腸桿菌、大腸桿菌O157:H7、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌均有較好的抑制作用[46]。雖然噬菌體能夠作為提高食品安全和減少食源性感染風(fēng)險的有效抗菌劑，但是通過活體添加噬菌體的方式，往往很難讓消費(fèi)者所接受。噬菌體裂解酶避免了噬菌體的一些缺點(diǎn)[13]，因而在食品工業(yè)中具備更廣闊的應(yīng)用前景，可作為具備天然抑菌和防腐功能的食品添加劑，靶向消除或控制食品中致病菌和腐敗菌。此外，生物被膜的形成已成為食品工業(yè)控制致病菌污染的一大障礙。研究表明，噬菌體裂解酶可有效破壞生物被膜結(jié)構(gòu)或殺死被膜基質(zhì)中的細(xì)菌，從而消除預(yù)形成的生物被膜[47]。

3.1 控制革蘭氏陽性菌

食源性革蘭氏陽性致病菌包括金黃色葡萄菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、肉毒桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等，對食品工業(yè)和公共健康造成了極大的安全隱患。噬菌體裂解酶可靶向作用于革蘭氏陽性菌暴露的肽聚糖層，直接從外識別并裂解菌體，從而有效控制食源性革蘭氏陽性菌的污染，表1總結(jié)了近年來革蘭氏陽性菌噬菌體裂解酶的相關(guān)研究進(jìn)展。

表1 天然噬菌體裂解酶控制革蘭氏陽性菌Table 1 Natural lysins control gram-positive pathogens

3.1.1 控制金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌具有多種毒力因子，是導(dǎo)致食源性疾病的主要致病菌之一,可迅速引起惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重的可造成感染者死亡。噬菌體裂解酶為控制食源性金黃色葡萄球菌提供了一種新的選擇。Yu等[61]研究表明，噬菌體裂解酶LysSAP8對MRSA在內(nèi)的葡萄球菌屬具有廣譜裂解活性,并且具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)度，在4～43 ℃、pH 3～9和0～1 000 mmol/L NaCl下均能保持較好的裂解活性。在優(yōu)化條件下，LysSAP8可在30 min內(nèi)使處于指數(shù)生長階段的浮游細(xì)胞降低約3.46（lg（CFU/mL））。噬菌體裂解酶不僅是一種高效的食品抗菌劑，而且可以作為一種實(shí)用的器具消毒劑。研究表明，LysSA11對食品和器具中人工污染的MRSA均有殺菌活性[62]，在冷藏溫度（4 ℃）下，經(jīng)LysSA11處理15 min，可分別降低牛奶和火腿上MRSA的菌量1.44（lg（CFU/mL））和3.12（lg（CFU/cm3）），而在室溫（25 ℃）下處理15 min可分別降低MRSA的菌量2.02（lg（CFU/mL））和3.37（lg（CFU/cm3））；經(jīng)1.35 mmol/L的LysSA11處理30 min后，可完全清除聚丙烯塑料砧板和不銹鋼菜刀上4（lg（CFU/cm2））的MRSA載量。噬菌體裂解酶LysH5不僅能夠?qū)褪蠚⒕讨械慕瘘S色葡萄球菌污染降低到無法檢測水平[63]，還能降解葡萄球菌屬的生物被膜。但LysH5對葡萄球菌屬生物被膜的破壞與生物被膜胞外基質(zhì)無關(guān)，而是直接殺死附著菌株細(xì)胞導(dǎo)致生物被膜的破壞[58]。另外一種噬菌體裂解酶LysCSA13不但在不同pH值及Ca2+、Mn2+條件下對葡萄球菌屬具有較強(qiáng)的抗菌活性，而且可高效去除聚苯乙烯、玻璃和不銹鋼等表面80%～90%的生物被膜[64]。

3.1.2 控制單增李斯特菌

單增李斯特菌在環(huán)境中的持久性和在冷藏條件下的生長能力，給食品制造和加工過程帶來極大風(fēng)險?；谑删w控制單增李斯特菌的研究已在多種食品中廣泛開展,其中，兩種基于噬菌體生物制劑ListShield（ 美國Intralytix公司生產(chǎn)）和ListexTMP100（荷蘭Micreos公司生產(chǎn)）已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于食品生產(chǎn)。純化后的噬菌體裂解酶被認(rèn)為可用于解決單核增生李斯特菌對食品的持續(xù)污染問題[65]，為防控單增李斯特菌食源性風(fēng)險提供了一種新的選擇。van Tassell等[48]比較了噬菌體裂解酶PlyP100在不同環(huán)境下對單增李斯特菌的裂解活性，并將應(yīng)用于多種單增李斯特菌混合污染的新鮮奶酪模型中。研究發(fā)現(xiàn)，在純培養(yǎng)條件下，PlyP100可在30 min內(nèi)使菌株濁度降低70%～80%，而在冷藏新鮮奶酪中，PlyP100對單增李斯特菌有較好的抑制效果，可靶向作用于菌體細(xì)胞壁的肽聚糖層。此外，PlyP100在模擬奶酪冷藏4 周貨架期內(nèi)可持續(xù)性抑制單增李斯特菌的生長。另一項(xiàng)研究表明，噬菌體裂解酶LysZ5處理冷藏溫度下的豆奶3 h，有效裂解人工接種的單增李斯特菌超過4（lg（CFU/mL))[50]。

3.2 控制革蘭氏陰性菌

如表2所示，盡管關(guān)于噬菌體裂解酶的研究大多集中于革蘭氏陽性細(xì)菌的控制，但近年來也有研究將噬菌體裂解酶單獨(dú)使用或與膜滲透劑（如多黏菌素B、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等）聯(lián)用，以克服革蘭氏陰性菌的外膜屏障。

表2 天然噬菌體裂解酶控制革蘭氏陰性菌Table 2 Natural lysins control gram-negative bacteria

噬菌體裂解酶SPN1S具有類溶菌酶超家族結(jié)構(gòu)域，能殺死大部分革蘭氏陰性菌株，并且在不同pH值和溫度范圍內(nèi)（pH 7.0～10.5和25～45 ℃）均保持穩(wěn)定的抗菌活性[73]。當(dāng)與螯合劑EDTA聯(lián)用時，SPN1S通過細(xì)菌外膜的能力和裂解活性顯著增強(qiáng)。另一種噬菌體裂解Ts2631與EDTA聯(lián)用時，可將多重耐藥檸檬酸桿菌在內(nèi)的所有腸桿菌科病原菌降低到檢測限以下（降低6（lg（CFU/mL）））[65]。Liu Aiping等[66]從噬菌體LPST10中鑒定并制備了兩種噬菌體裂解酶LysWL59和LysWL60，對氯仿處理后的革蘭氏陰性菌均具有廣泛的裂解活性。其中，LysWL59表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性，在pH 6.0～10.0和溫度4～90 ℃條件下均保持良好的裂解活性。當(dāng)LysWL59與外膜滲透劑聯(lián)用時，可裂解Tris-HCl緩沖液中鼠傷寒沙門氏菌的活細(xì)胞，2.50 mmol/L的LysWL59與0.50 mmol/L的EDTA聯(lián)用時，在1 h內(nèi)清除了生菜上93.03%的鼠傷寒沙門氏菌。

4 結(jié) 語

在細(xì)菌耐藥性大流行的背景下，噬菌體裂解酶是一種天然來源的功能蛋白，具有相對安全、高效、特異、可清除生物被膜、低耐藥風(fēng)險等諸多優(yōu)點(diǎn)，有助于控制食品中的致病菌與腐敗菌，可作為一種具有極大應(yīng)用前景的食品殺菌保鮮技術(shù)。同時，噬菌體裂解酶不會改變食品質(zhì)地和口感，也不會影響食品中的有益菌群，合理的開發(fā)及應(yīng)用將有益于食品工業(yè)的發(fā)展。但是，天然噬菌體裂解酶的理化性質(zhì)、裂解效果、安全性等均存在一些不確定性，大大限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。人工重組的噬菌體裂解酶能夠克服以上缺陷，根據(jù)噬菌體裂解酶的模塊化結(jié)構(gòu)，基于現(xiàn)代酶工程技術(shù)通過嵌合重組、衍生突變、異源融合等工程方法，對噬菌體裂解酶進(jìn)行定向改造，優(yōu)化其理化性質(zhì)、裂解效果、安全性等特性，以適應(yīng)復(fù)雜多變的實(shí)際食品加工環(huán)境?；谝陨暇C述與分析，本文進(jìn)一步對噬菌體裂解酶在食品工業(yè)中的發(fā)展及應(yīng)用進(jìn)行展望。

4.1 深度挖掘噬菌體裂解酶生物信息資源

噬菌體是地球上最為豐富的生命形式之一，其數(shù)量為細(xì)菌的10 倍，廣泛分布于各種環(huán)境之中。目前，基于高通量測序技術(shù)的基因組學(xué)、宏基因組學(xué)快速發(fā)展，為噬菌體裂解酶生物信息資源的進(jìn)一步深度挖掘提供了可靠的技術(shù)支持。隨著海洋噬菌體資源和基因組信息的不斷挖掘，系統(tǒng)性地研究并構(gòu)建噬菌體裂解酶生物信息資源數(shù)據(jù)庫，將有助于拓展噬菌體裂解酶的應(yīng)用潛力，獲得環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、裂解譜系廣、殺菌功效高的噬菌體裂解酶；而對噬菌體裂解酶生化結(jié)構(gòu)和抗菌特性的相關(guān)性分析，將為噬菌體裂解酶的重組提供更多的理論信息，以更好地服務(wù)于食品中致病與腐敗微生物的有效控制。

4.2 針對不同食物基質(zhì)定向重組噬菌體裂解酶

與純培養(yǎng)物不同，復(fù)雜多變的食物基質(zhì)容易對噬菌體裂解酶的活性造成影響[13-14]。因此，未來對于噬菌體裂解酶的研究，應(yīng)模仿食品實(shí)際加工條件，研究在特定食物基質(zhì)環(huán)境下，鑒定噬菌體裂解酶的功效和特性，以更好地了解其作為有效食品抗菌劑的潛力。噬菌體裂解酶的模塊化特征為其人工重組改造提供了可能，基于不同食物基質(zhì)的特性，明確噬菌體裂解酶定向進(jìn)化的需求，通過嵌合重組、衍生突變、異源融合等策略對其進(jìn)行優(yōu)化以量身定制重組噬菌體裂解酶，以更好地服務(wù)于食品工業(yè)與食品安全。此外，充分了解某些食品基質(zhì)參數(shù)對噬菌體裂解酶功效的影響，也有助于為食品制定噬菌體裂解酶的使用方法，為噬菌體裂解酶的精準(zhǔn)使用和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供支持。

4.3 表達(dá)策略優(yōu)化增加經(jīng)濟(jì)效益

噬菌體裂解酶在食品工業(yè)中實(shí)際應(yīng)用需要規(guī)?；募兓c生產(chǎn)，而目前以發(fā)酵為基礎(chǔ)的生產(chǎn)方法成本過高，對其進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用造成了障礙。因此，采用新型表達(dá)系統(tǒng)，以降低噬菌體裂解酶生產(chǎn)和純化的成本，有助于降低生產(chǎn)成本并推動其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。最近，綠色微藻[75]、植物病毒表達(dá)系統(tǒng)[76]和可食用植物[77]等已被證明能夠用于噬菌體裂解酶的表達(dá)和生產(chǎn)，并能持續(xù)保留良好的抗菌活性。此外，當(dāng)使用植物作為表達(dá)系統(tǒng)時，不需要昂貴的生物反應(yīng)器和培養(yǎng)基，有研究指出植物表達(dá)抗菌蛋白的生產(chǎn)成本為每克3.00～6.88 美元[78]，可為噬菌體裂解酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供一種新策略。

4.4 多工藝結(jié)合深化應(yīng)用前景

噬菌體裂解酶之間的聯(lián)用、與其他抗菌制劑或殺菌技術(shù)之間的協(xié)同作用，可進(jìn)一步提高其對致病菌的殺滅效果?；谑删w裂解酶獨(dú)特的殺菌特性、低耐藥性及高安全性等優(yōu)勢，可聯(lián)合食品添加劑（如香精油、化學(xué)防腐劑等）、細(xì)菌素（如乳酸鏈球菌素）、抗菌肽等，以提升其殺菌保鮮功效。還可利用噬菌體裂解酶作為食品生物涂層材料或者食品包裝材料，以長期控制食品中的致病菌與腐敗菌，有效延長食品的貨架期。特定的噬菌體裂解酶還可與其他消毒工藝（如巴氏消毒等）、殺菌工藝（如高靜水壓力、酸性電解水等）結(jié)合使用，為食品安全提供多重保障。

4.5 建立監(jiān)管框架和使用標(biāo)準(zhǔn)

噬菌體裂解酶具有獨(dú)特的作用位點(diǎn)和高度特異性，難以對真核細(xì)胞和非特異性微生物產(chǎn)生不良影響，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明噬菌體裂解酶是一種安全的酶制劑[9]，目前，基于噬菌體裂解酶SAL200的人體二期臨床實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)開展[10]。噬菌體裂解酶的種類繁多，理化性質(zhì)和穩(wěn)定性都不盡相同，因此，后續(xù)研究需要對噬菌體裂解酶的理化性質(zhì)（如其裂解活性、裂解譜、耐受溫度、耐受pH值、鹽耐受程度、溶解性、穩(wěn)定性等）進(jìn)行系統(tǒng)性評價，以篩選出合適的產(chǎn)品來應(yīng)對不同的應(yīng)用場景。盡管噬菌體裂解酶在食品工業(yè)中具有極大的應(yīng)用前景，但是目前缺乏相關(guān)使用標(biāo)準(zhǔn)和法律框架，這是噬菌體裂解酶規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵障礙，因?yàn)槭删w裂解酶很可能是作為一種食品添加劑或食品消毒劑使用，這需要在允許的工業(yè)和監(jiān)管框架內(nèi)協(xié)調(diào)生產(chǎn)許可和批準(zhǔn)使用。從這個意義上說，一方面，有關(guān)部門應(yīng)積極討論這種新型抗菌劑在食品工業(yè)中的使用范圍，為其合理、安全的使用提供相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和法律依據(jù)；另一方面，高校、研究院等科研機(jī)構(gòu)應(yīng)針對其殺菌效果、作用機(jī)理、毒理學(xué)分析等方面進(jìn)行更深入的研究，并建立系統(tǒng)的理化性質(zhì)、毒理安全、穩(wěn)定性評價方法和體系，為其有效性和安全性提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)，以推動噬菌體裂解酶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和法律依據(jù)的制定。