張善磊，王衛(wèi)軍，呂春華，劉曉飛，賴尚科，崔小平

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷 223800）

小麥赤霉病（fusarium head blight，F(xiàn)HB）是由禾谷鐮刀菌［Fusarium graminearum Schwabe.，有性態(tài)Gibberella zeae（Schwein.）Petch］等多種鐮刀菌引起的小麥真菌性病害，給世界小麥生產(chǎn)和糧食安全造成嚴重威脅[1-3]。此外，隨著小麥籽粒灌漿成熟，赤霉病菌產(chǎn)生脫氧雪腐鐮孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON），雪腐鐮孢菌烯醇（nivalenol，NIV），玉米赤霉烯酮（zearalenol，ZEN）等多種毒素，導致病粒帶毒，為害人畜健康[1]。

江蘇淮北地處黃淮地區(qū)，主要種植半冬性小麥，常年種植面積1.3×106hm2左右，占糧食作物的40%，是全省小麥的主產(chǎn)區(qū)和高產(chǎn)區(qū)，對保障江蘇省糧食安全舉足輕重[4]。近年來，該區(qū)域連年出現(xiàn)局部地區(qū)赤霉病重發(fā)、流行的現(xiàn)象，2010年、2012年和2015年發(fā)生尤為嚴重[5-7]。據(jù)統(tǒng)計，上述3年的發(fā)病面積均占種植面積的1/3 以上，對小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)構成嚴重威脅。隨著小麥基因組學研究的深入和分子標記技術的發(fā)展，迄今至少有100 個抗赤霉病位點被報道，抗病基因Fhb1 和Fhb7 已被成功克隆并開發(fā)出診斷性分子標記，為利用分子標記輔助選擇育種技術、快速培育抗性品種防治病害的發(fā)生流行提供了可能[8-11]。

Fhb1 是位于小麥3B 染色體短臂上的一個赤霉病主效抗病基因，抗性強且穩(wěn)定。徐婷婷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb1 抗病基因及其基因組合的品種（系）具有較低的病情指數(shù)；張宏軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb1 基因家系的平均病情指數(shù)較不含有Fhb1 基因家系低4.0；蔣正寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb1 抗病等位基因的品種（系），病小穗數(shù)顯著低于感病等位基因品種，證明該基因與赤霉病抗性相關，具有重要育種價值。Fhb7 是來源于小麥近緣植物長穗偃麥草的一個抗病基因。KIM 等[15]對小麥-長穗偃麥草的7el2-7D 代換系進行鑒定，發(fā)現(xiàn)該基因高抗赤霉??；GUO 等[16]和ZHANG 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb7 抗病基因材料的平均病小穗數(shù)較感病材料低，可解釋赤霉病抗性表型的30.46%；WANG 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的小麥品種中導入Fhb7 基因能同時提高對赤霉病和莖基腐病的抗性水平，具有廣譜解毒功能，且不影響產(chǎn)量。如果它們在半冬性小麥抗赤霉病育種中加以利用，將大大提高抗性品種選育效率。本研究利用赤霉病抗性基因Fhb1 的診斷性標記和Fhb7 的顯性標記，對155 份小麥新品系進行基因型檢測，旨在明確其在江蘇省淮北小麥中的分布情況，為進一步擴大使用這些抗性基因，選育新的抗赤霉病小麥品種提供有益信息。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料包括2017—2020年江蘇省淮北小麥預備試驗新品系155 份，2017—2018年度61 份、2018—2019年48 份、2019—2020年度46 份。攜帶赤霉病抗性基因Fhb1 的蘇麥3 號由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所提供，望水白由江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護和利用平臺提供。所有供試材料種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所泗陽試驗基地，常規(guī)栽培方式管理。

1.2 小麥基因組DNA 提取和引物合成

小麥分蘗盛期采集不同材料的新鮮葉片，采用CTAB 法提取基因組DNA[18]，使用核酸分析儀檢測DNA 提取質(zhì)量。利用朱展望等[10]設計的小麥赤霉病主效抗性基因Fhb1 的診斷性分子標記His3B-4 和WANG 等[11]設計的小麥赤霉病主效抗性基因Fhb7的顯性分子標記，對155 份江蘇省淮北小麥新品系進行基因型檢測，引物序列和目標擴增片段大小見表1。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于赤霉病抗性基因檢測的引物

1.3 PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳

20 μL 的PCR 反應總體系包含：ddH2O 14.4 μL，模板DNA（10 ng/μL）2.0 μL，10×Buffer（25.0 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.4 μL，正反向引物（10.0 μmol/L）各0.4 μL，Taq DNA 聚合酶（2.0 U/μL）0.4 μL。PCR 擴增反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58～65 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，DuRed 核酸燃料染色后，在紫外凝膠成像儀上觀察記載。

2 結果與分析

2.1 抗性基因Fhb1 和Fhb7 的分子檢測

利用小麥赤霉病抗性基因Fhb1 和Fhb7 的分子標記，對155 份江蘇淮北小麥新品系進行基因型檢測，F(xiàn)hb1 基因標記在含有抗病等位基因的材料中能擴增出1 309 bp 左右的預期條帶，此外其他帶型為fhb1 感病等位基因型（圖1a、表2）；Fhb7 基因標記為顯性標記，該標記在含有抗病等位基因的材料中能擴增出892 bp 的預期條帶，而在不含有該基因的材料中無此帶型，記為fhb7 感病等位基因型（圖1b、表2）。

表2 Fhb1 和Fhb7 基因在155 份江蘇淮北小麥新品系中的分布

圖1 部分小麥新品系中Fhb1 和Fhb7 基因檢測結果

2.2 Fhb1 和Fhb7 基因在155 份江蘇淮北小麥新品系中的分布

根據(jù)檢測結果，155 份小麥新品系中，有4 份含有抗病基因Fhb1，所占比例為2.6%；其余151 份為感病等位基因fhb1，所占比例為97.4%。檢測到1 份材料含有抗病基因Fhb7，所占比例為0.6%；154 份含有感病等位基因fhb7，所占比例為99.4%。從基因組合分布來看，fhb1/fhb7 的分布頻率最高，為97.4%；含F(xiàn)hb1/fhb7 基因組合的品系次之，有3 份，所占比例為1.9%；分布頻率最低的組合為fhb1/Fhb7，同時含有2 個抗性基因的Fhb1/Fhb7 基因型品系只有1 份，所占比例為0.7%（表3）。這表明Fhb1 和Fhb7 抗性基因在現(xiàn)有淮北小麥新品系中的分布較少，可進一步擴大這2 個抗性基因的使用，提高育成品種的赤霉病抗性水平。

表3 小麥新品系中抗性基因Fhb1 和Fhb7 不同基因型的分布

2.3 單基因及不同基因組合在不同年度淮北小麥新品系中的分布

根據(jù)上述檢測結果，對供試小麥新品系進行3 個年度劃分，分別統(tǒng)計抗性基因及其基因組合的年度間分布特點。2017—2018年，61 份小麥新品系中未檢測到含有Fhb1 或Fhb7 抗病等位基因的材料，在基因型分布上以fhb1/fhb7 感病等位基因組合形式存在。2018—2019年，48 份小麥新品系中檢測到含有Fhb1 和Fhb7 抗病基因的材料分別為2 份和1 份，所占比例分別為4.2%和2.1%；同時含有2 個抗病基因的材料有1 份，所占比例為2.1%。2019—2020年度，46 份小麥新品系中檢測到含有Fhb1 抗病等位基因的材料有2 份，所占比例為4.3%；未檢測到含有Fhb7 抗病等位基因的材料；在基因組合中含fhb1/fhb7 的品系數(shù)較多，所占比例為95.7%，而其他3 種有利基因組合的年度間變幅并不明顯（表4）。

表4 不同年份小麥新品系中Fhb1 和Fhb7 基因分布

表2（續(xù)）

3 討論與結論

小麥赤霉病是極具毀滅性且防治困難的真菌性病害，是農(nóng)業(yè)領域的世界性難題，嚴重威脅我國小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展[19]。長期的生產(chǎn)實踐證明，小麥抗赤霉病品種的選育和利用是防治該病流行危害的經(jīng)濟有效措施。然而，傳統(tǒng)小麥抗赤霉病育種是在充分發(fā)病的前提下，依據(jù)植株病害發(fā)生程度進行選擇，不僅耗時費力而且易受環(huán)境影響，準確性差。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展和基因組學研究的深入，我國科學家在小麥抗赤霉病基因克隆和功能分析等方面取得了重大進展。Fhb1 是最早發(fā)現(xiàn)于我國小麥品種蘇麥3號中的一個持久、穩(wěn)定抗性基因，是目前公認的赤霉病抗性效應最大的位點。LI 等[9]和SU 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一個富含組氨酸的鈣離子結合蛋白（histidine-rich calcium-binding protrin，His），是我國特有的優(yōu)異小麥基因資源。Fhb7 源于長穗偃麥草7E 染色體長臂末端，是通過遠緣雜交轉移至栽培小麥中的一個高效抗赤霉病基因[16]。WANG 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一種谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST），能夠打開嘔吐毒素的環(huán)氧基因，并催化形成谷胱甘肽加合物，從而產(chǎn)生解毒效應。不僅如此，F(xiàn)hb1 和Fhb7 基因即使在不同遺傳背景條件下，也能有效提升小麥對赤霉病的抗性水平，具有廣譜抗性。

為提高Fhb1 和Fhb7 基因的選擇效率，已有研究人員設計出不同類型的分子標記篩選其抗病基因型，并鑒定出一批攜帶目標基因的優(yōu)異材料，減少了小麥抗赤霉病育種的盲目性。本研究利用Fhb1 和Fhb7 的基因標記，對155 份小麥新品系進行基因型檢測，明確這些抗性基因及基因組合在江蘇省淮北地區(qū)的利用及分布狀況。155 份小麥新品系中fhb7基因的出現(xiàn)頻率最高，為99.4%，且基因型分布中多以fhb1/fhb7 感病基因組合存在，而攜帶Fhb1 和Fhb7 抗病等位基因的材料所占比例分別為2.6%和0.7%，明顯低于其感病等位基因的分布頻率。進一步對2017—2018年、2018—2019年和2019—2020年Fhb1、Fhb 7 基因分布狀況進行分析，發(fā)現(xiàn)與2017—2018年比較，近年這兩個抗病基因的出現(xiàn)頻率明顯提高，說明通過遺傳育種改良突破了該抗病基因向半冬性小麥轉移的品種生態(tài)類型限制，為提升江蘇省淮北小麥的赤霉病抗性奠定了基礎。

受氣候變暖以及秸稈還田等耕作制度的改變影響，江蘇淮北的赤霉病害呈蔓延趨勢，2010年小麥赤霉病在蘇北沿海地區(qū)重發(fā)，為2004年以來發(fā)生最為嚴重的一年，至2020年11年中就有2010、2012年2年大流行，2014、2015、2016、2018年4年局部地區(qū)偏重發(fā)生[21-25]。王震等[26]對江蘇省北部14 個主栽小麥品種的赤霉病抗性進行鑒定，結果在單花滴注條件下僅有2 個達到中感水平；常蕾等[27]對97 份小麥高代品系進行赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)56 份淮北品系中，僅有5 份達到中感及以上水平。本研究中155 份小麥新品系僅檢測到4 份含有Fhb1 抗性基因的材料，1 份含有Fhb7 抗性基因的材料，可見該區(qū)域小麥抗赤霉病育種形勢仍然嚴峻，要充分利用好現(xiàn)有抗病基因，不斷挖掘新的優(yōu)異基因和抗源材料，通過常規(guī)育種手段結合分子標記輔助育種技術，實現(xiàn)目標基因的直接選擇和高效聚合，從而快速、有效提升育成品種的赤霉病抗性水平，促進淮北小麥的生產(chǎn)發(fā)展，保障江蘇省糧食安全。