PCR快速檢測種子攜帶綠豆暈疫病菌方法的應(yīng)用

田曉燕，賀小勇，孔慶全，趙存虎，陳文晉，李志棟，賈轉(zhuǎn)青

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.呼和浩特市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.呼和浩特市玉泉區(qū)教育教學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

綠豆主產(chǎn)區(qū)在亞洲，全球有20 多個國家種植[1-3]。綠豆在我國已有2 000 多年的栽培歷史，年種植面積在1 200 萬hm2左右，總產(chǎn)量約100 萬t，是世界上最大的出口國[4]。近年來，隨著產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的病蟲害，特別是綠豆暈疫病[5-6]，在全國主產(chǎn)區(qū)迅速傳播和蔓延，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，成為我國綠豆生產(chǎn)的主要威脅。暈疫病主要為害葉片，也侵染豆莢和種子[7-8]。帶病種子長出的幼莖呈環(huán)狀腐爛，表現(xiàn)為萎蔫并導(dǎo)致幼苗死亡[6]。該病菌主要通過種子傳播，種子可以攜帶大量病原菌，從一個生長季傳播到下一個生長季，從一個地方擴(kuò)展到另一個地方。據(jù)TAYLOR 等[9]報道，感暈疫病癥狀輕微或無癥帶病的種子傳播率分別為35%和52%。防止綠豆暈疫病流行唯一實用和有效的方法是使用無病健康種子[10]。目前，綠豆暈疫病田間快速診斷技術(shù)尤其是種子帶菌的檢測技術(shù)報道較少，傳統(tǒng)的檢測手段存在鑒定時間長、技術(shù)復(fù)雜、漏檢率高等缺點(diǎn)，給該病害的早期防治帶來困難。鑒于近年來綠豆暈疫病在我國的發(fā)生逐年加重，無有效的化學(xué)藥劑和抗病品種防治，本研究為了增加實驗室檢測的準(zhǔn)確度，探索建立一套簡便實用、快速檢測綠豆種子攜帶病原菌的技術(shù)——PCR 快速檢測方法，以期為測定種子的健康狀況提供信息，為種子生產(chǎn)、調(diào)運(yùn)過程中病害傳播的防治提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 已分離鑒定的綠豆暈疫病病原菌（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola），保存于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.1.2 供試綠豆種子 易感品種“冀綠7 號”種子。

1.1.3 綠豆暈疫病菌特異性引物篩選與合成 經(jīng)過前期大量的引物篩查試驗，共篩選出對檢測綠豆暈疫病菌靈敏度較高的7 對引物，分別是P1/P2[11]、HB14F/HB14R[12]、62a/63a[13]、P3.1/P5.1[14]、P3004L/P3004R[15]、B4-1-F/B4-1-R 和B4-2-F/B4-2-R（根據(jù)分離鑒定綠豆暈疫病病原菌的基因序列，交由大連寶生物工程有限公司設(shè)計并合成）。所有引物PCR 反應(yīng)體系采用20 μL 體系：1 μL 模板（50 ng DNA 或者1 μL 菌懸液，2.5 μL 10×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTP，1.5 U Taq 酶，引物各0.1 μL），所有引物序列由大連寶生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物及其序列

1.2 試驗方法

1.2.1 特異性引物靈敏度的檢測 用無菌水配制濃度依次為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100CFU/mL 9 個濃度梯度的綠豆暈疫病菌菌懸液，并以其作為PCR 反應(yīng)的模板，檢測特異性引物的靈敏度，選擇靈敏度較高、專一性較好、穩(wěn)定性較強(qiáng)的引物進(jìn)行下一步試驗。

1.2.2 模擬種子表面帶菌檢測 取表面健康無病的“冀綠7 號”種子若干，放入三角瓶，蓋上棉塞高壓滅菌，然后用無菌水反復(fù)沖洗，盡可能地把種子表面殘留的灰塵等雜質(zhì)沖洗下來。再用1×108CFU/mL 的菌懸液50 mL 浸泡50 粒處理好的種子2 h，在無菌條件下，把種子晾干。將人工模擬帶菌的種子用50 mL無菌水浸泡，28 ℃搖動30 min，取種子浸泡液并將其依次稀釋為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100CFU/mL 濃度的菌懸液，用這9 個濃度的菌懸液作PCR 模板，檢測模擬狀態(tài)下特異性引物的靈敏度。

1.2.3 種子帶菌率檢測 分別將100、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625 粒帶病菌的“冀綠7 號”種子（用1×108CFU/mL 暈疫病菌菌懸液浸泡處理過）加入健康綠豆種子，使每份總量達(dá)到1 000 粒，得到10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%帶菌率樣品。每份帶菌樣品用500 mL 無菌水浸泡，于28 ℃振蕩洗滌，每隔1 h 取洗滌液1 μL 作為模板直接進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以暈疫病菌菌懸液為陽性對照，其他菌作陰性對照，每個處理3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物靈敏度檢測結(jié)果

分別以9 個濃度梯度的綠豆暈疫病菌菌懸液作為PCR 模板，對篩選出的7 對特異性引物進(jìn)行靈敏度檢測。檢測結(jié)果顯示，引物B4-1-F/B4-1-R和B4-2-F/B4-2-R 檢測的最小菌懸液濃度都為1×101CFU/mL，引物HB14F/HB14R 檢測的最小菌懸液濃度為1×103CFU/mL，引物P3.1/P5.1 檢測的最小菌懸液濃度為1×105CFU/mL，其余3 對引物檢測的最小菌懸液濃度均在1×106CFU/mL 以上，靈敏度不高、效果較差、信號較弱，由此確定用以上4 對靈敏度較高、信號較強(qiáng)的引物繼續(xù)進(jìn)行模擬種子帶菌檢測試驗，具體PCR 檢測結(jié)果見圖1。

圖1 靈敏度高的引物菌懸液濃度梯度PCR 檢測結(jié)果

2.2 模擬種子表面帶菌PCR 檢測結(jié)果

模擬種子表面帶菌檢測，用種子浸泡液作為PCR 的模板，檢測結(jié)果顯示，引物B4-1-F/B4-1-R和B4-2-F/B4-2-R 檢測的最小菌懸液濃度均為1×104CFU/mL，引物HB14F/HB14R 檢測的最小菌懸液濃度為1×106CFU/mL，引物P3.1/P5.1 在模擬種子帶菌檢測中靈敏度較差、效果不好、信號較弱。由此試驗結(jié)果確定引物B4-1-F/B4-1-R、B4-2-F/B4-2-R 和HB14F/HB14R 繼續(xù)進(jìn)行種子帶菌率檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 模擬種子表面帶菌PCR 檢測結(jié)果

2.3 種子帶菌率檢測結(jié)果

據(jù)以上試驗結(jié)果總體分析，最終用篩選出的靈敏度高、信號強(qiáng)的3 對引物做種子帶菌檢測，其中，引物B4-1-F/B4-1-R 和B4-2-F/B4-2-R 檢測的靈敏度為振蕩洗滌1 h 即可檢出全部帶菌樣品；引物HB14F/HB14R 檢測的靈敏度為振蕩洗滌1 h 可檢出帶菌率為10%、5%和2%的樣品，振蕩洗滌4 h 后帶菌率0.125%的樣品出現(xiàn)條帶，并且可檢出的種子最終帶菌率為0.125%。篩選出的這3 對特異性引物靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，即可應(yīng)用于綠豆種子表面帶菌快速檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 種子帶菌率PCR 檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

綠豆暈疫病是一種細(xì)菌性病害，該病在我國綠豆各大主產(chǎn)區(qū)的危害日益加重。目前，生產(chǎn)上尚無有效的防治方法。種子帶菌在病害傳播過程中充當(dāng)重要傳播媒介，綠豆暈疫病最重要的初侵染來源就是種子帶菌，種子帶菌的快速檢測是防止該病害流行蔓延的重要環(huán)節(jié)。種子帶菌檢測的目的是測定種子樣品的健康狀況，檢測種子是否攜帶特定病原菌，為種子質(zhì)量提供信息。種子帶菌檢測不但要求準(zhǔn)確，而且要求快速、便捷，這樣才能為種子健康檢驗行業(yè)服務(wù)。

目前對該病原菌的分子檢測報道較多，但大多是針對純菌株的研究，未見有針對種子樣品檢測的報道。因此，加快對綠豆暈疫病菌的快速檢測技術(shù)研究，已成為當(dāng)前越來越迫切需要解決的問題。國內(nèi)外現(xiàn)行對暈疫病菌的PCR 檢測方法大多是基于菜豆毒素相關(guān)基因序列實現(xiàn)的[16-17]，具有較高的特異性，但幾乎所有的PCR 檢測方法都是針對大豆種子或者是菜豆種子，鑒于近年來綠豆暈疫病在我國發(fā)生危害較重，本研究通過對綠豆暈疫病菌不同濃度菌懸液進(jìn)行一系列的PCR 反應(yīng)，系統(tǒng)比較不同引物對不同濃度菌懸液的靈敏度，篩選出3 對引物的靈敏度較高、專一性較強(qiáng)、穩(wěn)定性較好。引物B4-1-F/B4-1-R和B4-2-F/B4-2-R 檢測的最小菌懸液濃度均為1×104CFU/mL，且振蕩洗滌1 h 即可檢出帶菌率為0.062 5%的種子樣品；引物HB14F/HB14R 檢測的最小菌懸液濃度為1×106CFU/mL，且振蕩洗滌4 h 后可檢出帶菌率為0.125%的種子樣品。經(jīng)驗證，這3 對引物均可以用于種子帶綠豆暈疫病菌檢測，PCR 檢測技術(shù)既節(jié)省了分離病原菌消耗的大量時間，結(jié)果又快速準(zhǔn)確，靈敏度較高，對于綠豆種子帶菌檢測是十分方便快捷的。

綠豆暈疫病菌已構(gòu)建的傳統(tǒng)檢測方法主要有分離培養(yǎng)法[18]、試種法[19]和生理生化法[20]，但靈敏度較低，特異性不高，檢測周期較長。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，多種方法可用于檢測病原菌，主要包括酶聯(lián)免疫法、傳統(tǒng)PCR 法、BIO-PCR 法[21-23]等，但容易受抑制因子影響造成假陰性等問題，對結(jié)果判斷產(chǎn)生困擾。以上檢測方法主要靠分離培養(yǎng)病原菌，通過生理生化、致病性測試等試驗進(jìn)行鑒定。與之相比PCR 快速檢測方法方便快捷許多，直接用種子浸泡液作PCR 反應(yīng)的模板，3 對特異性引物PCR 檢測時間較短、特異性強(qiáng)、靈敏度高。此方法能進(jìn)一步增加檢測綠豆暈疫病菌的專一性，為生產(chǎn)中種子攜帶極少量綠豆暈疫病病菌即可侵染流行發(fā)病提供更好的解決辦法，提高了檢測方法在生產(chǎn)應(yīng)用中的可行性，可為綠豆暈疫病菌的檢測工作提供技術(shù)支持。