張達娟，張樹林，戴偉，畢相東，許瑩芳，衛(wèi)玲玲

磷缺乏后補充對銅綠微囊藻生長及葉綠素熒光參數(shù)的影響

張達娟，張樹林通信作者，戴偉，畢相東，許瑩芳，衛(wèi)玲玲

（天津農學院 水產學院 天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

磷是組成藻細胞的生命元素之一，對藻類生長具有重要作用，亦是水華藍藻暴發(fā)的重要限制因子。本研究在實驗室條件下模擬磷缺乏后再補充對銅綠微囊藻生長和葉綠素熒光參數(shù)的影響。結果表明，7 d后，磷缺乏處理組銅綠微囊藻細胞密度比對照組低0.58×107cell/mL，二者之間有顯著差異（＜0.05），處理組顯著低于對照組；磷補充后，銅綠微囊藻生長迅速，培養(yǎng)結束時處理組和對照組細胞密度基本相等，、和顯著高于對照組。該研究結果可為防控銅綠微囊藻水華暴發(fā)提供參考。

銅綠微囊藻；磷缺乏；磷補充；葉綠素熒光參數(shù)

磷是組成藻細胞核酸、磷脂、ATP等的基本元素，對微藻的生長代謝具有重要作用。在自然水體中溶解性磷含量較高，占總磷的90%以上，藻細胞可直接吸收溶解性磷合成磷化合物，參與細胞的光合作用及蛋白、碳水化合物和脂類化合物的合成及交換，在藻細胞代謝過程中起著十分重要的作用[1-4]。有研究發(fā)現(xiàn)在低磷條件下，小分子有機磷與微量元素的共同作用激發(fā)銅綠微囊藻（）迅速生長并產生毒素[5]。在磷缺乏的情況下銅綠微囊藻仍保持較高的生長速率，主要是由于其儲磷的能力和對有機磷鹽較強的利用能力[6]，銅綠微囊藻細胞在有機磷條件下產生的堿性磷酸酶主要受磷濃度調控，與磷的形態(tài)無關[7]；也有研究表明，溶解態(tài)無機磷和溶解態(tài)小分子有機磷會影響堿性磷酸酶活性[8]，堿性磷酸酶活性加強會加快大分子有機磷降解成小分子有機磷，從而讓藻細胞更易吸收和存儲小分子有機磷[9]，相對其他藻類更有競爭優(yōu)勢。

磷在限制淡水生態(tài)系統(tǒng)初級生產力水平方面是主導因素[2]，引起水體富營養(yǎng)化問題的關鍵因素之一是磷的過量輸入，因此，減少外源磷輸入和加強內源磷消耗是治理水體富營養(yǎng)化、改善水質和降低藍藻暴發(fā)的常見手段[3-4]。磷濃度增加通常會導致水體中浮游植物群落組成向可形成水華的藍藻演替，且當水體中總氮/總磷比小于29時，水華藍藻會占優(yōu)勢，為水華的暴發(fā)提供條件[10]。然而在自然水體中，因廢水排放、降雨及底泥營養(yǎng)物質釋放等，氮、磷營養(yǎng)鹽在水體中的含量時刻在發(fā)生變化。本研究以銅綠微囊藻905藻株為研究對象，在實驗室條件下模擬磷缺乏后再補充對其生長和葉綠素熒光參數(shù)的影響，以期為預防微囊藻水華暴發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

銅綠微囊藻（905）購自中國科學院武漢水生生物研究所。使用BG-11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，條件如下：光照強度40 μmol/（m2·s）、（27±1）℃，光暗比12 h∶12 h。

1.2 試驗設計

本試驗設1個對照組和1個處理組，每組3個平行，對照組采用正常的BG11培養(yǎng)基，處理組采用無磷的BG11培養(yǎng)基，分別處理7 d，接種密度均為2×107cell/mL，培養(yǎng)條件與藻種培養(yǎng)條件相同。經7 d 處理后，將對照組和試驗組中藻液離心，取藻泥，均接種至正常BG-11培養(yǎng)基中，在磷補充后的第0、12、24、48、72、96、120、144小時取樣測定細胞密度和葉綠素熒光參數(shù)。

1.2.1 細胞密度測定

在光學顯微鏡下使用血球計數(shù)板計數(shù)銅綠微囊藻細胞個數(shù)，計算藻細胞密度。

1.2.2 葉綠素熒光參數(shù)測定

利用浮游植物分類熒光儀（PHYTO－PAMWALZ）對葉綠素熒光參數(shù)進行測定，測定方法參見張媛媛等[11]。檢測所得葉綠素熒光基礎參數(shù)（、、、）和最大電子傳遞速率（ETR）、通過計算得到最大光能轉化效率（）、實際光能轉化效率（）和有效光能轉化效率（）。

計算公式：

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結果均用平均值±標準差的形式表示，在統(tǒng)計軟件SPSS 18.0中利用獨立樣本T檢驗進行統(tǒng)計分析，當＜0.05即為差異顯著，＜0.01為差異極顯著；＞0.05差異不顯著。采用Excel 2017進行數(shù)據(jù)整理和制圖。

2 結果與分析

2.1 磷缺乏后補充對銅綠微囊藻細胞密度的影響

磷缺乏后補充對銅綠微囊藻細胞密度的影響見圖1，經7 d處理后，對照組和處理組細胞密度分別為3.12×107cell/mL和2.54×107cell/mL，二者之間有顯著差異（＜0.01），由此可見磷缺乏對微囊藻生長具有顯著抑制作用。磷恢復后，處理組細胞迅速恢復生長，至72 h時，處理組和對照組基本持平，分別為3.66×107cell/mL和3.64×107cell/mL，至培養(yǎng)結束，二者之間沒有顯著差異（＞0.05）。

2.2 磷缺乏后補充銅綠微囊藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

磷缺乏7 d 后，對照組銅綠微囊藻（0.36）比處理組（0.22）高0.14，二者之間有顯著差異（＜0.05）。從磷恢復后的第12小時開始處理組開始顯著升高，直至試驗結束，一直顯著高于對照組（＜0.05）（圖2）。

銅綠微囊藻變化如圖3所示，在磷缺乏7 d后，對照組微囊藻細胞顯著高于處理組（＜0.05），隨后處理組明顯升高，至培養(yǎng)結束，顯著高于對照組（＜0.01）。

經7天磷缺乏處理后，對照組比處理組高0.02（圖4），但二者之間沒有顯著性差異 （＞0.05），隨后處理組中微囊藻逐漸上升，至培養(yǎng)結束時比對照組高0.02，仍不具有顯著差異（＞0.05）。

經7d磷缺乏處理并未對銅綠微囊藻的ETR產生顯著影響（＞0.05），至磷恢復后第72小時，對照組與處理組銅綠微囊藻ETR分別為27.67和29.33，開始出現(xiàn)顯著性差異（＜0.05）；至培養(yǎng)結束，對照組與處理組的ETR分別為28.00和29.67，處理組比對照組高1.67，二者之間仍有顯著性差異（＜0.05）（圖5）。

3 討論

葉綠素熒光與光合作用的各反應過程緊密相關，可以反映出植物的光合生理狀態(tài)，以此反應環(huán)境因子與植物光合作用的內在聯(lián)系[12]。當微藻受到環(huán)境脅迫時，光合作用過程受到影響，光合效率降低，藻細胞吸收的過剩光能通過熱量及熒光的形式散發(fā)出去[13]。葉綠素熒光技術在光合作用基礎上，以植物葉綠素為探針，反映植物體內光合生理狀態(tài)，為測定和觀察脅迫環(huán)境中藻類光合生理狀態(tài)提供可能[14]。研究表明，在生物脅迫檢測中、等指標具有較好的靈敏反 應[15]，可以深入了解環(huán)境脅迫對微藻光合效率，主要是PSII的影響。

本研究中，磷缺乏脅迫銅綠微囊藻7 d后，藻細胞密度、和都顯著低于對照組，處理組比對照組低0.14，銅綠微囊藻光合作用速率受到磷缺乏顯著影響。研究表明，小球藻（sp.）、微小亞歷山大藻（）受磷限制時，藻密度、葉綠素a含量和迅速降低[16-17]，培養(yǎng)9 d后，微小亞歷山大藻的降低了37.31%，與本研究結果基本一致。營養(yǎng)鹽缺乏對藻類脅迫與作用時間有著密切關系，筒柱藻（sp.）葉綠素熒光參數(shù)、細胞密度、干質量、總質量及脂肪酸組成均隨著氮、磷缺乏時間延長而顯著降低[18]。藻細胞降低表明磷缺乏可能引起銅綠微囊藻PSII反應中心受損，阻礙光合電子傳遞過程，抑制光合作用的原初反應。降低說明磷缺乏阻止了藻細胞同化力形成，進而影響對碳固定與同化。

磷缺乏后補充可以顯著提高銅綠微囊藻的光合作用速率，尤其以和響應最為迅速，自磷補充第12小時開始，處理組顯著高于對照組，在磷補充后期開始顯著升高。張達娟等研究表明，當?shù)厝狈笱a充，最先做出響應的熒光參數(shù)指標也是和[19]，由此可見，和是對營養(yǎng)鹽缺乏和補充較敏感的指標。磷饑餓后補充使海洋小球藻（sp.）迅速上升，對磷“過度”吸收造成其有效電子產量大幅度升高[20]；使銅綠微囊藻大量吸收磷并儲存，待接近飽和時，光合作用加強，迅速生長[21]。研究表明，銅綠微囊藻可在聚合磷酸合成酶的作用下將ATP轉化為聚合磷PolyP，作為儲存磷[18]，當外源磷濃度不足時，會上調磷吸收相關基因和堿性磷酸酶編碼基因的表達，通過提高磷吸收速率和水解利用有機磷兩種途徑適應低磷環(huán)境[22]，這可能是銅綠微囊藻能在天然水體中迅速占優(yōu)勢的主要原因。

本研究表明磷缺乏可以顯著抑制銅綠微囊藻的細胞密度及光合作用速率；磷補充后，銅綠微囊藻細胞密度及光合作用速率均有所升高，和等葉綠素熒光參數(shù)對磷營養(yǎng)鹽缺乏后再補充具有良好的響應作用。

[1] 易文利. 不同營養(yǎng)鹽對銅綠微囊 藻生長的室內模擬研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2005.

[2] 王舉. 磷與微量元素共同作用對銅綠微囊藻生長與產毒的影響研究[D]. 西安：西安建筑科技大學，2018.

[3] 許海，陳丹，陳潔，等. 氮磷形態(tài)與濃度對銅綠微囊藻和斜生柵藻生長的影響[J]. 中國環(huán)境科學，2019，39（6）：2560-2567.

[4] HARKE M J，BERRY D L，AMMERMAN J W，et al. Molecular Response of the Bloom-Forming Cyanobacterium，，to Phosphorus Limitation[J]. Microbial Ecology，2012，63（1）：188-198.

[5] 黃邦欽，黃世玉，翁妍，等. 溶解態(tài)磷在海洋微藻堿性磷酸酶活力變化中的調控作用[J]. 海洋學報，1999，21（1）：55-60.

[6] LI J，WANG Z， CAO X，et al. Effect of orthophosphate and bioavailability of dissolved organic phosphorous compoundsto typically harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Marine Pollution Bulletin，2015，92（1-2）：52-58.

[7] HECKY R E，KILHAM P. Nutrient limitation of phytoplankton in fresh water and marine environments：A review of recent evidence on the effects of Enrichment[J]. Limnology and Oceanography，1988，33（4）：796-822.

[8] SZYMA?SKI D，ZIELI?SKA M，DUNALSKA J A. Microfiltration and ultrafiltration for treatment of lake water during algal blooms[J]. Ecohydrology and Hydrobiology，2019，3（19）：351-358.

[9] 張?zhí)m婷. 富營養(yǎng)化藍藻水華發(fā)生的主要成因與機制研究綜述[J]. 水利發(fā)展研究，2019，19（5）：28-33.

[10] 孔繁翔，曹煥生，譚嘯. 水華藍藻復蘇的研究進展與水華預測[J]. 環(huán)境監(jiān)控與預警，2010，2（1）：1-4.

[11] 張媛媛，戴偉，張樹林，等. 光照歷史對小檗堿化感抑藻效應的影響[J]. 水生態(tài)學雜志，2015，36（1）：88-93.

[12] 岑海燕，姚潔妮，翁海勇，等. 葉綠素熒光技術在植物表型分析的研究進展[J]. 光譜學與光譜分析，2018，38（12）：3773-3779.

[13] 梁英，金月梅，田傳遠. 磷限制及恢復對小球藻葉綠素熒光特性的影響[J]. 南方水產，2008，4（4）：1-7.

[14] 胡豐姣，黃鑫浩，朱凡，等. 葉綠素熒光動力學技術在脅迫環(huán)境下的研究進展[J]. 廣西林業(yè)科學，2017，46（1）：102-106.

[15] 陳蓮花，劉雷. 葉綠素熒光技術在藻類光合作用中的應用[J]. 江西科學，2007，25（6）：788-790，806.

[16] 許可. 不同氮磷濃度對普通小球藻生長及光合作用的影響研究[D]. 西安：西安建筑科技大學，2018.

[17] LIPPEMEIER S，F(xiàn)RAMPTON D M F，BLACKBURN S I，et al. Influence of phosphorus limition on toxicity and photosynthesisi of（Dinophyceae） monitored by in-line detection of variable chlorophyll fluoeesence[J]. Journal of Phycology，2003，39（2）：320-331.

[18] 梁英，孟祥榮，孫明輝，等. 氮磷饑餓時間對筒柱藻生長及總脂含量的影響[J]. 水產科學，2017，36（3）：249-258.

[19] 張達娟，張樹林，王澤斌，等. 氮補充對氮饑餓銅綠微囊藻生長的影響[J]. 南方農業(yè)學報，2019，50（11）：2592-2598.

[20] 宋麗娜. 營養(yǎng)鹽濃度對海洋小球藻（sp.）葉綠素熒光及生長的影響[D]. 上海：華東師范大學，2010.

[21] 龐瑛. 四種水華藍藻磷吸收存儲機制研究[D]. 昆明：云南大學，2016.

[22] 魯男. 環(huán)境因子對銅綠微囊藻生長及產毒的影響研究[D]. 沈陽：遼寧大學，2015.

Effects of phosphorus supplements on the growth and chlorophyll fluorescence parameters of phosphorus deficiency

Zhang Dajuan, Zhang ShulinCorresponding Author, Dai Wei, Bi Xiangdong, Xu Yingfang, Wei Lingling

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

Phosphorus, an important element in algal cells, plays a vital role in the growth of algal, and is also an important limiting factor of cyanobacteria bloom. Effects of Simulated phosphorus supplement after deficiency on the growth and chlorophyll fluorescence parameters under laboratory conditions were carried out in this study. The results showed that, the cell density ofin the treatment group was 0.58×107cell/mL lower than that of control group significantly（＜0.05）after phosphorus deficiency 7 days. Thein the treatment group was also significantly lower than that of control group. After phosphorus supplement,grew fast, and the cell densities of both control and treatment groups were basically same by the end of the cultur, but the,andofin the treatment group were significantly higher than that of the control group. The results of this study can be used as a reference for the prevention and control ofbloom.

; phosphorus deficiency; phosphorus supplement; chlorophyll fluorescence parameters

1008-5394（2021）04-0031-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.008

S949

A

2020-04-14

天津市自然科學基金項目（19JCYBJC30000）；天津市淡水養(yǎng)殖產業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊（ITTFRS2021000009）；天津市教委科研計劃項目（2021KJ110）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊基金項目（TD13-5089）

張達娟（1981—），女，實驗師，博士，研究方向：養(yǎng)殖水環(huán)境調控與修復。E-mail：dajuanzhang@163.com。

張樹林（1963—），男，教授，博士，研究方向：養(yǎng)殖水環(huán)境調控與修復。E-mail：shulin63@sina.com。

責任編輯：張愛婷