李佳園，魏曉嘉，萬(wàn)國(guó)慧，楊 雪，于佳禾，劉金鳳，金重先，王雨青，呂 研，石晉麗

基于Nrf2/D1R-ERK信號(hào)通路探討甘松對(duì)左旋多巴誘導(dǎo)的異動(dòng)癥大鼠的作用機(jī)制

李佳園，魏曉嘉，萬(wàn)國(guó)慧，楊 雪，于佳禾，劉金鳳，金重先，王雨青，呂 研，石晉麗*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

基于Nrf2/D1R-ERK信號(hào)通路探討甘松對(duì)左旋多巴（levodopa，-DOPA）誘導(dǎo)的異動(dòng)癥（levodopa-induced dyskinesia，LID）模型大鼠的作用機(jī)制。將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、帕金森（Parkinson’s disease，PD）組、-DOPA組和甘松＋-DOPA組。PD組、-DOPA組和甘松＋-DOPA組頸背部sc魚(yú)藤酮葵花籽油（1.5 mg/kg）14 d制備PD模型，假手術(shù)組sc等體積葵花籽油，之后進(jìn)行14 d的藥物干預(yù)：DOPA組ig-DOPA（100 mg/kg）和芐絲肼（25 mg/kg），甘松＋-DOPA組ig甘松（1240 mg/kg）、-DOPA（100 mg/kg）和芐絲肼（25 mg/kg），假手術(shù)組和PD組ig等體積0.9%氯化鈉溶液。通過(guò)前肢功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)評(píng)估-DOPA對(duì)PD大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響；通過(guò)異常不自主運(yùn)動(dòng)（abnormal involuntary movement，AIM）評(píng)分評(píng)估-DOPA導(dǎo)致LID大鼠的AIM程度；采用免疫組化法考察大鼠黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的表達(dá)；Western blotting法檢測(cè)大鼠紋狀體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、多巴胺D1受體（dopamine D1 receptor，D1R）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化ERK（（phosphorylated ERK，p-ERK）和?FosB蛋白的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)大鼠腦紋狀體中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷蛋白-32（dopamine and adenosine 3′,5′-monophosphate-regulated phospho-protein，DARPP-32）和p-DARPP-32的含量。前肢功能檢測(cè)結(jié)果顯示，-DOPA單用和甘松與-DOPA聯(lián)用均能顯著增加PD大鼠的前肢跨步次數(shù)（＜0.001）。AIM評(píng)分結(jié)果顯示，與-DOPA單用相比，甘松與L-DOPA聯(lián)用可顯著降低LID大鼠的AIM癥狀（＜0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，PD組和-DOPA組的TH表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，而甘松與-DOPA聯(lián)用可明顯增強(qiáng)PD大鼠的TH表達(dá)（＜0.05），同時(shí)顯著增強(qiáng)-DOPA單用導(dǎo)致的LID大鼠的TH表達(dá)（＜0.01）。Nrf2信號(hào)通路結(jié)果顯示，PD組和-DOPA組沒(méi)有顯著性差異，而甘松與-DOPA聯(lián)用可明顯降低PD大鼠的ROS含量（＜0.05），顯著促進(jìn)Nrf2表達(dá)（＜0.01），并顯著提高HO-1、SOD、GSH-Px的含量（＜0.001）；同時(shí)還能顯著降低LID大鼠的ROS含量（＜0.001），明顯提高Nrf2、HO-1、SOD的含量（＜0.05），并顯著提高GSH-Px含量（＜0.01）。D1R-ERK信號(hào)通路結(jié)果顯示，甘松與-DOPA聯(lián)用能顯著降低LID大鼠的D1R表達(dá)（＜0.001），同時(shí)明顯減低?FosB、p-DARPP-32/DARPP-32、p-ERK/ERK的表達(dá)（＜0.05）。-DOPA可以改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，但不能降低TH的損傷，而且還會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和D1R-ERK通路的過(guò)表達(dá)。甘松聯(lián)合-DOPA給藥可明顯改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)損傷，抑制-DOPA引起的AIM現(xiàn)象，同時(shí)提高TH的表達(dá)。其機(jī)制可能是甘松通過(guò)激活Nrf2通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，并抑制D1R-ERK通路相關(guān)蛋白的過(guò)表達(dá)發(fā)揮抗LID作用。

甘松；帕金森；左旋多巴誘導(dǎo)的異動(dòng)癥；Nrf2信號(hào)通路；D1R-ERK信號(hào)通路

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是繼阿爾茨海默癥之后的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常、肌肉僵直等[2]，病理特征主要為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失[3]。目前PD的治療主要通過(guò)補(bǔ)充外源性多巴胺來(lái)緩解癥狀[4]。左旋多巴（levodopa，-DOPA）作為多巴胺的前體，是目前治療PD的首選藥物，能有效緩解PD的運(yùn)動(dòng)障礙，臨床常與芐絲肼聯(lián)用增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)其利用程度[5]。但-DOPA長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)一些局限性，如加速PD進(jìn)展過(guò)程中多巴胺能神經(jīng)元的死亡[6]、引起并發(fā)癥等。

異動(dòng)癥（levodopa-induced dyskinesia，LID）是長(zhǎng)期服用-DOPA后最常見(jiàn)的一種不良反應(yīng)[7]，臨床表現(xiàn)主要為肢體、軀干和面部的非自主、無(wú)目的、不規(guī)則運(yùn)動(dòng)，是PD患者晚期致殘的主要原因[8]。研究表明，在接受-DOPA治療15年以上的PD患者中，LID的累積發(fā)生率可高達(dá)95%[8]，嚴(yán)重影響了患者的生命質(zhì)量。目前，LID的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但研究發(fā)現(xiàn)主要與-DOPA在體內(nèi)代謝過(guò)程中引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和-DOPA長(zhǎng)期反復(fù)攝取導(dǎo)致基底神經(jīng)環(huán)路中多巴胺D1受體（dopamine D1 receptor，D1R）的過(guò)度激活有關(guān)[9]。研究表明，-DOPA進(jìn)入機(jī)體后，在代謝期間會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）形成氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞多巴胺能神經(jīng)元。此時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）作為機(jī)體自身的抗氧化通路[10-11]，可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少多巴胺能神經(jīng)元的損傷，緩解PD[12]和LID[13]。此外，當(dāng)D1R激活后，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號(hào)的磷酸化，而ERK信號(hào)通路持續(xù)過(guò)度活化被認(rèn)為是誘導(dǎo)和維持LID發(fā)生的主要原因[14]。因此，基于Nrf2和D1R-ERK通路探討藥物對(duì)LID的作用具有重要意義。

甘松為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖，有理氣止痛、開(kāi)郁醒脾之功[15]，具有神經(jīng)保護(hù)[16]、抗神經(jīng)退行性疾病[17]、鎮(zhèn)靜[18]等藥理作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘松提取物不同萃取部位均可增強(qiáng)6-羥基多巴胺損傷細(xì)胞的存活率，對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用[19]。甘松80%乙醇提取物對(duì)PD模型大鼠具有良好的治療效果，優(yōu)于甘松95%乙醇提取物和甘松水提取物，且甘松（生藥1240 mg/kg）聯(lián)合少量的-DOPA對(duì)PD的治療具有增效作用。此外，甘松還可提高多巴胺能神經(jīng)元含量，抑制炎性反應(yīng)，緩解PD伴發(fā)焦慮[20]。以上研究表明，甘松在治療PD方面具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值，但甘松對(duì)PD后期出現(xiàn)的LID是否也具有保護(hù)作用卻鮮有研究。本研究在PD模型的基礎(chǔ)上給予-DOPA的慢性刺激制備LID模型大鼠，考察甘松對(duì)LID模型大鼠Nrf2和D1R-ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用，以期為甘松治療LID的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，濕度40%～60%，溫度20～22 ℃，12 h光暗周期（7: 00～19: 00光照），自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)要求，均符合3R原則。

1.2 藥材

甘松購(gòu)自四川阿壩若爾蓋縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖。將藥材用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成粗粉，稱(chēng)取100 g置于1 L燒杯中，封口膜封口，依次用10、8、8倍量80%乙醇超聲提取3次，溫度控制在35 ℃以下，時(shí)間分別為60、45、45 min，靜置，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收溶劑，得棕色浸膏，將浸膏真空冷凍干燥，得到干燥的甘松80%乙醇提取物。HPLC測(cè)得含甘松新酮為0.56%，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

魚(yú)藤酮（批號(hào)R105076）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；葵花籽油（批號(hào)W24A11L122237）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；烏拉坦（批號(hào)C10821103）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；-DOPA購(gòu)自北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司；多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷蛋白-32（dopamine and adenosine 3′,5′-monophosphate-regulated phospho-protein，DARPP-32）ELISA試劑盒、磷酸化DARPP-32（phosphorylated DARPP-32，p-DARPP-32）ELISA試劑盒、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）ELISA試劑盒（批號(hào)20210706CM2）、ROS ELISA試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA試劑盒（批號(hào)20210617K）購(gòu)自江蘇酶免生物科技有限公司；D1R抗體（批號(hào)A2893）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；ERK抗體（批號(hào)GB11560）、p-ERK抗體（批號(hào)GB11004）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；Nrf2抗體（批號(hào)12721S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；?FosB抗體（批號(hào)ab227387）、β-actin抗體（批號(hào)AB227387）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（批號(hào)074-1506）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)074-1806）購(gòu)自KPL公司。

1.4 儀器

FW200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；RE3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；KW-1000DC型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞電器有限公司）；KH5200DE數(shù)控超聲波清洗器型（昆山合創(chuàng)超聲儀器有限公司）；RT-6100型多功能酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

2 方法

2.1 PD和LID模型的制備、分組及給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、PD組、-DOPA組和甘松＋-DOPA組。PD組、-DOPA組、甘松＋-DOPA組大鼠頸背部sc魚(yú)藤酮葵花籽油（1.5 mg/kg）14 d制備PD模型，假手術(shù)組sc等體積葵花籽油。當(dāng)大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃、精神萎靡不振、弓背和四肢力量減弱等癥狀時(shí)，表明造模成功[21]，共得到36只PD模型大鼠，造模成功率為90%。之后在PD模型大鼠的基礎(chǔ)上給予-DOPA和芐絲肼的慢性刺激制備LID模型[22]，同時(shí)進(jìn)行14 d的藥物干預(yù)：-DOPA組ig-DOPA（100 mg/kg）和芐絲肼（25 mg/kg）；甘松＋-DOPA組ig甘松（1240 mg/kg），30 min后ig-DOPA（100 mg/kg）和芐絲肼（25 mg/kg）；假手術(shù)組和PD組ig等體積0.9%氯化鈉溶液（5 mL/kg）。

2.2 前肢功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

前肢功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好地模擬PD患者的運(yùn)動(dòng)障礙[23]，可以用來(lái)確定-DOPA對(duì)PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙是否具有改善作用，以及甘松與-DOPA聯(lián)用是否影響-DOPA的療效。實(shí)驗(yàn)時(shí)一只手固定大鼠后半部軀體和雙后肢，另一只手托起一條前肢，使大鼠將其重心放置在著地的前肢上。在桌子上沿著大鼠負(fù)重肢體方向以18 cm/s的速度勻速移動(dòng)，記錄移動(dòng)時(shí)大鼠負(fù)重前肢的跨步數(shù)。重復(fù)3次，每次間隔30 min，取平均值作為大鼠前肢跨步數(shù)。

2.3 各組大鼠異常不自主運(yùn)動(dòng)（abnormal involuntary movement，AIM）評(píng)分

為了評(píng)價(jià)-DOPA導(dǎo)致的LID大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙程度，在文獻(xiàn)報(bào)道[24]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了AIM評(píng)分。在給予-DOPA后，每20分鐘評(píng)價(jià)1次，觀察周期為1 min，共觀察3次，取平均值。總AIM得分對(duì)應(yīng)3種AIM亞型（軸向、肢體和口舌）的得分之和。每種亞型的嚴(yán)重程度為0～4級(jí)（0級(jí)：沒(méi)有出現(xiàn)異動(dòng)；1級(jí)：偶然出現(xiàn)異動(dòng)；2級(jí)：頻繁出現(xiàn)異動(dòng)；3級(jí)：連續(xù)出現(xiàn)異動(dòng)；4級(jí)：連續(xù)出現(xiàn)異動(dòng)，且無(wú)法被抑制）。

2.4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的表達(dá)

大鼠ip 20%烏拉坦麻醉，充分暴露大鼠胸腔，將灌注針插入心臟左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳。每只大鼠先灌注300 mL PBS緩沖溶液，待大鼠心臟中流出的液體為無(wú)色澄清時(shí)，灌注100 mL多聚甲醛進(jìn)行固定。固定完成后在冰上迅速剝離出完整的大腦，浸泡于10倍量的多聚甲醛溶液中，靜置24 h。然后進(jìn)行石蠟包埋，冠狀面切片，梯度酒精脫水，染色，拍照，并將圖片導(dǎo)入至Image J軟件中，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的吸光度（）值及區(qū)域總面積的比值進(jìn)行分析，得到TH的平均值，以確定其表達(dá)情況。

2.5 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠紋狀體中Nrf2、D1R、p-ERK/ERK、?FosB的蛋白表達(dá)

大鼠ip 20%烏拉坦麻醉，迅速在冰上取出紋狀體，組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次，加入10倍量的組織蛋白提取試劑，剪成小塊置于勻漿器中勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解，4 ℃、13 000×離心5 min，收集上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，95～100 ℃沸水浴5 min。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入封閉液室溫封閉1 h；分別加入Nrf2、D1R、p-ERK/ERK、?FosB、β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（1∶5000），室溫孵育2 h，TBST洗4次，每次5 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，使用Image J分析蛋白條帶灰度值。

2.6 ELISA法檢測(cè)各組大鼠紋狀體中HO-1、SOD、GSH-Px活性及ROS、p-DARPP-32/DARPP-32含量

取低溫保存的紋狀體勻漿上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)HO-1、SOD、GSH-Px活性及ROS、p-DARPP-32/DARPP-32含量。

羅譯：The real fact is that one might have learned the doctrine earlier than the other,or might be a master in his own special field.[6]65

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用單因素方差進(jìn)行多組間比較，Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。符合正態(tài)分布的各組數(shù)據(jù)采用表示。

3 結(jié)果

3.1 前肢功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

采用前肢功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)-DOPA對(duì)PD大鼠運(yùn)動(dòng)障礙的影響及甘松與-DOPA聯(lián)用是否影響-DOPA的療效，如表1所示，與假手術(shù)組相比，PD組大鼠前肢運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著減少（＜0.001）；與PD組相比，-DOPA組和甘松＋-DOPA組大鼠的前肢運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著增多（＜0.001），且-DOPA組與甘松＋-DOPA組之間沒(méi)有顯著性差異。表明-DOPA能明顯改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，且甘松與-DOPA聯(lián)用對(duì)-DOPA治療PD的藥效未產(chǎn)生影響。

表1 各組大鼠前肢跨步次數(shù)(, n = 12)

Table 1 Forelimb stride times of rats in each group(, n = 12)

組別前肢跨步次數(shù) 假手術(shù)11.83±0.49 PD6.25±0.33*** L-DOPA10.25±0.33△△△ 甘松＋L-DOPA11.33±0.51△△△

與假手術(shù)組比較：***＜0.001；與PD組比較：△＜0.05△△＜0.01△△△＜0.001；與-DOPA組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

***<0.001sham group;△＜0.05△△<0.01△△△<0.001PD group;#<0.05##<0.01###<0.001-DOPA group, same as below tables

3.2 各組大鼠AIM評(píng)分

采用AIM評(píng)分評(píng)價(jià)-DOPA導(dǎo)致的LID大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙程度。如表2所示，假手術(shù)組和PD組大鼠均未表現(xiàn)出明顯的AIM現(xiàn)象。-DOPA組和甘松＋-DOPA組具有不同程度的AIM現(xiàn)象。與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組的AIM評(píng)分顯著降低（＜0.01）。表明與-DOPA單用相比，甘松與- DOPA聯(lián)用能顯著降低LID大鼠的AIM現(xiàn)象。

表2 各組大鼠AIM評(píng)分(, n = 12)

Table 2 AIM score of rats in each group(, n = 12)

組別AIM評(píng)分 L-DOPA28.75±2.25 甘松＋L-DOPA19.50±2.31##

3.3 甘松對(duì)各組大鼠黑質(zhì)TH表達(dá)的影響

如圖1所示，與假手術(shù)組相比，PD組TH表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與PD組相比，-DOPA組沒(méi)有顯著性差異，但甘松＋-DOPA組TH表達(dá)明顯升高（＜0.05）；與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組TH表達(dá)顯著升高（＜0.01）。表明在PD模型大鼠形成過(guò)程中，TH表達(dá)下降且胞體顯著縮小，多巴胺能神經(jīng)元被損壞；給予-DOPA后，TH表達(dá)沒(méi)有明顯提高，多巴胺能神經(jīng)元的損傷程度沒(méi)有被逆轉(zhuǎn)；而甘松＋-DOPA聯(lián)用可有效扭轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，提高TH表達(dá)，達(dá)到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。

A-假手術(shù)組 B-PD組 C-L-DOPA組 D-甘松＋L-DOPA組 與假手術(shù)組比較：**P＜0.01；與PD組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001；與L-DOPA組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

3.4 甘松對(duì)大鼠紋狀體Nrf2通路的影響

3.4.1 甘松對(duì)大鼠紋狀體ROS含量的影響 如表3所示，與假手術(shù)組相比，PD組大鼠紋狀體中ROS水平顯著升高（＜0.001）；與PD組相比，-DOPA組有升高的趨勢(shì)，但甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體ROS含量明顯降低（＜0.05）；與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體ROS含量顯著降低（＜0.001）。表明在PD模型大鼠中，ROS因無(wú)法及時(shí)清除發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，而服用-DOPA后，沒(méi)有減輕ROS含量，又因-DOPA在體內(nèi)代謝產(chǎn)生ROS，加重了氧化應(yīng)激反應(yīng)。甘松與-DOPA聯(lián)用可有效抑制ROS的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.4.2 甘松對(duì)大鼠紋狀體Nrf2蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，與對(duì)照組相比，PD組大鼠紋狀體中Nrf2蛋白表達(dá)有升高的趨勢(shì)；與PD組相比，-DOPA組沒(méi)有顯著差異，但甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體的Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體的Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.05）。表明在正常機(jī)體中，抗氧化因子Nrf2處于靜息狀態(tài)，表達(dá)不明顯；在PD模型大鼠中，機(jī)體會(huì)自發(fā)啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制使抗氧化因子Nrf2由靜息狀態(tài)變?yōu)榛钴S，并促進(jìn)Nrf2的表達(dá)來(lái)抑制過(guò)量的ROS；藥物干預(yù)后，與-DOPA單用比較，甘松與-DOPA聯(lián)用后，Nrf2表達(dá)顯著提高，表明甘松可通過(guò)提高Nrf2表達(dá)，降低體內(nèi)ROS的含量，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表3 各組大鼠紋狀體ROS含量(, n = 8)

Table 3 ROS content in striatum of rats in each group (, n = 8)

組別ROS/(ng·mg?1) 假手術(shù)45.42±7.88 PD125.60±14.34*** L-DOPA146.00±9.73 甘松＋L-DOPA79.60±4.11△###

3.4.3 甘松對(duì)大鼠紋狀體HO-1、SOD、GSH-Px活性的影響 如表4所示，與假手術(shù)組相比，PD組大鼠紋狀體HO-1、SOD和GSH-Px活性均有升高的趨勢(shì)；與PD組相比，-DOPA組沒(méi)有顯著性差異，但甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體中HO-1、SOD、GSH-Px活性顯著升高（＜0.001）；與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體HO-1、SOD活性明顯升高（＜0.05），GSH-Px活性顯著升高（＜0.01）。表明在正常機(jī)體中，氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡，HO-1、SOD、GSH-Px均處于靜息狀態(tài)，表達(dá)不明顯；在PD大鼠中，機(jī)體ROS異常增多導(dǎo)致HO-1、SOD、GSH-Px抗氧化因子被自發(fā)激活；藥物干預(yù)后，與-DOPA單用比較，甘松與-DOPA聯(lián)用可顯著提高HO-1、SOD、GSH-Px的表達(dá)，對(duì)抑制過(guò)量ROS的產(chǎn)生具有積極作用。

圖2 各組大鼠紋狀體Nrf2蛋白表達(dá)情況(, n = 3)

表4 各組大鼠紋狀體HO-1、SOD和GSH-Px活性()

Table 4 HO-1, SOD and GSH-Px activities in striatum of rats in each group ()

組別HO-1/(ng·mg?1)(n = 6)SOD/(ng·mg?1)(n = 8)GSH-Px/(ng·mg?1)(n = 8) 假手術(shù)1.54±0.071.52±0.182.81±0.24 PD1.97±0.141.84±0.103.78±0.35 L-DOPA2.36±0.082.27±0.214.26±0.32 甘松＋L-DOPA2.98±0.21△△△#3.12±0.20△△△#5.94±0.34△△△##

3.5 甘松對(duì)大鼠D1R-ERK通路的影響

3.5.1 甘松對(duì)大鼠紋狀體D1R、p-ERK/ERK、?FosB蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與PD組相比，-DOPA組大鼠紋狀體D1R、p-ERK/ERK、?FosB蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001、0.01）；與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體D1R、p-ERK/ERK、?FosB蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.001）。表明PD模型大鼠大量服用-DOPA會(huì)激活D1R-ERK通路上的相關(guān)蛋白，而甘松與-DOPA聯(lián)用對(duì)D1R-ERK通路的過(guò)度激活具有抑制作用。

圖3 各組大鼠紋狀體D1R、p-ERK/ERK和?FosB蛋白表達(dá)(, n = 3)

3.5.2 甘松對(duì)大鼠紋狀體p-DARPP-32/DARPP-32蛋白表達(dá)的影響 如表5所示，與PD組相比，-DOPA組大鼠紋狀體p-DARPP-32/DARPP-32蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。與-DOPA組相比，甘松＋-DOPA組大鼠紋狀體D1R蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05）。表明PD模型大鼠大量服用-DOPA會(huì)導(dǎo)致p-DARPP-32/DARPP-32蛋白激活，甘松與-DOPA聯(lián)用可以抑制該蛋白的過(guò)度激活。

表5 各組大鼠紋狀體p-DARPP-32/DARPP-32蛋白表達(dá)(, n = 8)

Table 5 p-DARPP-32/DARPP-32 protein expression in striatum of rats in each group (, n = 8)

組別p-DARPP-32/DARPP-32/(ng·mg?1) 假手術(shù)0.27±0.02 PD0.34±0.03 L-DOPA0.61±0.09△△ 甘松＋L-DOPA0.39±0.05#

4 討論

目前PD模型制備常用的神經(jīng)毒素有魚(yú)藤酮[25]、6-OHDA[26]和MPTP[27]，其中魚(yú)藤酮所致的PD模型在行為學(xué)改變和病理學(xué)特征上與臨床PD患者更為接近，且容易穿透血腦屏障、造模成功率高、價(jià)廉易得[28]，此外，魚(yú)藤酮可以直接作用于多巴胺能神經(jīng)元，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙和增加ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的變性[29]。因此本研究采用sc魚(yú)藤酮制備PD模型，并在此基礎(chǔ)上給予大量的-DOPA制備LID模型大鼠[30-31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PD模型大鼠的前肢跨步次數(shù)顯著降低，ROS含量增多，TH表達(dá)下降，多巴胺能神經(jīng)元被嚴(yán)重破壞。給予-DOPA治療后，前肢跨步次數(shù)有所增加，但沒(méi)有緩解ROS增多的現(xiàn)象，且因-DOPA在體內(nèi)代謝時(shí)也會(huì)產(chǎn)生ROS，使得氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)一步加重；此外，-DOPA還激活了D1R-ERK通路，此時(shí)機(jī)體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)增加，出現(xiàn)AIM[32-33]。與-DOPA單用相比，甘松與-DOPA聯(lián)用可以激活Nrf2通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)甘松與-DOPA聯(lián)用還能抑制D1R-ERK通路相關(guān)蛋白，最終起到治療LID的作用。具體機(jī)制分析見(jiàn)圖4。

首先，外源性-DOPA進(jìn)入機(jī)體后，在氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）的代謝下成為多巴胺，多巴胺進(jìn)一步代謝為3,4-二羥基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）和高香草酸（homovanillicacid，HVA），反應(yīng)的副產(chǎn)物包括ROS、H2O2等，此時(shí)機(jī)體由于氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，ROS不能被及時(shí)清除，機(jī)體會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇疾病進(jìn)程[34]。Nrf2是機(jī)體抗氧化防御機(jī)制中關(guān)鍵的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)多種抗氧化酶的活性，對(duì)于降低PD患者體內(nèi)ROS的含量、減輕多巴胺能神經(jīng)元變性至關(guān)重要[13]。當(dāng)機(jī)體受到ROS的刺激時(shí)，Nrf2和Keap1解離，遷移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），啟動(dòng)下游多種抗氧化酶（如HO-1、SOD、GSH-Px等）的表達(dá)[35-36]，它們能保護(hù)機(jī)體免受氧化物質(zhì)造成的損害，減少外源性刺激引起的多種疾病。

圖4 甘松治療LID的具體機(jī)制

其次，長(zhǎng)期服用外源性-DOPA，會(huì)導(dǎo)致D1R激活，當(dāng)D1R被激活后，會(huì)引起其下游cAMP信號(hào)級(jí)聯(lián)的持續(xù)和間歇性高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致cAMP依賴(lài)的蛋白激酶A（protein kinases A，PKA）和DARPP-32的活性增加，使DARPP-32磷酸化[37]。DARPP-32作為D1R下游信號(hào)通路上重要的整合分子，當(dāng)其磷酸化后會(huì)通過(guò)抑制蛋白磷酸酶-1（protein phosphatase-1，PP-1）從而促進(jìn)ERK的磷酸化[15]。研究表明，D1R下游ERK信號(hào)通路持續(xù)過(guò)度活化是誘導(dǎo)和維持LID發(fā)生的主要機(jī)制，在許多動(dòng)物模型中干擾介導(dǎo)ERK激活的細(xì)胞內(nèi)因子可以改善LID癥狀[38-39]。此外，ERK過(guò)度激活，會(huì)促使其下游?FosB蛋白的生成，在棘狀神經(jīng)元中?FosB的蓄積被認(rèn)為是LID發(fā)生的標(biāo)志分子，且蓄積的程度與LID行為學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，選擇性阻止?FosB的蓄積則會(huì)顯著減輕LID[40]。如Ukgansan可通過(guò)降低紋狀體中D1R相關(guān)信號(hào)蛋白（如p-ERK、?FosB、c-fos等）的過(guò)表達(dá)改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙，恢復(fù)多巴胺能神經(jīng)元，減緩LID的進(jìn)程[41]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘松乙醇提取物對(duì)體內(nèi)、體外PD模型均有良好的抑制作用。本研究通過(guò)Nrf2和D1R-ERK 2條信號(hào)通路證明了甘松對(duì)LID具有良好的治療作用。此外，有學(xué)者分別利用體內(nèi)、體外模型研究甘松對(duì)阿爾茨海默癥的作用，結(jié)果表明甘松能夠減輕Aβ誘導(dǎo)的腦內(nèi)細(xì)胞死亡，同時(shí)能夠降低小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、ROS水平及ERK的磷酸化，證明甘松的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抗氧化、抗炎及抑制ERK信號(hào)通路的激活作用有關(guān)[42]，與本研究結(jié)果可以互為佐證。

綜上所述，甘松通過(guò)增強(qiáng)PD大鼠的TH表達(dá)和激活Nrf2信號(hào)通路，對(duì)-DOPA緩解PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙起到了促進(jìn)作用。同時(shí)，甘松通過(guò)抑制D1R-ERK信號(hào)通路，改善了慢性-DOPA引起的AIM癥狀。本研究為甘松聯(lián)合-DOPA治療LID的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofon levodopa-induced dyskinesia in rats based on Nrf2/D1R-ERK signaling pathway

LI Jia-yuan, WEI Xiao-jia, WAN Guo-hui, YANG Xue, YU Jia-he, LIU Jin-feng, JIN Zhong-xian, WANG Yu-qing, LYU Yan, SHI Jin-li

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To explore the mechanism of(Nar) on levodopa (-DOPA)-induced dyskinesia (LID) model rat based on Nrf2/D1R-ERK signaling pathway.SD rats were randomly divided into sham group, Parkinson’s disease (PD) group,-DOPA group and Nar +-DOPA group. Rats in PD group,-DOPA group, and Nar +-DOPA group were sc rotenone sunflower oil (1.5 mg/kg) on the back of neck for 14 d to prepare PD model. Rats in sham group was sc same amount of sunflower oil. Then 14 d of drug intervention was carried out: rats in-DOPA group were ig-DOPA (100 mg/kg) and benserazide (25 mg/kg), rats in Nar +-DOPA group were ig Nar (1240 mg/kg),-DOPA (100mg/kg) and benserazide (25 mg/kg), rats in sham group and PD group were ig same amount of normal saline. Effect of-DOPA on motor ability of PD rats was evaluated by forelimb function test. Abnormal involuntary movement (AIM) score was used to assess the AIM degree of LID induced by-DOPA in rats. Expression of tyrosine hydroxylase (TH) in substantia nigra of rats was investigated by immunohistochemical staining. Expressions of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), dopamine D1 receptor (D1R), extracellular regulated protein kinases (ERK), p-ERK and ?FosB protein in rats striatum was detected by Western blotting. ELISA method was used to detected the contents of reactive oxygen species (ROS), heme oxygenase-1 (HO-1), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), dopamine and adenosine 3′,5′-monophosphate-regulated phosphoprotein (DARPP-32), p-DARPP-32 in the striatum of rats.The results of the forelimb function test showed that-DOPA alone and Nar +-DOPA combined significantly increased the number of forelimb strides in PD rats (< 0.001). The AIM score results showed that compared with-DOPA alone, the combination of Nar +-DOPA significantly reduced the AIM symptoms of LID rats (< 0.01). Immunohistochemical results showed that there was no significant difference in TH expression between PD group and-DOPA group. The combination of Nar +-DOPA significantly enhanced TH expression in PD rats (< 0.05), and significantly enhanced TH expression in LID rats induced by-DOPA alone (< 0.01). Nrf2 signaling pathway showed no significant difference between PD group and-DOPA group. The combination of Nar +-DOPA significantly decreased ROS content (< 0.05), significantly promoted Nrf2 expression (＜0.01), significantly increased the contents of HO-1, SOD and GSH-Px of PD rats (< 0.001). The combination of Nar +-DOPA significantly decreased ROS content (< 0.001), significantly increased Nrf2, HO-1, SOD content (< 0.05), and increased GSH-Px content in LID rats (< 0.01). D1R-ERK signaling pathway results showed that the combination of Nar +-DOPA significantly decreased the expression of D1R in LID rats (< 0.001), significantly reduced the expressions of ?FosB, p-DARPP-32/DARPP-32 and p-ERK/ERK (< 0.05).-DOPA can alleviate dyskinesia in PD rats, but it can not reduce the damage of TH, and can induce an oxidative stress response and overexpression of D1R-ERK pathway. Nar combined with-DOPA significantly alleviated the motor injury of PD rats, inhibited AIM phenomenon caused by-DOPA and increased TH expression. The mechanism may be that Nar plays an anti-LID role by activating the expression of related proteins in Nrf2 pathway and inhibiting the overexpression of related proteins in D1R-ERK pathway.

DC.; Parkinson’s disease; levodopa-induced dyskinesia; Nrf2 signaling pathway; D1R-ERK signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)01 - 0134 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.017

2021-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82073971）

李佳園（1997—），女，碩士研究生。E-mail: 20190935157@bucm.edu.cn

石晉麗，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。E-mail: shijl@vip.sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]