錢純果，金 路，朱龍平，周 洋，黎潤南，楊得坡，徐新軍，趙志敏*

桂枝中化學(xué)成分及抗腫瘤和抗炎活性研究

錢純果1, 2，金 路1, 2，朱龍平1, 2，周 洋1, 2，黎潤南3，楊得坡1, 2，徐新軍1, 2，趙志敏1, 2*

1. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省現(xiàn)代中藥工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510006 3. 德慶縣德鑫農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526600

對桂枝中非揮發(fā)性化學(xué)成分及其抗腫瘤、抗炎活性進行研究。運用D101大孔吸附樹脂、正反相硅膠、Sephadex LH-20以及半制備HPLC等多種色譜方法進行分離純化，并根據(jù)其波譜數(shù)據(jù)鑒定出化合物的結(jié)構(gòu)；通過測定化合物對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）的抑制能力，并采用MTT 法考察其對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的體外抑制能力，進而評價化合物的抗炎和抗腫瘤活性。從桂枝甲醇提取物中共分離得到21個化合物，分別鑒定為表兒茶素（1）、2-(3,4-二羥苯基)乙基-β--吡喃葡萄糖苷（2）、3,5-二羥苯基-乙醇-3--β-吡喃葡萄糖苷（3）、staphylionoside D（4）、glochidionionoside C（5）、柑橘苷 A（6）、dendranthemoside A（7）、euodionoside G（8）、euodionoside F（9）、3,4,5-三甲氧苯基-1--β--呋喃芹糖-(1′′→6′)-β--吡喃葡萄糖苷（10）、淫羊藿次苷D1（11）、淫羊藿次苷F2（12）、(+)-lyonirenisol-3a--β--glucopyranoside（13）、l--guaiacylglycerol-8--β- glucopyranoside（14）、鄰甲氧基肉桂醛（15）、肉桂醛（16）、肉桂酸（17）、4-羥基-3-甲氧基肉桂醛（18）、鄰甲氧基苯甲酸（19）、(2,3) -5,7-二甲氧基-3′,4′-亞甲二氧基黃烷醇（20）、苯甲酸（21）。其中，化合物1、20為黃酮類化合物，2、3、10～12為芳香苷類化合物，4～9為降倍半萜苷類化合物，13、14為苯丙素苷類化合物，15～18為苯丙素類化合物，19、21為苯甲酸類化合物?？寡住⒖鼓[瘤活性篩選結(jié)果表明，化合物15可以有效降低MDA-MB-231細(xì)胞的存活能力，其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為（34.11±3.42）μmol/L?；衔?5、16、18、20對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO具有一定的抑制作用，其IC50分別為（5.27±0.62）、（7.98±2.41）、（7.91±0.81）、（70.34±3.07）μmol/L。化合物2～10、12、14首次從桂枝中分離得到，其中化合物3、5～9、14首次從樟科植物中分離得到，化合物4首次從樟屬植物中分離得到；化合物15能有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的生長；化合物15、16、18、20可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的NO釋放，具有潛在的抗炎作用；桂枝的化學(xué)成分及活性研究為其物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立以及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

桂枝；肉桂醛；鄰甲氧基肉桂醛；肉桂酸；抗炎；抗腫瘤

桂枝為樟科（Lauraceae）植物肉桂Presl的干燥嫩枝，主產(chǎn)于云南、廣西、廣東等地[1]。其性辛、甘、溫，歸心、肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽化氣、平?jīng)_降氣的作用，在臨床上主要用于風(fēng)寒濕痹的治療，具有祛風(fēng)散寒、清熱豁痰和通經(jīng)活血的功效[1-2]。迄今對桂枝的化學(xué)成分研究顯示，從桂枝中分離鑒定出121種化合物，主要化學(xué)成分類別為苯丙素類、萜類、黃酮及其苷類、揮發(fā)油、有機酸、甾體、酚酸類和內(nèi)酯類[3]。國內(nèi)外對桂枝藥理活性的研究表明，桂枝具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗肥胖、抗病毒、抗抑郁、神經(jīng)保護和舒張血管的作用[4-11]。前期有臨床研究證明了含有桂枝的康婦消癥片和桂枝茯苓丸對子宮肌瘤患者有治療作用，近期研究表明桂枝茯苓膠囊可通過降低血清性激素（促黃體素、孕酮、雌二醇、卵泡刺激素）水平、增強自然殺傷細(xì)胞（NK）活性，輔助治療子宮肌瘤[12-13]。為進一步明確桂枝中有效抗炎、抗腫瘤的活性成分，本課題組從桂枝甲醇提取物中分離得到21個化合物，分別鑒定為表兒茶素（epicatechin，1）、2-(3,4-二羥苯基)乙基-β--吡喃葡萄糖苷[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-- glucopyranoside，2]、3,5-二羥苯基-乙醇-3--β-吡喃葡萄糖苷（3,5-dihydroxyphenethyl alcohol 3--β- glucopyranoside，3）、staphylionoside D（4）、glochidionionoside C（5）、柑橘苷A（citroside A，6）、dendranthemoside A（7）、euodionoside G（8）、euodionoside F（9）、3,4,5-三甲氧苯基-1--β--呋喃芹糖-(1′′→6′)-β--吡喃葡萄糖苷[3,4,5- trimethoxyphenyl-1--β--apiofuranosyl-(1′′→6′)- glucopyranoside，10]、淫羊藿次苷D1（icariside D1，11）、淫羊藿次苷F2（icariside F2，12）、(＋)- lyonirenisol-3a--β--glucopyranoside（13）、l-- guaiacylglycerol-8--β-glucopyranoside（14）、鄰甲氧基肉桂醛（-methoxy cinnamaldehyde，15）、肉桂醛（cinnamaldehyde，16）、肉桂酸（cinnamic acid, 17）、4-羥基-3-甲氧基肉桂醛（4-hydroxy-3-methoxy- cinnamaldehyde，18）、鄰甲氧基苯甲酸（-anisic acid，19）、(2,3)-5,7-二甲氧基-3′,4′-亞甲二氧基黃烷醇[(2,3)-5,7-dimethoxy-3′,4′-methylene- dioxyflavan-3-ol，20]、苯甲酸（benzoic acid，21）。其中，化合物1、20為黃酮類化合物，2、3、10～12為芳香苷類化合物，4～9為降倍半萜苷類化合物，13、14為苯丙素苷類化合物，15～18為苯丙素類化合物，19、21為苯甲酸類化合物?；衔?～10、12、14首次從桂枝中分離得到，其中化合物3、5～9、14首次從樟科中分離得到，化合物4首次從樟屬中分離得到。在化合物2～20體外活性評價中，化合物15對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為（34.11±3.42）μmol/L；化合物15、16、18、20可以顯著抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7一氧化氮（NO）釋放，具有潛在的抗炎作用，其IC50分別為（5.27±0.62）、（7.98±2.41）、（7.91±0.81）、（70.34±3.07）μmol/L。

1 儀器與材料

Bruker Avance III核磁共振儀（布魯克拜厄斯賓有限公司）；島津LC-15C高效液相色譜儀（日本島津公司）；Ultimate AQ-C18色譜柱[月旭科技 (上海）股份有限公司]；冷卻水循環(huán)裝置、水濾抽氣機、水浴鍋（上海愛郎儀器有限公司）；Thermo MAT95XP EI高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；多功能酶標(biāo)儀（德國BMG公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；生物倒置顯微鏡（德國Leica公司）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；柱色譜硅膠、GF254薄層色譜硅膠板（青島海洋化工公司）；UniSil 30～120 C18（蘇州納微科技股份有限公司）；甲醇HPLC（瑞典歐普森公司）；分析純化學(xué)試劑（天津致遠(yuǎn)精細(xì)化工有限公司），氘代試劑（美國CIL公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司）；總一氧化氮檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；MTT、二甲基亞砜（美國Sigma-Aldrich公司）。

實驗用藥材桂枝于2019年12月采自廣東省德慶縣鳳村鎮(zhèn)干相村，經(jīng)中山大學(xué)楊得坡教授鑒定為肉桂Presl的干燥嫩枝。該植物標(biāo)本（20191209）目前保存于中山大學(xué)藥學(xué)院。

2 提取與分離

干燥桂枝8.26 kg粉碎后用甲醇室溫浸泡提取3次，將濾液減壓濃縮后得到的浸膏分散于水中，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位浸膏76.25 g、醋酸乙酯部位浸膏157.12 g、正丁醇部位浸膏278.63 g。正丁醇提取物經(jīng)大孔吸附樹脂D101分離，依次以甲醇-水（1∶4→1∶0）為洗脫劑進行梯度洗脫得到5個流分Fr. 1～5。Fr. 2 （7.75 g）經(jīng)硅膠柱（100～200目）色譜，二氯甲烷-甲醇（98∶2→70∶30）梯度洗脫得到7個組分Fr. 2-1～2-7。Fr. 2-2（513.7 mg）經(jīng)凝膠柱色譜分離，HPLC半制備色譜（20%乙腈）純化，得到化合物1（3.0 mg，R＝15 min）。Fr. 2-4（1.265 2 g）經(jīng)C18反相柱色譜，甲醇-水（1∶9→1∶0）梯度洗脫得到16個組分Fr. 2-4-1～2-4-16。Fr. 2-4-4（41.1 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜（11%甲醇）純化，得到化合物2（8.9 mg，R＝22 min）。Fr. 2-4-5（44.3 mg）經(jīng) HPLC半制備色譜（20%甲醇）純化，得到化合物3（11.0 mg，R＝13 min）。Fr. 2-4-9（152.2 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜（15%甲醇）純化，得到化合物10（63.4 mg，R＝46 min）。Fr. 2-4-10（319.6 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜（28%甲醇）純化，得到化合物4（11.9 mg，R＝24 min）、5（4.6 mg，R＝48 min）。Fr. 2-4-11（57.0 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜（25%甲醇）純化，得到化合物6（3.8 mg，R＝24 min）、7（3.4 mg，R＝29 min）、13（22.1 mg，R＝34 min）。Fr. 2-4-13（97.0 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜（26%甲醇）純化，得到化合物8（9.1 mg，R＝33 min）、9（6.0 mg，R＝31 min）、11（8.8 mg，R＝29 min）。Fr. 2-4-14（57.7 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜（28%甲醇）純化，得到化合物12（12.4 mg，R＝23 min）。Fr. 2-5（1.459 6 g）經(jīng)C18反相柱色譜，HPLC半制備色譜（6%甲醇）純化得到化合物14（18.7 mg，R＝32 min）。

將石油醚，醋酸乙酯部位浸膏合并，經(jīng)硅膠柱色譜（60～100目）以石油醚-醋酸乙酯（10∶1→0∶1）進行梯度洗脫，合并得到6個部分Fr. A～F，F(xiàn)r. D（32.31 g）經(jīng)反相C18柱色譜分離，用甲醇-水（30∶70～100∶0）進行梯度洗脫，得到4個組分Fr. D1～D4。Fr. D1（15.42 g）經(jīng)C18反相柱色譜，硅膠柱（100～200目）色譜，HPLC半制備色譜（55%甲醇）純化，得到化合物15（225.3 mg，R＝24 min）、16（121.2 mg，R＝18 min）、17（86.0 mg，R＝20 min）、21（28.8 mg，R＝15 min）。Fr. E（16.32 g）經(jīng)C18反相柱色譜，甲醇-水（3∶7→1∶0）梯度洗脫得到9個組分Fr. E1～E9。Fr. E2（705.0 mg）經(jīng)凝膠柱色譜分離，HPLC半制備色譜（52%甲醇）純化，得到化合物18（5.6 mg，R＝13 min）、19（5.5 mg，R＝24 min）。Fr. E8（532.6 mg）經(jīng)凝膠柱色譜分離，HPLC半制備色譜（54%甲醇）純化，得到化合物20（13.1 mg，R＝20 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（甲醇），ESI-MS/: 313.068 4 [M＋Na]+，分子式為C15H14O6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.97 (1H, d,= 1.5 Hz, H-2′), 6.80 (1H, dd,= 8.2, 1.5 Hz, H-6′), 6.76 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 5.94 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 5.92 (1H , d,= 2.2 Hz, H-6), 4.82 (1H, brsH-2), 4.18 (1H, m, H-3), 2.86 (1H, dd,= 16.8, 4.4 Hz, H-4a), 2.73 (1H, dd,= 16.8, 2.8 Hz, H-4b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 158.0 (C-5), 157.7 (C-7), 157.4 (C-9), 145.9 (C-3′), 145.8 (C-4′), 132.3 (C-1′), 119.4 (C-6′), 115.9 (C-2′), 115.3 (C-5′), 100.1 (C-10), 96.4 (C-6), 95.9 (C-8), 79.9 (C-2), 67.5 (C-3), 29.2 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物1為表兒茶素。

化合物2：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 339.105 0 [M＋Na]+，分子式為C14H20O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.68 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.65 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.54 (1H, dd,= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 4.27 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1′), 4.02 (1H, m, H-8a), 3.86 (1H, dd,= 11.3, 1.4 Hz, H-6′), 3.71～3.64 (3H, m, H-5′, 6′, 8), 3.30～3.25 (2H, m, H-2′, 3′), 3.17 (1H, m, H-4′), 2.77 (2H, m, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 146.1 (C-3), 144.6 (C-4), 131.5 (C-1), 121.2 (C-6), 117.1 (C-5), 116.3 (C-2), 104.4 (C-1′), 78.1 (C-5′), 77.9 (C-3′), 75.1 (C-2′), 72.1 (C-4′), 71.6 (C-8), 62.7 (C-6′), 36.5 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[15-16]，故鑒定化合物2為2-(3,4-二羥苯基)乙基-β--吡喃葡萄糖苷。

化合物3：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 339.104 9 [M＋Na]+，分子式為C14H20O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.07 (1H, d,= 1.5 Hz, H-2), 6.75 (1H, d,= 1.5 Hz, H-6), 6.74 (1H, s, H-4), 4.75 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1′), 3.90 (1H, dd,= 12.4, 2.0 Hz, H-6′a), 3.71 (3H, m, H-8, 6′b), 3.48 (2H, m, H-2′, 3′), 3.41 (2H, m, H-4′, 5′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 146.9 (C-5), 146.6 (C-3), 132.0 (C-1), 125.2 (C-6), 119.5 (C-2), 117.0 (C-4), 104.4 (C-1′), 78.3 (C-3′), 77.6 (C-5′), 74.9 (C-2′), 71.4 (C-4′), 64.3 (C-8), 62.5 (C-6′), 39.5 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[17]，故鑒定化合物3為3,5-二羥苯基-乙醇- 3--β-吡喃葡萄糖苷。

化合物4：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 409.183 3 [M＋Na]+，分子式為C19H30O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.84 (1H, s, H-8), 4.45 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 4.35 (1H, m, H-3), 3.88 (1H, dd,= 12.0, 1.6 Hz, H-6′a), 3.70 (1H, m, H-6′b), 3.16 (1H, dd,= 8.8, 8.0 Hz, H-2′), 2.38 (1H, ddd,= 13.0, 4.0, 2.0 Hz, H-4a), 2.18 (3H, s, H-10), 2.09 (1H, ddd,= 13.0, 4.0, 2.0 Hz, H-2a), 1.49 (1H, m, H-2b), 1.46 (1H, m, H-4b), 1.40 (3H, s, H-13), 1.39 (3H, s, H-11), 1.16 (3H, s, H-12)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 211.4 (C-9), 200.9 (C-7), 120.0 (C-6), 102.6 (C-1′), 101.2 (C-8), 78.1 (C-3′), 77.9 (C-5′), 75.1 (C-2′), 72.5 (C-3), 72.4 (C-5), 71.6 (C-4′), 62.7 (C-6′), 48.1 (C-4), 46.6 (C-2), 37.0 (C-1), 32.3 (C-12), 30.8 (C-13), 29.4 (C-11), 26.5 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物4為staphylionoside D。

化合物5：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 409.182 7 [M＋Na]+，分子式為C19H30O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.26 (1H, brs, H-4), 5.72 (1H, dd,= 15.5, 6.0 Hz, H-8), 5.61 (1H, dd,= 15.5, 9.0 Hz, H-7), 4.48 (1H, dd,= 16.6, 1.6 Hz, H-13a), 4.28 (1H, m, H-9), 4.27 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 4.26 (1H, m, H-13b), 3.87 (1H, dd,= 11.8, 1.8 Hz, H-6′a), 3.66 (1H, dd,= 11.8, 5.5 Hz, H-6′b), 3.35 (1H, m, H-3′), 3.29 (1H, m, H-4′), 3.27 (1H, m, H-5′), 3.24 (1H, m, H-2′), 2.75 (1H, d,= 9.0 Hz, H-6), 2.50 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.09 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2b), 1.24 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.04 (3H, s, H-11), 0.99 (3H, s, H-12)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 202.0 (C-3), 164.0 (C-5), 140.4 (C-8), 127.3 (C-7), 124.1 (C-4), 103.5 (C-1′), 78.1 (C-3′, 5′), 75.0 (C-2′), 71.6 (C-4′), 70.0 (C-13), 68.9 (C-9), 62.7 (C-6′), 52.0 (C-6), 48.9 (C-2), 37.1 (C-1), 27.9 (C-12), 27.5 (C-11), 23.8 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[19-20]，故鑒定化合物5為glochidionionoside C。

化合物6：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 409.183 0 [M＋Na]+，分子式為C19H30O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.91 (1H, s, H-8), 4.33 (1H, m, H-3), 4.53 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 3.82 (1H, dd,= 11.7, 2.1 Hz, H-6′a), 3.62 (1H, dd,= 11.7, 5.2 Hz, H-6′b), 3.24～3.38 (3H, m, H-3′～5′), 3.15 (1H, dd,= 9.0, 7.7 Hz, H-2′), 2.49 (1H, ddd,= 13.4, 3.9, 2.0 Hz, H-4a), 2.20 (3H, s, H-10), 1.93 (1H, ddd,= 12.4, 3.9, 2.0 Hz, H-2a), 1.48 (3H, s, H-13), 1.38 (3H, s, H-12), 1.35 (1H, m, H-4b), 1.31 (1H, m, H-2b), 1.16 (3H, s, H-11)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 213.0 (C-9), 200.7 (C-7), 119.1 (C-6), 101.4 (C-8), 98.7 (C-1′), 78.7 (C-5), 78.6 (C-3′), 77.8 (C-5′), 75.3 (C-2′), 71.7 (C-4′), 63.8 (C-3), 62.9 (C-6′), 49.9 (C-2), 48.0 (C-4), 37.0 (C-1), 32.5 (C-13), 30.1 (C-12), 26.7 (C-11), 26.6 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[21]，故鑒定化合物6為柑橘苷A。

化合物7：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 413.214 2 [M＋Na]+，分子式為C19H34O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.73 (1H, dd,= 15.7, 6.0 Hz, H-8), 5.56 (1H, dd,= 15.7, 0.8 Hz, H-7), 4.36 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′), 4.30 (1H, m, H-9), 3.96 (1H, m, H-3), 3.86 (1H, m, H-6′a), 3.66 (1H, m, H-6′b), 3.14 (1H, dd,= 9.0, 7.8 Hz, H-2′), 1.98 (1H, m, H-5), 1.83 (1H, m, H-4a), 1.69 (1H, t,= 12.0 Hz, H-2a), 1.58 (1H, ddd,= 12.0, 4.0, 2.0 Hz, H-2b), 1.50 (1H, q,= 12.4 Hz, H-4b), 1.25 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 0.99 (3H, s, H-11), 0.91 (3H, s, H-12), 0.83 (3H, d,= 6.7 Hz, H-13)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 135.5 (C-8), 133.8 (C-7), 102.6 (C-1′), 78.3 (C-6), 78.1 (C-3′), 77.9 (C-5′), 75.6 (C-3), 75.1 (C-2′), 71.7 (C-4′), 69.2 (C-9), 62.8 (C-6′), 42.6 (C-2), 40.4 (C-1), 38.1 (C-4), 35.5 (C-5), 25.9 (C-12), 25.1 (C-11), 24.1 (C-10), 16.4 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[22]，故鑒定化合物7為dendranthemoside A。

化合物8：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 411.198 8 [M＋Na]+，分子式為C19H32O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.18 (1H, brs, H-4), 4.63 (2H, dd,= 16.8, 1.6 Hz, H-13a), 4.34 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 4.26 (1H, dd,= 16.8, 1.6 Hz, H-13b), 3.87 (1H, dd,= 11.8, 1.5 Hz, H-6′a), 3.68 (1H, m, H-9), 3.66 (1H, m, H-6′b), 3.38～3.23 (4H, m, H-2′～5′), 2.54 (1H, d,= 17.5 Hz, H-2a), 2.02 (1H, d,= 17.5 Hz, H-2b), 2.01 (1H, t,= 5.2 Hz, H-6), 1.57～1.42 (4H, m, H-7, 8), 1.15 (3H, d,= 6.2 Hz, H-10), 1.10 (3H, s, H-11), 1.02 (3H, s, H-12)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 202.3 (C-3), 168.1 (C-5), 122.8 (C-4), 104.4 (C-1′), 78.1 (C-3′, 5′), 75.1 (C-2′), 71.5 (C-13), 71.6 (C-4′), 68.5 (C-9), 62.7 (C-6′), 48.6 (C-2), 47.8 (C-6), 39.5 (C-8), 37.4 (C-1), 28.8 (C-12), 27.6 (C-11), 27.5 (C-7), 23.5 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物8為euodionoside G。

化合物9：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 411.199 1 [M＋Na]+，分子式為C19H32O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.04 (1H, brs, H-4), 4.30 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′), 4.26 (1H, m, H-13a), 4.15 (1H, dd,= 17.8, 1.7 Hz, H-13b), 3.84 (1H, dd,= 11.8, 1.5 Hz, H-6′a), 3.78 (1H, dd,= 11.6, 6.2 Hz, H-9), 3.64 (1H, dd,= 11.8, 5.2 Hz, H-6′b), 3.36～3.24 (3H, m, H-3′～5′), 3.14 (1H, dd,= 8.8, 7.8 Hz, H-2′), 2.58 (1H, d,= 17.6 Hz, H-2a), 2.00 (1H, d,= 17.6 Hz, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6), 1.66～1.41 (4H, m, H-7, 8), 1.23 (3H, d,= 6.2 Hz, H-10), 1.11 (3H, s, H-12), 1.01 (3H, s, H-11)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 202.5 (C-3), 172.6 (C-5), 121.4 (C-4), 104.2 (C-1′), 78.3 (C-3′), 77.8 (C-9, 5′), 75.3 (C-2′), 71.6 (C-4′), 65.1 (C-13), 62.8 (C-6′), 48.6 (C-2), 48.0 (C-6), 37.4 (C-1, 8), 28.8 (C-12), 27.7 (C-11), 27.2 (C-7), 22.0 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物9為euodionoside F。

化合物10：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 501.157 2 [M＋Na]+，分子式為C20H30O13。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.42 (2H, s, H-2, 6), 4.96 (1H, d,= 2.6 Hz, H-1′′), 4.80 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1′), 4.04 (1H, dd,= 14.0, 5.2 Hz, H-6′), 3.93 (1H, d,= 9.6 Hz, H-4′′a), 3.87 (1H, d,= 2.6 Hz, H-2′′), 3.76 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.73 (1H, d,= 9.6 Hz, H-4′′b), 3.66 (3H, s, 4-OCH3), 3.53 (2H, s, H-5′′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 155.9 (C-4), 154.7 (C-3, 5), 134.5 (C-1), 110.8 (C-1′′), 103.1 (C-1′), 96.2 (C-2, 6), 80.5 (C-3′′), 77.9 (C-2′′), 77.8 (C-3′), 77.0 (C-5′), 74.9 (C-4′′), 74.8 (C-2′), 71.6 (C-4′), 68.8 (C-6′), 65.3 (C-5′′), 61.2 (4-OCH3), 56.6 (3, 5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[24-25]，故鑒定化合物10為3,4,5-三甲氧苯基- 1--β--呋喃芹糖-(1′′→6′)-β--吡喃葡萄糖苷。

化合物11：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 439.156 9 [M＋Na]+，分子式為C19H28O10。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.25 (4H, d,= 4.4 Hz, H-2, 3, 5, 6), 7.17 (1H, m, H-4), 5.00 (1H, d,= 2.5 Hz, H-1′′), 4.28 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′), 4.04 (1H, m, H-8), 3.97 (1H, dd,= 11.2, 1.6 Hz, H-6′), 3.95 (1H, d,= 9.6 Hz, H-4′′), 3.89 (1H, d,= 2.5 Hz, H-2′′), 3.76～3.72 (2H, m, H-8, 4′′), 3.59 (1H, dd,= 10.7, 5.7 Hz, H-6′), 3.55 (2H, s, H-5′′), 3.39 (1H, m, H-5′), 3.34 (1H, m, H-3′), 3.27 (1H, d,= 9.4 Hz, H-4′), 3.17 (1H, dd,= 9.0, 7.8 Hz, H-2′), 2.93 (2H, m, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 140.0 (C-1), 130.0 (C-3, 5), 129.4 (C-2, 6), 127.2 (C-4), 111.0 (C-1′′), 104.4 (C-1′), 80.5 (C-3′′), 78.0 (C-3′, 2′′), 76.9 (C-5′), 75.0 (C-2′, 4′′), 71.8 (C-8), 71.7 (C-4′), 68.7 (C-6′), 65.5 (C-5′′), 37.3 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[26]，故鑒定化合物11為淫羊藿次苷D1。

化合物12：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 425.142 1 [M＋Na]+，分子式為C18H26O10。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.43 (2H, d,= 7.2 Hz, H-2, 6), 7.33 (2H, m, H-3, 5), 7.27 (H, m, H-4), 5.05 (1H, d,= 2.5 Hz, H-1′′), 4.90 (1H, d,= 11.8 Hz, H-7a), 4.66 (1H, d,= 11.8 Hz, H-7b), 4.33 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 3.98～4.03 (2H, m, H-4′′, 6′a), 3.94 (1H, d,= 2.5 Hz, H-2′′), 3.78 (1H, d,= 9.6 Hz, H-4′′), 3.63 (1H, dd,= 11.2, 6.3 Hz, H-6′b), 3.60 (2H, s, H-5′′), 3.22～3.42 (4H, m, H-2′～5′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 139.0 (C-1), 129.3 (C-2, 6), 129.3 (C-3, 5), 128.7 (C-4), 111.0 (C-1′′), 103.2 (C-1′), 80.6 (C-3′′), 78.0 (C-3′, 2′′), 77.0 (C-5′), 75.1 (C-4′′), 75.0 (C-2′), 71.8 (C-7, 4′), 68.7 (C-6′), 65.6 (C-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[26]，故鑒定化合物12為淫羊藿次苷F2。

化合物13：淡黃色粉末（甲醇），ESI-MS/: 605.220 4 [M＋Na]+，分子式為C28H38O13。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.58 (1H, s, H-8), 6.43 (2H, s, H-2′, 6′), 4.42 (1H, d,= 6.2 Hz, H-4), 4.29 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′′), 3.89 (1H, dd,= 9.7, 5.5 Hz, H-3α), 3.85 (3H, s, 7-OMe), 3.83 (1H, m, H-6a′′), 3.74 (6H, s, 3′, 5′-OMe), 3.67 (1H, m, H-6b′′), 3.64 (1H, m, H-2α), 3.55 (1H, dd,= 10.9, 6.7 Hz, H-2β), 3.46 (1H, dd,= 9.7, 3.8 Hz, H-3β), 3.38 (1H, m, H-3′′), 3.35 (3H, s, 5-OMe), 3.30 (1H, m, H-4′′), 3.27 (1H, m, H-5′′), 3.25 (1H, m, H-2′′), 2.72 (1H, dd,= 15.0, 4.7 Hz, H-1a), 2.62 (1H, dd,= 15.0, 11.6 Hz, H-1b), 2.08 (1H, m, H-3), 1.71 (1H, m, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 148.9 (C-3′, 5′), 148.6 (C-7), 147.5 (C-5), 139.3 (C-1′), 138.9 (C-6), 134.4 (C-4′), 130.2 (C-9), 126.4 (C-10), 107.8 (C-8), 106.8 (C-2′, 6′), 104.8 (C-1′′), 77.9 (C-5′′), 78.2 (C-3′′), 75.1 (C-2′′), 71.6 (C-4′′), 71.4 (C-3a), 66.2 (C-2a), 62.8 (C-6′′), 60.2 (5-OMe), 56.8 (3′, 5′-OMe), 56.6 (7-OMe), 46.7 (C-3), 42.8 (C-4), 40.5 (C-2), 33.8 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[27]，故鑒定化合物13為(＋)-lyonirenisol-3a--β--glucopyranoside。

化合物14：無定形粉末（甲醇），ESI-MS/: 399.126 2 [M＋Na]+，分子式為C16H24O10。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.99 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 6.80 (1H, dd,= 8.0, 1.8 Hz, H-6), 6.75 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 4.66 (1H, d,= 7.1 Hz, H-7), 4.39 (1H, d,= 7.3 Hz, H-1′), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 3.82 (1H, dd,= 12.0, 2.0 Hz, H-6′a), 3.78 (1H, m, H-8), 3.63 (1H, dd,= 12.0, 5.3 Hz, H-6′b), 3.52 (1H, dd,= 12.0, 3.4 Hz, H-9a), 3.36 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-9b), 3.33～3.22 (4H, m, H-2′～5′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 149.0 (C-3), 147.4 (C-4), 133.4 (C-1), 120.8 (C-6), 116.0 (C-5), 111.5 (C-2), 105.3 (C-1′), 87.7 (C-8), 78.0 (C-5′), 77.8 (C-3′), 75.5 (C-2′), 75.0 (C-7), 71.4 (C-4′), 63.2 (C-9), 62.5 (C-6′), 56.3 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[28]，故鑒定化合物14為l--guaiacylglycerol-8--β-glucopyranoside。

化合物15：黃色粉末（三氯甲烷），ESI-MS/: 185.057 3 [M＋Na]+，分子式為C10H10O2。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 9.66 (1H, d,= 7.9 Hz, H-9), 7.82 (1H, d,= 16.1 Hz, H-7), 7.52 (1H, d,= 7.6 Hz, H-6), 7.39 (1H, t,= 7.9 Hz, H-4), 6.98 (1H, t,= 7.6 Hz, H-5), 6.93 (1H, d,= 8.4 Hz, H-3), 6.77 (1H, dd,= 16.1, 7.9 Hz, H-8), 3.89 (3H, s, 2-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 194.6 (C-9), 158.3 (C-2), 148.3 (C-7), 132.8 (C-4), 129.1 (C-8), 128.9 (C-6), 123.0 (C-1), 120.9 (C-5), 111.4 (C-3), 55.6 (2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[29]，故鑒定化合物15為鄰甲氧基肉桂醛。

化合物16：黃色油狀液體（三氯甲烷）。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 9.66 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1), 7.53～7.40 (6H, m, H-3, 5～9), 6.68 (1H, dd,= 16.0, 7.7 Hz, H-2)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 193.6 (C-1), 152.7 (C-3), 133.9 (C-4), 131.2 (C-7), 129.0 (C-6, 8), 128.3 (C-2, 5, 9)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[30-31]，且3種不同系統(tǒng)展開，Rf與對照品肉桂醛一致，故鑒定化合物16為肉桂醛。

化合物17：白色粉末（甲醇）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.76 (1H, d,= 16.0 Hz, H-3), 7.58 (2H, m, H-5, 9), 7.40 (3H, m, H-6～8), 6.48 (1H, dd,= 16.0, 1.3 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.4 (C-1), 146.3 (C-3), 135.8 (C-4), 131.4 (C-7), 130.0 (C-5, 9), 129.2 (C-6, 8), 119.3 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[32]，且3種不同系統(tǒng)展開，Rf與對照品肉桂酸一致，故鑒定化合物17為肉桂酸。

化合物18：黃色粉末（三氯甲烷），ESI-MS/: 201.051 4 [M＋Na]+，分子式為C10H10O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.64 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 7.40 (1H, d,= 15.8 Hz, H-3), 7.12 (1H, dd,= 8.2, 1.9 Hz, H-6′), 7.07 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′), 6.96 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.59 (1H, dd,= 15.8, 7.8 Hz, H-2), 3.94 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 193.8 (C-1), 153.3 (C-3), 149.1 (C-3′), 147.1 (C-4′), 126.8 (C-1′), 126.5 (C-2), 124.2 (C-6′), 115.1 (C-2′), 109.6 (C-5′), 56.1 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[33]，故鑒定化合物18為4-羥基-3-甲氧基肉桂醛。

化合物19：白色針狀結(jié)晶（三氯甲烷），ESI-MS/: 153.054 8 [M＋H]+，分子式為C8H8O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.17 (1H, dd,= 7.8, 1.7 Hz, H-6), 7.57 (1H, td,= 8.7, 1.7 Hz, H-4), 7.13 (1H, t,= 7.6 Hz, H-5), 7.06 (1H, d,= 8.4 Hz, H-3), 4.07 (3H, s, 2-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 165.7 (C=O), 158.2 (C-2), 135.2 (C-4), 133.9 (C-6), 122.3 (C-5), 111.8 (C-3), 117.7 (C-1), 56.8 (2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[34]，故鑒定化合物19為鄰甲氧基苯甲酸。

化合物21：無色針晶（甲醇）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.13 (2H, d,= 7.6 Hz, H-2, 6), 7.62 (1H, dd,= 7.6, 7.2 Hz, H-4), 7.48 (2H, dd,= 7.6, 7.2 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 172.4 (C-1′), 133.9 (C-4), 130.4 (C-2, 6), 129.6 (C-1), 128.6 (C-3, 5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[36]，且3種不同系統(tǒng)展開，Rf與對照品苯甲酸一致，故鑒定化合物21為苯甲酸。

4 活性篩選

4.1 抗腫瘤活性篩選

采用MTT比色法[37-38]評價化合物2～20對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的體外抑制活性。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板上，每孔5×103個，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后棄去上清液，加入含有溶劑DMSO或一定濃度藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h。隨后，在避光條件下，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）。培養(yǎng)4 h后，棄去上層清液，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min后測570 nm處吸光度（）。將溶劑對照組細(xì)胞存活能力定為100%，所有藥物處理組的轉(zhuǎn)化為細(xì)胞存活能力。細(xì)胞活力數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗總體均數(shù)是否存在顯著差異后，使用Turkey posthoc檢驗對各組均數(shù)進行配對比較。對于差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的化合物，使用Sigmoid曲線擬合化合物對MDA-MB-231細(xì)胞的IC50。

結(jié)果表明，化合物15可以有效降低MDA-MB-231細(xì)胞的存活能力，其IC50為（34.11±3.42）μmol/L，結(jié)果見圖1。其他化合物的IC50均大于50 μmol/L，對MDA-MB-231細(xì)胞的存活能力無影響。

圖1 化合物15對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

4.2 抗炎活性篩選

比較不同化合物抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO能力，對其抗炎活性進行評價[39-41]。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板上，每孔3×104個。細(xì)胞在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入含一定濃度藥物（濃度分別為6.25、12.5、25、50和100 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，0.1% DMSO作為溶劑對照。隨后每孔加入100 ng/mL的LPS溶液。細(xì)胞在含有LPS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，取上清液按照NO比色分析試劑盒（S0021S）說明書中規(guī)定的方法測定540 nm處的吸光度。細(xì)胞活力使用MTT法測定（與上述抗腫瘤活性篩選方法一致）。數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗總體均數(shù)是否存在顯著差異后，使用Turkey posthoc檢驗對各組均數(shù)進行配對比較。對于NO釋放率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的化合物，使用Sigmoid曲線擬合化合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的IC50。

細(xì)胞活力測試結(jié)果顯示不同化合物對RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力無顯著影響，同時化合物15、16、18、20可以顯著抑制NO釋放率，具有潛在的抗炎作用；其IC50分別為（5.27±0.62）、（7.98±2.41）、（7.91±0.81）、（70.34±3.07）μmol/L，結(jié)果見圖2。其他化合物的濃度為100 μmol/L時，無法抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO，即其他化合物IC50均大于100 μmol/L，抗炎作用較弱。

圖2 化合物15、16、18和20對NO釋放率的影響

5 討論

現(xiàn)有研究表明，桂枝具有良好的抗腫瘤[42]、抗炎[43]活性。源自《金匱要略》的桂枝茯苓方，臨床常用于治療子宮肌瘤[44]、卵巢囊腫[45]、痛經(jīng)[46]等婦科疾病。桂枝味辛性溫，辛而發(fā)散，行氣血，溫則溫經(jīng)散寒，宣通痹閉，作為解表藥的桂枝是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證復(fù)方中的高頻藥物[47]。本研究通過對桂枝非揮發(fā)性成分，特別是正丁醇部位化合物的分離，豐富了桂枝的物質(zhì)種類的認(rèn)識。研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)鄰甲氧基肉桂醛為桂枝的主要成分之一[48]，這一結(jié)果與文獻報道一致。然而，目前國內(nèi)外對桂枝的活性成分研究主要集中在肉桂醛、肉桂酸，缺乏對鄰甲氧基肉桂醛的深入研究。本研究在對分離得到的化合物進行體外抗炎抗腫瘤活性篩查后，發(fā)現(xiàn)鄰甲氧基肉桂醛在抗炎和抑制乳腺癌細(xì)胞增殖能力的活性均優(yōu)于肉桂醛，初步推測鄰甲氧基肉桂醛是桂枝發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分之一。在下一步的研究中，本課題組將進一步研究桂枝中肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛對多種腫瘤細(xì)胞（如人宮頸癌HeLa細(xì)胞、結(jié)腸癌Ht-29細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞等）的抑制活性，以期為桂枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立以及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 288.

[2] 夏天衛(wèi), 周國威, 姚晨, 等. 桂枝及肉桂治痹的中醫(yī)認(rèn)識與現(xiàn)代藥學(xué)研究進展 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2019, 25(6): 218-226.

[3] Liu J, Zhang Q, Li R L,. The traditional uses, phytochemistry, pharmacology and toxicology of: A review [J]., 2020, 72(3): 319-342.

[4] 徐鋒, 王德健, 王鳳, 等. 桂枝揮發(fā)油的藥理作用研究進展 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2016, 31(11): 4653-4657.

[5] Shin S H, Lee S R, Lee E,. Caffeic acid phenethyl ester from the twigs ofinhibits malignant cell transformation by inducing c-fos degradation [J]., 2017, 80(7): 2124-2130.

[6] Wang Y, Sun Y, Wang J,. Antifungal activity and action mechanism of the natural product cinnamic acid against[J]., 2019, 103(5): 944-950.

[7] Han Y, Jung H W, Bae H S,. The extract oftwigs inhibits adipocyte differentiation via activation of the insulin signaling pathway in 3T3-L1 preadipocytes [J]., 2013, 51(8): 961-967.

[8] Kang Y H, Shin H M.ethanol extract exerts vasorelaxation through inhibition of Ca influx and Ca release in rat aorta [J]., 2012, 2012: 513068.

[9] Niu B, Zheng F H, Xu J P. Protective effect of Gui Zhi () on abnormal levels of four amino acid neurotransmitters by chronically Ma Huang () intoxicated prefrontal cortex in rats treated with a Ma Huang-Gui Zhi herb pair [J]., 2020, 249: 112408.

[10] Yao Y, Huang H Y, Yang Y X,. Cinnamic aldehyde treatment alleviates chronic unexpected stress-induced depressive-like behaviors via targeting cyclooxygenase-2 in mid-aged rats [J]., 2015, 162: 97-103.

[11] Zhou J, Yuan X, Li L,. Comparison of different methods for extraction of: Yield, chemical composition andantiviral activities [J]., 2017, 31(24): 2909-2913.

[12] Sang H L. Clinical and experimental research into treatment of hysteromyoma with promotingflow and blood circulation, softening and resolving hard lump [J]., 2004, 24(4): 274-279.

[13] 楊娟, 徐伏蘭, 王軍. 桂枝茯苓膠囊對子宮肌瘤的作用研究 [J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2020, 12(1): 144-146.

[14] 胡江苗, 陳紀(jì)軍, 趙友興, 等. 山竺果殼的化學(xué)成分 [J]. 云南植物研究, 2006, 28(3): 319-322.

[15] Greca M D, Ferrara M, Fiorentino A,. Antialgal compounds from[J]., 1998, 49(5): 1299-1304.

[16] 劉召陽, 羅都強. 金蓮花的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2010, 41(3): 370-373.

[17] Saracoglu I, Varel M, Harput U S,. Acylated flavonoids and phenol glycosides fromsubsp.[J]., 2004, 65(16): 2379-2385.

[18] Yu Q, Matsunami K, Otsuka H,. Staphylionosides A-K: Megastigmane glucosides from the leaves ofDC [J].:, 2005, 53(7): 800-807.

[19] Otsuka H, Kijima H, Hirata E,. Glochidionionosides A-D: Megastigmane glucosides from leaves of(Gaertn.) A. Juss [J]., 2003, 51(3): 286-290.

[20] 陳亞軍, 王知斌, 于瑩, 等. 八仙花葉中紫羅蘭酮類化合物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2017, 34(4): 14-17.

[21] 溫晶, 史海明, 昝珂, 等. 劉寄奴的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2010, 41(6): 870-873.

[22] Otsuka H, Takeda Y, Yamasaki K,. Structural elucidation of dendranthemosides A and B: Two new beta-ionone glucosides from[J]., 1992, 58(4): 373-375.

[23] Yamamoto M, Akita T, Koyama Y,. Euodionosides A-G: Megastigmane glucosides from leaves ofmeliaefolia [J]., 2008, 69(7): 1586-1596.

[24] 杜冰曌, 張和新歌, 楊鑫瑤, 等. 崗梅莖的化學(xué)成分研究 [J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(21): 4154-4158.

[25] Kanchanapoom T, Kasai R, Yamasaki K. Iridoid and phenolic glycosides from[J]., 2002, 59(5): 551-556.

[26] Anh N H, Ripperger H, Porzel A,. Neolignans from[J]., 1997, 46(3): 569-571.

[27] Balázs B, Tóth G, Duddeck H,. Iridoid and lignan glycosides fromL [J]., 2006, 20(2): 201-205.

[28] 瞿璐, 李曉霞, 陳玥, 等. 雞血藤中的酚酸類化合物 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2014, 22(3): 301-306.

[29] Huong D, Jo Y S, Lee M K,. Monoamine oxidase inhibitors from[J]., 2000, 6(1): 16-19.

[30] Bharathi P, Periasamy M. Metalation of iminium ions formed in the reaction of tertiary amines with TiCl4[J]., 1999, 1(6): 857-859.

[31] Liu Y Y, Wang B L. 2-iodoxybenzenesulfonic acid-catalysed oxidation of primary and secondary alcohols with oxone in cetyl trimethylammonium bromide micelles at room temperature [J]., 2014, 38(7): 427-431.

[32] 梁文娟, 郗建宇, 尹迪, 等. 美麗芍藥中酚酸類成分的研究 [J]. 中成藥, 2020, 42(6): 1512-1515.

[33] Kwon H C, Lee K R. Phytochemical constituents ofssp.[J]., 2001, 24(3): 194-197.

[34] 薛曉霞, 仲浩, 姚慶強. 一枝黃花化學(xué)成分的研究 [J]. 中草藥, 2008, 39(2): 182-184.

[35] Ku Y L, Chen C H, Lee S S. Chemical constituents fromII [J]., 2006, 20(13): 1199-1206.

[36] 王興娜, 杜建廠, 譚仁祥, 等. 擔(dān)子菌黃卷緣齒菌的化學(xué)成分 [J]. 中草藥, 2005, 36(8): 1126-1130.

[37] Chen J L, Tang C L, Zhou Y,. Anti-inflammatory property of the essential oil from(Linn.) Presl leaves and the evaluation of its underlying mechanism by using metabolomics analysis [J]., 2020, 25(20): 4796.

[38] Kumar P, Nagarajan A, Uchil P D. Analysis of cell viability by the MTT assay [J]., 2018, doi: 10.1101/pdb.prot095505.

[39] Bai B, Ye S X, Yang D P,. Chloraserrtone A, a sesquiterpenoid dimer from[J]., 2019, 82(2): 407-411.

[40] Dirsch V M, Stuppner H, Vollmar A M. The Griess assay: Suitable for a bio-guided fractionation of anti-inflammatory plant extracts? [J]., 1998, 64(5): 423-426.

[41] Schmidt H H, Warner T D, Nakane M,. Regulation and subcellular location of nitrogen oxide synthases in RAW264.7 macrophages [J]., 1992, 41(4): 615-624.

[42] Park G H, Song H M, Park S B,. Cytotoxic activity of the twigs ofthrough the suppression of cell proliferation and the induction of apoptosis in human colorectal cancer cells [J]., 2018, 18(1): 28.

[43] Mateen S, Shahzad S, Ahmad S,. Cinnamaldehyde and eugenol attenuates collagen induced arthritis via reduction of free radicals and pro-inflammatory cytokines [J]., 2019, 53: 70-78.

[44] 姚祺, 郭輝, 陳玲玲, 等. 桂枝茯苓丸抗大鼠子宮肌瘤作用機制研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2020, 15(24): 3761-3766.

[45] 張萌. 自擬加味桂枝茯苓湯治療血瘀型卵巢囊腫的臨床觀察 [D]. 哈爾濱: 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[46] 姜珊珊. 桂枝茯苓丸加減治療氣滯血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥所致痛經(jīng)的臨床觀察 [D]. 哈爾濱: 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[47] 柳春, 梁永林, 姚柳伊. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證用藥規(guī)律研究 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 33(9): 1269-1272.

[48] Wu X, He J, Xu H,. Quality assessment ofby the simultaneous analysis of multiple active components using high-performance thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography [J]., 2014, 37(18): 2490-2498.

Study on chemical constituents, antitumor and anti-inflammatory activities of

QIAN Chun-guo1, 2, JIN Lu1, 2, ZHU Long-ping1, 2, ZHOU Yang1, 2, LI Run-nan3, YANG De-po1, 2, XU Xin-jun1, 2, ZHAO Zhi-min1, 2

1. School of Pharmaceutical Science, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China 2. Guangdong Technology Research Center for Advanced Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 3. Deqing County Dexin Agricultural Development Co., Ltd., Zhaoqing 526600, China

To investigate the chemical constituents, antitumor and anti-inflammatory activities of extracts from the non-volatile component of Guizhi ().The compounds were isolated and purified by various chromatographic techniques, including D101, silica gel, Sephadex LH-20 and semi-preparative HPLC, and their structures were identified based on combining spectral analysis with chemical evidence. Their potential anti-tumor and anti-inflammatory effects were evaluated on human breast cell line (MDA-MB-231) and murine macrophage cell line (Raw264.7), respectively.A total of 21 compounds were isolated from the methanol extract ofand identified as epicatechin (1), 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β--glucopyranoside (2), 3,5-dihydroxyphenethyl alcohol 3--β-glucopyranoside (3), staphylionoside D (4), glochidionionoside C (5), citroside A (6), dendranthemoside A (7), euodionoside G (8), euodionoside F (9), 3,4,5-trimethoxyphenyl-1--β--apiofuranosyl-(1′′→6′)glucopyranoside (10), icariside D1 (11), icariside F2 (12), (+)-lyonirenisol-3a--β--glucopyranoside (13), l--guaiacylglycerol-8--β-glucopyranoside (14),-methoxy cinnamaldehyde (15), cinnamaldehyde (16), cinnamic acid (17), 4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (18),-anisic acid (19), (2,3)-5,7- dimethoxy-3′,4′-methylenedioxyflavan-3-ol (20), and benzoic acid (21). Compounds 1 and 20 were flavonoids, 2—3 and 10—12 were aromatic glycosides, 4—9 were norsesquiterpenoid glycosides, 13—14 were phenylpropanoid glycosides, 15—18 were phenylpropanoids, and 19 and 21 were phenolic acids. Anti-inflammatory and anti-tumor assaysshowed that compound 15 effectively reduced the viability of MDA-MB-231 cells with IC50of (34.11 ± 3.42) μmol/L. Compounds 15—16, 18 and 20 inhibited releases of NO induced by LPS from RAW 264.7 cells with IC50of (5.27 ± 0.62), (7.98 ± 2.41), (7.91 ± 0.81), and (70.34 ± 3.07) μmol/L respectively.Compounds 2—10, 12, and 14 are isolated from this plant for the first time. In addition, compounds 3, 5—9, and 14 are found in the Lauraceae for the first time, while compound 4 is isolated fromfor the first time. Compound 15 can inhibit the proliferation of human breast cancer cells MDA-MB-231. Compounds 15—16, 18, and 20 can significantly inhibit LPS-induced NO release from RAW264.7, indicating their potential anti-inflammatory effects. The study on the chemical composition, as well as the activity ofmay shed new light on its material basis, quality standard establishment and clinical application.

; cinnamaldehyde;-methoxy cinnamaldehyde; cinnamic acid; antitumor; anti-inflammatory activities

R284.1

A

0253 - 2670(2022)01 - 0031 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.006

2021-10-09

廣東省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新及推廣體系建設(shè)項目（2021KJ268，2021KJ142，2020KJ142）；廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃（2020B020221002，2020B1111110003）

錢純果（1997—），女，在讀碩士研究生，研究方向為生藥與天然藥物化學(xué)。Tel: 15603057062 E-mail: qianchg@mail2.sysu.edu.cn

趙志敏，副教授，研究研究生導(dǎo)師，主要從事中草藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制研究。Tel: (020)39943043 E-mail: zhaozhm2@mail.sysu.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]