李文仿 龍彬彬 姚方輝 趙宗彬 張華

近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，已位居女性惡性腫瘤的首位［1］。闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制對提高其診治水平具有一定意義［2］。N6—甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾RNA是近期腫瘤進展研究的熱點。m6A修飾是真核生物mRNA常見的甲基化修飾，參與真核生物mRNA的運輸、剪切、翻譯等過程［3-4］。m6A修飾通過甲基化酶、去甲基化酶及甲基化識別酶等調(diào)控mRNA甲基化，參與膀胱癌、胃癌等惡性腫瘤進展［5-6］。去甲基化酶AlkB同源蛋白5（AlkB homologue 5，ALKBH5）與甲基化轉(zhuǎn)移酶14（METTL14）、Wilms瘤相關(guān)蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）形成mRNA甲基化修飾復(fù)合體，是mRNA的m6A甲基化修飾主要調(diào)控單位，通過調(diào)控腫瘤基因表達，在惡性腫瘤進展中發(fā)揮作用［7］。本研究主要探討乳腺癌組織中ALKBH5的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年5月至2018年9月在本院進行乳腺癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本90例，乳腺增生組織石蠟標(biāo)本20例，以及相應(yīng)乳腺癌患者的臨床資料、免疫組化指標(biāo)、病理檢查結(jié)果等。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染試劑Lipofection2000，購自Invitrogen。ALKBH5 siRNA序列由上海生工合成，序列為siRNA1：5′-GCAGC AAGGCAGTCT TTA AGT-3′，無 效 干擾RNA沒有相應(yīng)的mRNA作用靶點（siRNA NC），序列為5′-UUCUCCGAACGUG UCACGU-3′。ALKBH5的siRNA按照轉(zhuǎn)染Lipofection2000說明，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231。

1.3 RNA提取 收集細(xì)胞并裂解，每6 cm培養(yǎng)板的細(xì)胞中加入1 mL Trizol溶液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無RNA酶離心管中。抽提：加入1/5體積的三氯甲烷，劇烈震蕩1 min，充分混合后，室溫靜置 3 min；37 ℃，12 000 r/min離心10 min；將上層RNA層轉(zhuǎn)移至新的無RNA 酶離心管。沉淀：加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，可在底部觀察到沉淀的RNA，棄上清保留沉淀。洗滌：輕輕加入1 mL現(xiàn)用現(xiàn)配的75%乙醇，上下顛倒洗滌沉淀及管壁；4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清保留沉淀，室溫干燥。溶解：加入適量的DEPC處理水，溶解RNA；測量RNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗所提RNA。

1.4 RT-PCR Prime 5.0軟件設(shè)計并經(jīng)過Blast檢測，引物序列如下：GAPDH：5′-ACCCAGAAGACTGTGGGGATGG-3′，5′-TCTAGAC GGCAGGTCAGGTC-3′；ALKBH5的 引物 序 列 為：5′-CGGCGAAGG CTACACACT TACG-3′，5′-CCACCAGCTTTTGGATCACCA - 3′。qRT-PCR：取1μg的RNA模板，設(shè)置RT反應(yīng)程序為42 ℃、60 min，70 ℃、10 min。Q-PCR反應(yīng)以Bio-Rad CFX96儀進行擴增，條件如下：預(yù)變性采用95 ℃條件下作用30 s，循環(huán)1次；循環(huán)擴增次數(shù)為38次，95 ℃下作用10 s，60 ℃作用20 s，最后70 ℃延伸10 s。

1.5 MTT實驗 10%血清培養(yǎng)細(xì)胞，以每孔1000個細(xì)胞接種96孔板，每孔體積200 μL，培養(yǎng)3天，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL，用PBS配置，PH值為7.4）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液上清。每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光值，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.6 免疫組化法 取4μL厚石蠟切片二甲苯脫蠟，加熱枸櫞酸鈉溶液抗原修復(fù)液至98 ℃，持續(xù)15 min修復(fù)抗原，內(nèi)源性抗原封閉采用山羊血清工作液15 min。兔抗人ALKBH5單克隆抗體（1：100）4 ℃過夜，生物素化二抗37 ℃孵育20 min，加入顯色溶液顯色［8］。蘇木素復(fù)染1 min，60 ℃烤片3 h，脫水，透明，中性樹膠封片。染色結(jié)果采用半定量方法評估染色結(jié)果，“-”代表無染色，“+”代表＜25%染色，“++”代表25%～50%細(xì)胞染色，“+++”代表＞50%細(xì)胞染色?！?、+”代表陰性，“++、+++”代表陽性。

1.7 Western Blot法 采用RIPA裂解緩沖液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1%脫氧膽酸鈉，1%Triton X-100，0.1%SDS；上海碧云天生物技術(shù)有限公司）裂解細(xì)胞。全蛋白以每孔50μg上樣進行SDS-PAGE電泳。采用PBS稀釋相應(yīng)一抗至1：1000濃度，于37 ℃搖床上孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育300 min。通過ECL試劑在用化學(xué)圖像發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白表達。

1.8 細(xì)胞克隆實驗 MDA-MB231細(xì)胞常規(guī)消化并計數(shù)，將細(xì)胞以500個/孔接種于6孔板中，輕輕晃動培養(yǎng)板使細(xì)胞分散均勻，37 ℃細(xì)胞孵箱培養(yǎng)。每4～5天換液1次，培養(yǎng)10天。吸凈培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液2 mL染色20 min。PBS清洗3次以上，自然風(fēng)干。以＞50個細(xì)胞計為1個克隆，克隆形成率=（陽性克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，計算每組細(xì)胞的克隆形成率。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALKBH5在乳腺癌組織中表達 采用SP免疫組化法檢測ALKBH5在乳腺癌及乳腺增生組織中表達，ALKBH5主要定位于細(xì)胞核，胞漿及細(xì)胞膜均無ALKBH5表達，見圖1。乳腺癌組織中ALKBH5表達的陽性率為57.8%（52/90），乳腺增生組織中ALKBH5表達的陽性率為25.0%（5/20），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.042，P=0.008）。

圖1 ALKBH5在乳腺癌/增生組織中的表達（免疫組化×400）

2.2 乳腺癌中ALKBH5表達與臨床病理特征分析 ALKBH5表達與乳腺癌患者的年齡、性別、組織學(xué)分級、激素受體及腫瘤分期情況均無關(guān)（P＞0.05）。ALKBH5高表達與乳腺癌患者的腫瘤大小（P=0.024）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.028）密切相關(guān)。見表1。

表1 乳腺癌組織中的ALKBH5表達與臨床病理特征分析［n（%）］

2.3 基因敲除ALKBH5抑制乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞增殖 將 si-ALKBH5分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB231細(xì)胞后，Q-PCR及Western Blot提示siRNA-ALKBH5明顯抑制乳腺癌中ALKBH5的mRNA及蛋白表達（P＜0.05）。應(yīng)用MTT觀察細(xì)胞增殖情況，顯示ALKBH5-siRNA轉(zhuǎn)染組MDA-MB231細(xì)胞增殖在24 h、48 h及72 h明顯受到抑制而克隆形成實驗提示，ALKBH5-siRNA轉(zhuǎn)染組MDA-MB231細(xì)胞克隆明顯受到抑制。見圖2。

圖2 敲除ALKBH5抑制乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞增殖

3 討論

m6A是一種信使RNA的甲基化修飾，是一個動態(tài)可逆的修飾過程，由特異性的甲基化酶和去甲基化酶共同協(xié)調(diào)［9］。m6A修飾的核心甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體包括METTL3、METTL14和WTAP，另外一類酶是去甲基化轉(zhuǎn)移酶，主要功能是清除mRNA上的甲基化修飾，包括FTO、ALKBH5等［6，10］。m6A在惡性腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中所起的調(diào)控作用已引起重視。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾參與胃癌、淋巴瘤等多種腫瘤進展［11-12］，ALKBH5參與骨肉瘤等多種惡性腫瘤進展［4，13］，但ALKBH5在胰腺癌中卻發(fā)揮抑癌作用，說明ALKBH5在不同癌組織中作用機制不同［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中ALKBH5表達增高，與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的大小有關(guān)，提示乳腺癌中ALKBH5有重要的生物學(xué)意義。

ALKBH5調(diào)控腫瘤進展的機制與促進靶基因mRNA去甲基化修飾有關(guān)，在胰腺癌中高表達與預(yù)后較差有關(guān)［15］。ALKBH5通過去甲基化修飾FOXM1的mRNA，可明顯促進FOXM1表達，促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性［16］。缺氧乳腺癌細(xì)胞干性HIF-1表達，可促進ALKBH5表達，進而影響通過mRNA去甲基化，促進多能性基因NANOG的表達，參與乳腺癌干性進展［17］。ALKBH5在卵巢癌中發(fā)揮抑制自噬作用，敲除ALKBH5抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機制與ALKBH5激活EGFR-PIK3CA-AKT -mTOR信號通路，并可穩(wěn)定BCL2的mRNA及促進BCL2與Beclin1結(jié)合［18］。ALKBH家族也通過調(diào)控tRNA的去甲基化修飾，ALKBH3也可促進惡性腫瘤進展［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中ALKBH5表達增高，表明ALKBH5也可能通過調(diào)控相關(guān)靶基因表達，影響乳腺癌惡性進展。通過進一步敲低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231中ALKBH5，發(fā)現(xiàn)能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示ALKBH5可能是乳腺癌中發(fā)揮增殖促進作用，但具體機制需要進一步闡明。

綜上所述，ALKBH5在乳腺癌組織中異常高表達，與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑較大有關(guān)。乳腺癌中ALKBH5可能是一個新的重要的治療靶點。