孫國棟，孟黃洋，姜旖，袁琳，周樹林，程文俊

210029 南京，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦科

卵巢癌約占全球女性死亡的4%，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]。絕大多數(shù)卵巢惡性腫瘤是上皮性卵巢癌，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是FIGO III/IV期,晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%。目前，晚期上皮性卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是最大程度的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療。盡管大多數(shù)卵巢癌患者可以從鉑類為基礎(chǔ)的一線化療中受益，但約80%的患者將在1～2年內(nèi)復(fù)發(fā)，逐漸發(fā)展為鉑耐藥性卵巢癌[2]。因此，延長無進(jìn)展生存期從而提高5年生存率是一個亟待解決的問題。

BRCA基因為重要的DNA同源修復(fù)基因，其突變會導(dǎo)致同源重組缺陷，從而損害基因穩(wěn)定性并導(dǎo)致癌變。已有大量報道提示BRCA1/2突變的患者對化療的反應(yīng)更好[3]。PARP抑制劑為BRCA突變患者的靶向藥物，在一線及二線維持治療方面已取得了顯著的成效?？梢哉f，卵巢癌的治療已經(jīng)進(jìn)入了PARP抑制劑維持治療的新時代。而我國的卵巢癌BRCA基因檢測尚在起步階段，缺乏更大規(guī)模的多中心臨床研究。在這里，我們使用二代測序技術(shù)研究了本中心的卵巢癌患者胚系BRCA1/2突變特征，進(jìn)一步闡明其與臨床病理特征的關(guān)系，初步探索其對預(yù)后的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究回顧性分析了2015年1月至2020年1月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科接受治療，經(jīng)初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)或新輔助化療后行間歇性腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，病理確診的上皮性卵巢癌患者。化療方案均為紫杉醇+鉑類的TP方案。收集這些患者的高通量二代測序技術(shù)的胚系BRCA1/2基因檢測結(jié)果及臨床病理學(xué)資料。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 BRCA1/2基因檢測方法

采集患者的血樣送往基因檢測公司或我院病理科進(jìn)行檢測。應(yīng)用NGS技術(shù)檢測所有編碼外顯子及其鄰近±20 bp內(nèi)含子區(qū)的BRCA1和BRCA2突變。使用特定的基因引物從原始樣本開始使用Sanger DNA測序來確認(rèn)所有報道的變異。對突變的分類采用公認(rèn)的5類分類：已知致病突變、疑似致病突變、意義未明突變、疑似良性變異、良性多態(tài)性變異。數(shù)據(jù)解讀規(guī)則和致病報道參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相關(guān)指南、乳腺癌信息核心數(shù)據(jù)庫(https://research.nhgri.nih.gov/bic/)、萊頓開放變異數(shù)據(jù)庫(http://www.lovd.nl/)、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)等數(shù)據(jù)庫[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。采用卡方檢驗或確切概率法分析基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系。使用單因素及多因素COX回歸分析各臨床因素影響卵巢癌無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)的差異，COX模型的PH假定均已驗證。使用R軟件中的Survival包做出Kaplan-Meier曲線描繪變量對于卵巢癌PFS的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 隨訪情況

隨訪由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2名隨訪專員每年按時進(jìn)行，隨訪方式包括：門診、電話、微信、QQ、短信、信件等方式。隨訪時間為術(shù)后至患者死亡或60個月。隨訪過程中僅出現(xiàn)CA125升高而未出現(xiàn)影像學(xué)病灶，判定為生化復(fù)發(fā)；出現(xiàn)影像學(xué)病灶，判定為影像學(xué)復(fù)發(fā)。PFS為末次化療結(jié)束至影像學(xué)復(fù)發(fā)時間。結(jié)束鉑類藥物末次化療后12個月以上復(fù)發(fā)判定為鉑完全敏感復(fù)發(fā)，6～12個月判定為鉑部分敏感，6個月以內(nèi)判定為鉑耐藥，從初始治療開始就未達(dá)到疾病緩解的患者判定為鉑難治。隨訪情況由專人登記。

2 結(jié) 果

2.1 患者的突變分析

共納入82例上皮性卵巢癌患者，共發(fā)現(xiàn)BRCA1致病性突變17例，突變率為20.73%，BRCA2致病性突變8例，突變率為9.75%，總突變率為30.48%。共檢測到BRCA1致病突變位點(diǎn)13個，其中c.2160delA、c.3770_3771delAG、c.5470_5477delATTGGGCA、c.3255_3259del(p.Leu1086fs)、c.3294del(p.pro1099fs)、c.4782del(p.Ser1595fs)、c.587dupA(p.Tyr196fs)、c.4065_4068delTCAA、c.4132delG這9個位點(diǎn)為移碼突變，其次c.3967C>G、c.1115G>A、c.4801A>T、C.6528C>G為錯義突變。BRCA2共檢測到7個致病突變，c.1495C>T、c.6528C>G、c.2041G>A、c.4593dupA為錯義突變,c.1499del(p.Gly500fs)、c.3770_3771dell(p.Glu1257fs)、c.6405_6409delCTTAA為移碼突變。其中c.4132delG位點(diǎn)、C.6528C>G位點(diǎn)臨床意義未明，無文獻(xiàn)報道，可能具有潛在的研究價值(表1)。

表1 25例胚系基因BRCA1/2突變位點(diǎn)及突變類型

2.2 患者的突變狀態(tài)與臨床病理分析

82例均為上皮性卵巢癌患者，其中I～I(xiàn)I期12(14.6%)例，III～I(xiàn)V期70(86.4%)例；病理類型因素中，74例漿液性癌(90.2%)，8例非漿液性癌(9.8%)，具體為:5例透明細(xì)胞癌、3例子宮內(nèi)膜樣癌；行新輔助化療患者42例，均為IIIC期及IV期患者。通過后期隨訪發(fā)現(xiàn)，82例患者中，31例(37.8%)為鉑完全敏感，32例(39%)為部分敏感；16例(19.6%)患者為鉑耐藥，3例(3.6%)患者為鉑難治；經(jīng)影像學(xué)或術(shù)后病理確診，34例(41.5%)患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；49例(59.8%)患者有大網(wǎng)膜餅轉(zhuǎn)移；31例(37.8%)患者有膈頂轉(zhuǎn)移；21例(25.6%)患者存在結(jié)直腸侵犯；術(shù)前CA125值>500U/mL者51(62.2%)例。BRCA野生型組與突變組患者發(fā)病年齡、月經(jīng)狀態(tài)、臨床分期、組織分化等臨床因素比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BRCA1/2基因致病突變狀態(tài)與病理類型、是否鉑敏感、是否新輔助化療相關(guān)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 BRCA基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 患者的突變狀態(tài)與預(yù)后分析

在對PFS相關(guān)的單因素Cox回歸分析中，只有BRCA1/2突變狀態(tài)(P=0.030;HR=0.43;95%CI:0.20～0.94)、大網(wǎng)膜餅(P=0.021;HR=2.27;95%CI:1.13～4.54)、侵犯結(jié)直腸(P=0.001;HR=2.87;95%CI:1.51～5.48)、是否鉑敏感(P<0.001;HR=0.02;95%CI:0.01～0.06)、是否新輔助化療(P=0.015;HR=2.24;95%CI:1.17～4.31)是有意義的預(yù)后因素(表3)。相應(yīng)的生存曲線圖如圖1所示。BRCA突變組中位PFS為18.6個月，無突變組為12.8個月(P=0.030)。隨后將這5個因素納入多因素COX回歸分析中顯示，鉑敏感(P<0.001;HR=0.02;95%CI:0.01～0.07)和是否存在結(jié)直腸侵犯(P=0.005;HR=2.81;95%CI:1.39～5.69)為卵巢癌PFS的獨(dú)立預(yù)后因素。然而，BRCA突變狀態(tài)并非是卵巢癌PFS的獨(dú)立預(yù)后因素(表4)。

表3 82例卵巢癌臨床病理與PFS的單因素COX回歸分析

表4 82例卵巢癌臨床病理與PFS的多因素COX回歸分析

圖1 卵巢癌臨床病理特征與PFS的關(guān)系

3 討 論

近年來，許多研究揭示了BRCA1/2在DNA損傷修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮的重要作用。BRCA1/2突變在具有潛在同源重組缺陷的細(xì)胞中可誘導(dǎo)合成致死[5]。BRCA基因的單核苷酸多態(tài)性和突變是導(dǎo)致BRCA基因結(jié)構(gòu)和功能異常的主要原因[6]。目前臨床對攜帶BRCA1/2突變的卵巢癌患者，特別是晚期復(fù)發(fā)的卵巢癌患者往往采取個性化的治療措施[7]。除了手術(shù)和化療，臨床上更傾向于口服PARPi藥物作為一線的維持治療或復(fù)發(fā)后化療達(dá)到CR/PR的維持治療。雖然BRCA1/2突變的狀態(tài)對卵巢癌的臨床決策和預(yù)后很重要，但中國目前尚處在探索階段，需要更多多中心的臨床研究進(jìn)入臨床實(shí)踐。

本研究描述了本中心82例行基因檢測的上皮性卵巢癌患者BRCA突變狀態(tài)，與常見的臨床病理因素間的關(guān)系以及對預(yù)后的影響。在我們的研究中，總突變率為30.48%，其中BRCA1突變率為20.73%，BRCA2突變率為9.75%，與一項卵巢癌患者BRCA突變系統(tǒng)性分析的結(jié)果基本符合(BRCA1和BRCA2的基因突變率分別為1.1%～39.7%和0～13.9%[8]，總突變率略高于王登鳳等[9]報道的突變頻率，其中，BRCA1的突變頻率與吳小華教授報道的20.82%相仿[10]。BRCA1/2基因突變類型包括移碼突變、無義突變、錯義突變、同義突變及剪切突變5種類型，對蛋白質(zhì)的編碼起到重要作用[11]。本研究中BRCA1共檢測到9種移碼突變，4種錯義突變，BRCA2共檢測到3種移碼突變，4種錯義突變。移碼突變和錯義突變均會導(dǎo)致BRCA編碼的蛋白質(zhì)出現(xiàn)一級結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而引起相關(guān)編碼蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變或失活。根據(jù)目前的資料，這些變異會影響B(tài)RCA功能從而導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。而c.4132delG位點(diǎn)、C.6528C>G位點(diǎn)臨床意義未明，無文獻(xiàn)報道，有待在今后工作中進(jìn)一步加深研究。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)BRCA的致病突變組主要的病理類型為漿液性卵巢癌，且大多對鉑敏感，采取新輔助化療的比例更大(表2)。許多學(xué)者認(rèn)為BRCA突變相關(guān)的卵巢癌的病理類型大多都是高級別的漿液性卵巢癌。一項研究結(jié)果顯示在BRCA突變相關(guān)卵巢癌的患者中高級別漿液性癌的比例為60%～83%，而在BRCA1突變的患者中，這個比例更高[12-13]。這與我們的結(jié)果相一致。而BRCA突變的卵巢癌患者的鉑敏感性更是得到了廣泛的認(rèn)可,“合成致死”原理揭示了其內(nèi)在機(jī)制[14]。因此BRCA突變的卵巢癌患者對鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的一線化療方案具有更好的反應(yīng)性和生存獲益?；谏鲜龇治?，BRCA突變的卵巢癌大多為高級別漿液性癌，診斷時臨床期別通常較晚，手術(shù)難度更大，選擇新輔助化療后行間歇性腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)似乎成為了更為傾向的選擇。

目前大多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)為攜帶BRCA突變的卵巢癌患者預(yù)后更好，總生存時間和無進(jìn)展生存時間較長。Helpman等[15]發(fā)現(xiàn)，BRCA突變組的OC患者的無進(jìn)展生存期突變組(46.2個月)較無突變組(37.7個月)顯著延長,還有一些研究得出相似結(jié)論[16-17]。而Bu等[18]的研究則提出無進(jìn)展生存期突變組(14.31個月)較無突變組(13.62個月)無顯著延長(P>0.05)，但3年和5年生存率有顯著差異。在本研究中，BRCA突變組的中位PFS為18.6個月，較無突變組的12.8個月顯著延長。雖然多因素COX回歸分析顯示BRCA突變狀態(tài)并非卵巢癌患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素，但考慮到鉑敏感為卵巢癌患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素，且本研究的樣本量仍較小，因此我們?nèi)云诖诤罄m(xù)的研究中擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探究BRCA突變狀態(tài)是否可作為卵巢癌患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素。

這項研究有幾個局限性。首先由于該研究是基于本中心接受手術(shù)的卵巢癌基因檢測報告進(jìn)行的研究，檢測時間距離隨訪終點(diǎn)時間較近，存在明顯的幸存者偏倚，故本研究無法進(jìn)行總生存率OS的統(tǒng)計。在后續(xù)的研究中，我們在擴(kuò)大樣本量的過程中，可以增加總生存率的統(tǒng)計。其次，本研究的樣本量較小，仍需要擴(kuò)大樣本量以及進(jìn)行更多的臨床和基礎(chǔ)研究揭示其內(nèi)在機(jī)制。

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