樊 麗，張建東，劉德娟，徐吉榮，劉雪梅，孫明軍，孫翔翔，樊曉旭，田莉莉，邵衛(wèi)星，孫淑芳，劉蒙達

（1.泰安市動物疫病預(yù)防控制中心，山東泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271000；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；4.泰山護理職業(yè)學(xué)院，山東泰安 271000）

布魯氏菌?。╞rucellosis，簡稱布?。┦且环N流行范圍廣、危害嚴重的人獸共患病。目前有60多種動物可以作為布病儲存宿主。該病一年四季均可發(fā)生，流產(chǎn)為其典型發(fā)病癥狀[1]。該病曾在20世紀50 至70 年代在國內(nèi)大范圍流行，此后經(jīng)過嚴格控制，在80 年代保持了較低流行率[2]。然而，從90 年代開始該病發(fā)病率又明顯上升，現(xiàn)在已成為影響畜牧業(yè)和公共健康的重要危害之一[3]。目前我國大陸地區(qū)的所有省級地區(qū)都有布病病例報道[4]。

在布病流行嚴重的地區(qū)，往往采用疫苗免疫進行防控。目前主要使用A19、S2 和M5 等弱毒株活疫苗。其中A19 弱毒株疫苗被廣泛采用，其有效期長，使用6×109CFU 活菌的標準計量或稀釋10 倍劑量的疫苗預(yù)防牛布病，均可以達到較好的免疫效果，免疫有效期可達72 個月[5]。A19 疫苗株與國際上普遍使用的S19 疫苗株同源性非常高，而后者是目前世界公認的防控奶牛布病最有效的疫苗株[6]。

病原分離是診斷布病的金標準，但病原分離率低，分離條件嚴格，不便于普遍應(yīng)用[7]。血清學(xué)診斷是布病篩檢和確診的主要臨床診斷方法。國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB 18646—2018）中的免疫學(xué)檢測方法包括虎紅平板凝集、試管凝集、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）和補體結(jié)合試驗等。其他免疫學(xué)檢測方法包括膠體金和熒光偏振。病原學(xué)檢測方法包括PCR 和qPCR。

疫苗在提供保護的同時，也為布病的確診增加了困難[8]。由于缺乏便捷有效的區(qū)別診斷方法，免疫牛群中自然感染牛和免疫陽性牛很難區(qū)分[9]。本研究針對某免疫過A19 株疫苗的奶牛場，采用多種檢測方式開展平行檢測。通過比較多種方法的檢測結(jié)果，分析該場是否存在野毒感染，同時比較不同方法的檢測特性。

1 材料與方法

1.1 奶樣、血清樣品

40 份血清樣品和40 份牛奶樣品，于2020 年5 月收集自某奶牛場4 頭未免疫奶牛和36 頭免疫A19 株疫苗的奶牛。奶牛年齡、胎次以及距離最后一次免疫時間詳見表1。

表1 采樣奶牛年齡、胎次等背景信息

1.2 試劑

布病虎紅平板凝集和試管凝集試驗抗原，購自青島立見生物科技有限公司；A19 株疫苗，為新疆天康畜牧生物有限公司生產(chǎn)的活毒疫苗；布病iELISA 試劑盒（批號20191008），購自愛德仕公司；cELISA 試劑盒（批號20191022）、布病抗體瓊擴法檢測試劑盒（批號20190812），購自西班牙INGENASA 公司；間接法布病抗體膠體金試紙條，購自青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR 引物和探針，購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 國家標準方法

虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、cELISA、iELISA，均按照國標（GB 18646—2018）操作。

1.4 瓊脂擴散試驗

抗體瓊脂擴散（瓊擴）試驗基于布魯氏菌野毒株和疫苗株的表面抗原差異，可區(qū)分被檢動物是否存在野毒感染[10]。血清中抗體與相應(yīng)抗原在瓊脂膠中擴散，相遇后會結(jié)合形成沉淀線。試劑中的抗原包含一種布魯氏菌中普遍存在的脂多糖（LPS）和一種野毒株表面的多糖類半抗原（NH）。檢測時，在瓊脂膠中央孔里加入抗原，在周邊孔中加入陰陽性對照和血清樣品，室溫靜置24～48 h。若無沉淀線且對照成立，則認為動物無感染或免疫；若只出現(xiàn)LPS 的沉淀線，則被檢動物很可能僅免疫未感染；若出現(xiàn)兩條沉淀線，則認為被檢動物存在野毒感染。

1.5 膠體金試紙條檢測法

吸取5 μL 血清樣品滴入間接法膠體金試紙條加樣孔中，10～20 min 觀察結(jié)果。當對照線和檢測線同時出現(xiàn)，則認為樣品為陽性。另用相同試紙條檢測牛奶樣品，方法同上。

1.6 病原學(xué)檢測

1.6.1 引物 采用熒光定量PCR（qPCR，探針法）對牛奶中布魯氏菌進行檢測。首先建立布魯氏菌屬（BSSP）和牛種布魯氏菌（BA）的標準曲線。BSSP 作為通用引物，可檢測所有種的布魯氏菌，起到雙重檢測目的，從而保證陽性結(jié)果的準確性。引物信息詳見表2。

表2 qPCR 引物

1.6.2 奶樣處理 吸取10 mL 采集的奶液加入3%檸檬酸鈉-磷酸緩沖液，振蕩混勻，3 000 r/min 離心30 min；用移液器將表層脂類及上清棄去，留下沉淀；加入PBS 緩沖液（pH7.6），振蕩混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，將沉淀保留下來；按照試劑盒說明書操作提取核酸，反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

多份樣品在不同檢測方法中顯示出不同的陽性判定，結(jié)果見表3。

表3 血清及牛奶樣品檢測結(jié)果

2.1 國標方法對血清樣品檢測

4 種國標方法檢測出的陽性樣品數(shù)量有較大差距?；⒓t平板凝集試驗檢出陽性樣品16 份，陽性率為40.0%；試管凝集試驗檢出陽性樣品6 份，陽性率為15.0%；cELISA 和iELISA 方法分別檢出陽性樣品33 和23 份，陽性率分別為82.5%和57.5%。其中，試管凝集試驗檢測的陽性血清（樣品1～6 號），經(jīng)其他3 種國標方法檢測也為陽性。

2.2 膠體金試紙條檢測

膠體金試紙條共檢出9 份陽性血清（樣品1～9 號），陽性率略高于試管凝集試驗。其中，樣品1～4 號被所有血清學(xué)檢測方法判定為陽性，樣品5～7 號被膠體金試紙條以外的4 種血清學(xué)方法判定為陽性，樣品8、9 號被虎紅平板凝集試驗、iELISA 和cELISA 3 種血清學(xué)方法判定為陽性。在牛奶樣品檢測中，膠體金試紙條檢測出10 份陽性樣品，與同方法的血清學(xué)結(jié)果基本一致。對于所有經(jīng)虎紅平板凝集、試管凝集試驗檢測為強陽性的樣品以及經(jīng)瓊擴法判定為野毒感染的試驗牛，其奶樣經(jīng)膠體金試紙條檢測也均呈陽性。

2.3 瓊擴法檢測

瓊擴法檢測結(jié)果顯示，有12 份陽性血清，其中7 份是免疫陽性，5 份為野毒感染。沒有出現(xiàn)瓊擴法單一檢測為陽性的血清樣品。瓊擴法檢測為野毒陽性的樣品中，除1 份樣品為iELISA 陰性外，其他均被所有血清學(xué)方法證實。當瓊擴法檢測出現(xiàn)野毒抗體沉淀線時，可認為該樣品存在野毒感染。但瓊擴法在具有高度特異性的同時，也損失了一定的敏感性，尤其是在讀取結(jié)果時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)沉淀線不夠清晰或者培養(yǎng)48 h 后才能夠勉強觀察到沉淀現(xiàn)象。在本次檢測中，有3 份瓊擴法檢測為陰性的樣品（樣品6、8、9 號）被其他多種方法卻認定為陽性。

2.4 病原學(xué)檢測

2.4.1 BSSP qPCR 標準曲線建立 目標基因插入pUC57 質(zhì)粒。以3.47×108拷貝/μL 進行10 倍梯度稀釋，獲得標準曲線方程Y=-3.12X+45.5，R2=0.991 2（圖1），具有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 BA qPCR 標準曲線建立 目標基因插入pUC57 質(zhì)粒。以6.34×108拷貝/μL 進行10倍梯度稀釋，獲得標準曲線方程Y=-3.43X+32.4，R2=0.997 3（圖2），具有良好的線性關(guān)系。

2.4.3 qPCR 檢測 對采集奶樣進行qPCR 檢測，結(jié)果只有1 份呈現(xiàn)BSSP 和BA 陽性。

2.5 未免疫牛血清檢測

未免疫牛共采集血清4 份（樣品15、21、35、36 號），在瓊擴法、iELISA 和cELISA 檢測中，有2 份樣品（樣品15、21 號）分別被2 種方法檢測為陽性。

3 討論

在本研究中，不同方法表現(xiàn)出了不同特點。試管凝集試驗比虎紅平板凝集試驗顯示出更高的特異性，這也正是虎紅平板凝集試驗作為初篩，試管凝集試驗用以確診的原因。本研究中，試管凝集和虎紅平板凝集試驗均顯示為強陽性的樣品（樣品1～4 號），其他血清學(xué)方法也顯示為陽性，且瓊擴法顯示存在野毒感染。但是試管凝集試驗操作繁瑣，等待時間長，而且需要符合要求的實驗室環(huán)境?；⒓t平板凝集試驗雖然操作簡便，但是對檢測人員的經(jīng)驗有一定要求，實際檢測工作中，對同樣的結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)不同的判讀標準。雖然沒有采用細菌分離鑒定的金標準，但是根據(jù)多種方法的檢測結(jié)果，可以確定本牛場存在野毒感染。通常情況下，奶牛的免疫抗體在6 個月后就無法檢出[11]。然而，本場奶牛免疫時間均超過一年，很多血清樣品仍可以檢出抗體陽性。這可能是由于本場存在野毒感染且排菌的動物，持續(xù)刺激其他免疫奶牛保持抗體存在。為了最大程度且成本可控的降低風(fēng)險，一種簡便可信的鑒別野毒感染方法就顯得尤為重要。

瓊擴法雖然能夠直接指明免疫動物中是否存在野毒感染，但是其檢測成本較高，敏感性有限，對檢測人員的操作經(jīng)驗也有一定要求，難以在牛場普及[12]。iELISA 和cELISA 的敏感性過高，疫苗免疫抗體會嚴重影響檢測結(jié)果。本研究中，有7 份血清樣品僅在兩種ELISA 方法中顯示為陽性（樣品21～27 號），另有6 份（樣品28～33 號）僅在cELISA 中顯示為陽性。ELISA 方法可以敏感地發(fā)現(xiàn)疫苗抗體，但在免疫場判斷是否存在野毒感染時，幾乎不具有參考性[13]。qPCR 有很好的特異性，但是對實驗環(huán)境、操作、設(shè)備都有較高要求，而且樣品中的病原含量可能很低，在不分菌培養(yǎng)的情況下，往往很難直接捕捉到病原核酸。在本研究中，僅有1 份奶樣在qPCR 方法檢測中顯示為陽性。

間接法膠體金試紙條在本次試驗中展示出了較好的參考價值，其所有血清檢測陽性的樣品被至少3 種其他方法所支持，而且對奶樣檢測時，也表現(xiàn)出了與血清學(xué)方法良好的符合度，在生產(chǎn)現(xiàn)場具有很好的應(yīng)用價值。這是因為對于產(chǎn)奶期的奶牛無需采血，減少了對動物的刺激，擠奶時可以當場檢測，操作簡單、結(jié)果清晰。

針對免疫過的奶牛，目前沒有一種簡便有效鑒別野毒感染的方法。但是通過對幾種檢測方法的比較分析，間接法膠體金試紙條顯示出了較好的參考意義和方便的操作性。對于布病免疫奶牛場，可以在不采血的情況下，通過奶樣快速篩查出存在布魯氏菌感染風(fēng)險的牛，然后及時對其隔離觀察，送樣品到當?shù)貏游镆呖夭块T檢測，做好人員防護和無害化處理工作。