王坤

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

0 引言

糖尿病、高血壓等因素導(dǎo)致的出血性腦中風(fēng)（Intracerebral hemorrhage,ICH）發(fā)病率和死亡率高[1]。即使ICH患者存活，也常出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損或障礙，生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。

對(duì)ICH實(shí)施有效的神經(jīng)元保護(hù)，是緩解ICH損傷，維持患者神經(jīng)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵。NGF、BDNG等神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員對(duì)維持神經(jīng)元功能具有重要作用。BDNF能夠改善ICH疾病預(yù)后，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷[2]。但是這些神經(jīng)營養(yǎng)因子含量低，制備工藝比較復(fù)雜，如果能找到與BDNF具有相似作用，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用的替代物，將有效保持ICH神經(jīng)元的功能，促進(jìn)患者康復(fù)。

7,8-二羥基黃酮（7,8-dihydroxyflavone，DHF）可以活化PI3K/Akt信號(hào)路徑，促進(jìn)結(jié)腸平滑肌蠕動(dòng)改善便秘[3]；腹腔注射DHF能夠恢復(fù)阿爾茲海默病ICV-STZ大鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體功能障礙，發(fā)揮較好的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。盡管DHF具有類似BDNF的結(jié)構(gòu)，但是DHF激活通過何種分子機(jī)制發(fā)揮對(duì)ICH神經(jīng)元的保護(hù)作用還不清楚。觀察DHF對(duì)人腦神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用和潛在分子機(jī)制，為指導(dǎo)神經(jīng)元保護(hù)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞（Procell公司）。

1.1.2 主要試劑和儀器

人神經(jīng)元專用完全培養(yǎng)基（Procell公司），Triciribine（Sigma-Aldrich公 司），DHF（日 本TCI公司），CCK-8試劑（日本Dojindo公司）、AnnexinⅤ-FITC（上海碧云天生物科技公司），F(xiàn)ACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀（BD公司），人TrkB、Akt、磷酸化Akt蛋白的ELISA試劑盒（R&D公司）。日本OLYMPUS倒置顯微鏡，Thermo公司的Multiskan FC酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 人神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人神經(jīng)元專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞。第3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞未出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象。無任何刺激進(jìn)行培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞為對(duì)照組。35μmol/L DHF刺激神經(jīng)元細(xì)胞為DHF組；若同時(shí)加入10μmol/L Triciribine者為Akt抑制劑組。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

7.50×103人腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37?C，5%CO2培養(yǎng)12h。按實(shí)驗(yàn)分組添加相應(yīng)試劑，同時(shí)添加10μl CCK-8試劑，37?C，5%CO2培養(yǎng)4h。Multiskan FC酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)量吸光度值（Absorbance value，A值）。

1.2.3 流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

0.25%胰酶-EDTA溶液消化各組細(xì)胞，5.5×105各組細(xì)胞以12.5ml/L（體積比）AnnexinⅤ-FITC溶液重懸孵育15min；4℃，1000r/min離心5min，加入20g/L碘化丙啶孵育3min；4℃，0.01mmol/L PBS懸浮細(xì)胞。FACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)目。

1.2.4 ELISA

9.0×106各組細(xì)胞，4℃，以RIPA蛋白裂解液裂解并提取蛋白質(zhì)；BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，每組30μg蛋白用于ELISA檢測(cè)。人Akt、磷酸化Akt蛋白的ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中Akt(312.0-20,000 pg/mL)、磷酸化Akt蛋白(156.0-10,000 pg/mL)蛋白含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GraphPad_Prism 8.0.2.263軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩兩間比較采用Q檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHF促進(jìn)人腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、DHF組和Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖A值相比，數(shù)據(jù)具有明顯差異（P<0.01）。相對(duì)于對(duì)照組和Akt抑制劑組，DHF組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖A值顯著增高（P<0.01）；相對(duì)于DHF組，Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖A值顯著降低（P<0.01），見表1。

表1 各組人皮層神經(jīng)元細(xì)胞A值、凋亡數(shù)目的比較（，n=6）

表1 各組人皮層神經(jīng)元細(xì)胞A值、凋亡數(shù)目的比較（，n=6）

注：*P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.01，與DHF組相比。

2.2 DHF抑制人腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、DHF組和Akt抑制劑組人皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目相比，具有明顯差異（P<0.01）。相對(duì)于對(duì)照組和Akt抑制劑組，DHF組人皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯降低（P<0.01）；相對(duì)于DHF組，Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多（P<0.01），見表1。體外實(shí)驗(yàn)說明DHF能夠促進(jìn)人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。

2.3 DHF對(duì)Akt、磷酸化-Akt蛋白含量的影響

對(duì)照組、DHF組和Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞Akt、磷酸化-Akt蛋白含量有顯著差異（P<0.01）。與對(duì)照組相比，DHF組Akt、磷酸化-Akt蛋白含量均明顯增高（P<0.01），相對(duì)于DHF組，Akt抑制劑組的Akt、磷酸化-Akt蛋白含量均明顯降低（P<0.01），表2。

表2 各組人皮層神經(jīng)元細(xì)胞Akt、P-Akt蛋白含量的比較（，pg/mL，n=6）

表2 各組人皮層神經(jīng)元細(xì)胞Akt、P-Akt蛋白含量的比較（，pg/mL，n=6）

注：*P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.01，與DHF組相比。

3 討論

出血性腦中風(fēng)（ICH）發(fā)病率和死亡率逐年升高[5]。即使出血性腦中風(fēng)（ICH）患者存活，也常伴隨著長期的神經(jīng)功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，7,8-二羥基黃酮（DHF）結(jié)構(gòu)與BDNF相似，皆與TrkB結(jié)合，引起TrkB磷酸化，有效活化其下游PI3K/Akt、MAPK/Erk信號(hào)傳遞路徑以對(duì)抗細(xì)胞凋亡[6]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)腹腔注射DHF后2小時(shí)，能有效活化腦神經(jīng)細(xì)胞上TrkB而抑制細(xì)胞凋亡[4]。以DHF取代BDNF的作用活化TrkB，在臨床抗高血壓、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、并能有效改善腦神經(jīng)損傷壓力與老化所造成的記憶功能缺損、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傷害等問題，但是DHF對(duì)腦出血性腦損傷的保護(hù)作用，DHF能否改善ICH造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡還需要進(jìn)一步研究。

為了研究DHF對(duì)ICH神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)效果，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、DHF組和Akt抑制劑組三組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖A值具有顯著差異。相對(duì)于對(duì)照組和Akt抑制劑組，DHF組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖A值最高；相對(duì)于DHF組，Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞增殖A值顯著降低（P<0.01）。在一項(xiàng)評(píng)價(jià)7,8-二羥基黃酮(DHF)對(duì)過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)引起PC12細(xì)胞損傷的研究中，也采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)法檢測(cè)PC12細(xì)胞活力，AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀觀察并分析PC12細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHF可以減輕H2O2引起的PC12細(xì)胞損傷，促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與這些學(xué)者的研究相符，均證明DHF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞具有一定保護(hù)效果。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DHF組Akt、磷酸化Akt蛋白明顯高表達(dá)，在Akt信號(hào)通路與FUS相互作用關(guān)系的研究中，證實(shí)了FUS通過AKT通路促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖并介導(dǎo)其自噬[8]。EGFR能夠活化PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)精原母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和遷移[9]。若阻斷PI3K-Akt-BCL-2信號(hào)通路，可以減輕SD大鼠大腸癌發(fā)生和發(fā)展[10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示DHF作用的ICH能夠顯著修復(fù)或改善ICH神經(jīng)元損傷。研究結(jié)果將為開展神經(jīng)元保護(hù)，促使ICH患者康復(fù)提供有效的靶向修復(fù)思路。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，DHF作用的人皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞增殖水平明顯升高，其凋亡能力顯著降低，更證實(shí)了DHF能夠通過Akt信號(hào)通路調(diào)控人皮質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡，與實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平進(jìn)行初步探索，還缺少體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)證據(jù)，后期將利用大鼠ICH模型，進(jìn)一步觀察DHF對(duì)ICH神經(jīng)元的保護(hù)作用。