周瓊，張斌成

（深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院 內科，廣東 深圳 518118）

0 引言

胃癌（Gastric cancer,GC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，全球每年新增約100萬例，GC發(fā)病率和死亡率在東亞地區(qū)最高[1]，我國每年新發(fā)和死亡病例均占世界40%以上，目前已成為全球第4大致死性惡性腫瘤[2]。胃切除術是早期GC患者的主要治療策略，然而由于早期GC患者沒有特定癥狀，全身化療成為主要選擇，但化療耐藥性經常成為治療失敗的原因[3]。因此，迫切需要進一步了解GC的發(fā)病機理，研究用于早期診斷和其他可行治療方法的新型生物標志物。

microRNA（miRNA）是一類來源于內源性染色體上的小單鏈非編碼RNA，長度為21-25nt，具有高度保守性，通過與靶mRNA的3’-UTR序列結合，引起mRNA降解或抑制翻譯。研究表明，miRNA通過不同程度地上調或下調與癌細胞信號傳導相關基因的表達，進而調節(jié)癌細胞的增殖、侵襲和凋亡。因此，miRNA可用作治療的有效診斷標記和藥物靶標[4]。研究報道，hsa-miR-34a-5p可以誘導乳腺癌細胞凋亡和導致細胞周期停滯，抑制侵襲和遷移[5]；研究還發(fā)現(xiàn)hsa-miR-34a-5p通過調控腫瘤蛋白p53和酪氨酸蛋白激酶Fyn表達，進而抑制彌散性大B細胞淋巴瘤[6]。

PTEN是脂質和蛋白質的雙重磷酸酶，可以調控腫瘤細胞生長、存活、遷移和粘附。PI3K是PTEN的主要底物，活化的PI3K將質膜內側的磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸酯（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯（PIP3），PIP3隨后將含有PH結構域的Akt蛋白募集到細胞膜上，導致Akt構象發(fā)生改變；隨后，依賴于PI3K活化的Akt（Thr308和Ser473）轉移到細胞核中，磷酸化下游底物，調控細胞凋亡、細胞周期、轉移和代謝[7]。研究表明，PTEN/PI3K/Akt途徑在GC的發(fā)病進程中發(fā)揮重要作用[8]，但深入的調控機制并不清楚。

Notch受體被裂解后，釋放Notch受體胞內結構域，即Notch受體的活化形式[9]；然后，Notch受體胞內結構域通過C啟動子結合因子-1（CBF1）/重組信號結合蛋白-Jk（RBP-Jk）轉移到核中，激活靶基因的表達。在GC細胞中，Notch1和Notch2表現(xiàn)為促進腫瘤發(fā)生的作用[10]，但關于Notch1與PTEN/PI3K/Akt途徑之間的相互調控關系研究較少。

因此，本研究以構建的過表達及敲低MIR34A基因的穩(wěn)轉SGC7901細胞為研究對象，探究MIR34A對體外細胞增殖及細胞周期、體內皮下腫瘤的影響；研究MIR34A是否通過直接與Notch1的3’-UTR區(qū)域直接作用，進而調控PTEN/PI3K/Akt通路發(fā)揮抑制GC細胞增殖，最終明確MIR34A的功能及調控機制，旨在為GC的靶向治療提供科學的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑

293T細胞購買于美國ATCC公司、MTT粉末、PEG-8000、puromycin、PI、氯仿和異丙醇購買于Sigma-Aldrich公司；Trizol、DNA Gel Loading Dye（6X）、GeneRuler 1Kb plus DNA ladder、turbofect轉染試劑和Pierce BCA蛋白定量試劑盒購買于Thermo Fisher Scientific公司；5X HF buffer、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、Random primer、MgCl2、SYBGREEN、DNase enzyme、10X RT transcription buffer、M-MuLV Reverse transcriptase、RNase inhibitor、10X Cut smart buffer、10X T4 ligation buffer、T4 ligation enzyme、KpnI、BamHI、NheI、XhoI、XbaI和FseI酶購買于NEB公司；FUGW-GGSGX3-EGFP、pSPAX2、pMD2G、pcDNA6.2-GW/EmGFP、PCDNA5.1-TO-HA和pGL3-Basic-IRES-Luc質粒購買于Addgene公司；Notch1、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、PCNA、Ki67、GAPDH抗體及抗兔/鼠HRP標記的二抗均購買于CST公司；QIA quick Gel Extraction kit、DH5α competent 細胞購買于天根生化科技（北京）有限公司；引物由廣州艾基生物有限公司合成；其余細胞培養(yǎng)試劑均購于Gibco公司。

1.1.2 儀器

動物稱重天平（美國雙杰兄弟(集團)有限公司），藥物稱量天平（梅特勒-特利多儀器（上海）有限公司），超速離心機（Beckman，德國），流式細胞儀（BD Accuri C6，美國），游標卡尺（上海美耐特實業(yè)有限公司），多功能酶標儀（BioTEK，美國），半干式轉膜儀和電泳裝置（BioRad，美國），超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore公司），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（BioRad，美國），Stratagene Mx3005P和PCR Sure Cycler 8800 (Agilent Technologies)，C1000 Touch Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific)，倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）。

1.1.3 細胞培養(yǎng)

SGC7901細胞培養(yǎng)于RPMI-1640+10% FBS+1%P/S完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，當SGC7901達到80% -90%匯合時，進行傳代培養(yǎng)。

1.1.4 實驗動物

雄性SPF級裸鼠18只，體重為（23±2）g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產合格證號：SCXK（粵）2019-0035；飼養(yǎng)于20℃-24℃，空氣相對濕度40%-60%的環(huán)境中，房間保持12h晝夜節(jié)律，裸鼠自由飲水和進食，實驗中所有操作均遵循廣州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的相關規(guī)定。

1.2 研究方法

1.2.1 構建過表達MIR34A的穩(wěn)轉SGC7901細胞

NCBI找出MIR34A的pre-miRNA序列（Gene ID:407040），選取pre-miRNA序列上下游各200 bp的堿基作為PCR模板，插入慢病毒穿梭質粒FUGW-GGSGX3-EGFP的BamHI和NheI酶切位點之間，基因測序結合Western blot驗證成功后，利用turbofect轉染試劑方法將2.5 μg pSPAX2、pMD2G和FUGW-pri-MIR34A-GGSGX3-EGFP質粒轉染到293T細胞，轉染16 h后更換含10%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基，轉染72 h后收集病毒上清，利用PEG-8000濃縮病毒，最后用完全培養(yǎng)基重懸病毒沉淀，稀釋計數測定法測定病毒滴度，-80 °C冰箱分裝保存。正向引物：5’-CTAGaGG ATCCTGGCTAATTTTTAAA-3’；反向引物：5’-GCTAGCACGTGCAAACTTCTCC-3’。

將SGC7901細胞（5×105個/2mL）接種于6孔板中，接種24 h后，根據預實驗確定的感染復數（MOI）加入對應體積的病毒量，感染24h后吸走含有病毒的上清培養(yǎng)基，并加入相同體積的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，換用含puromycin的培養(yǎng)基篩選細胞，獲得單克隆后擴大培養(yǎng)，最終獲得穩(wěn)定過表達MIR34A的SGC7901細胞。

1.2.2 構建敲低MIR34A的穩(wěn)轉SGC7901細胞

根據BLOCK-iT? RNAi Designer在線設計工具（Thermo Fisher Scientific）得到靶向敲低MIR34A基因的堿基序列，將Top Strand和Bottom Strand淬火形成的oligo連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP的BamHI和XhoI之間，基因測序結合Western blot驗證成功后，按照1.2.1的方法進行穩(wěn)轉細胞系構建。Top Strand：5’-TGCTGTTCTAG GGCAGTATACTTGCTGTTTTGGCCACTGACT GACAGCAAGTACTGCCCTAGAA-3’，Bottom Strand：5’-CCTGTTCTAGGGCAGTACTTGCTG TCAGTCAGTGGCCAAAACAGCAAGTATACTG CCCTAGAAC-3’。

1.2.3 構建pGL3-Basic-IRES-Luc-Notch 1及突變質粒

將Notch1的3’-UTR區(qū) 域（3’-UTR Length:1654）構建至pGL3-Basic-IRES（Addgene,64784）的luciferase后面，酶切位點是XbaI和FseI，利用Trizol提取SGC7901細胞總RNA，經Random primer反轉錄后，加入正反向引物獲得含有XbaI和FseI酶切位點的Notch1的3’-UTR PCR片段，然后經T4 ligation后，測序成功獲得pGL3-Basic-IRESLuc-Notch 1 WT質粒；以WT質粒為模板，將Seed Location（180和909）序列中的cactgcc進行點突變，獲得pGL3-Basic-IRES-Luc-Notch 1 Mut質粒。WT質粒正向引物：5’-Atcgccgtgttctagaacggcgcgcccc-3’，反向引物：5’-gctcgaagcggccggccttttttttttttttttt-3’；Mut質粒正向引物：5’-aagcctttttatttatatgtactgtt-3’，5’-tttgtttctgtgtaaaataaaagtac-3’。

1.2.4 構建PCDNA5.1-TO-Notch1-HA質粒

NCBI找出Notch1的CDS序列（Gene ID:4851），插入PCDNA5.1-TO-HA質粒的XhoI和KpnI酶切位點之間，基因測序結合Western blot驗證成功后，獲得PCDNA5.1-TO-Notch1-HA質粒。正向引物：5’-CTA CCTCGAGatgccgccgctcctggcgcccctgc-3’；反向引物：5’-CAGCTCGGTACCcttgaaggcctc-3’。

1.2.5 Western blot

細胞及組織加入含1 μg/mL PMSF和1 μL磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液中冰上裂解45 min（體積比為1:1），離心后取上清用Pierce BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將上清與5x Loading buffer混合均勻，100℃煮10 min，上樣20 μg蛋白，調節(jié)電壓至80V，待溴酚蘭剛跑出分離膠底部即可終止電泳，然后將PAGE凝膠放于半干轉印槽，恒壓15V條件下轉膜2h，5%奶粉的封閉2 h，TBST緩沖液洗3次，每次5min，加入抗體稀釋液稀釋至適當濃度的一抗（1:1000），4℃條件下孵育過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（HRP-IgG,1:2000），室溫孵育2h，TBST洗滌后，加入ECL顯影液，在發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影并利用膠圖象該凝處理系統(tǒng)分析其灰度值。

1.2.6 qRT-PCR

利用Trizol提取SGC7901細胞總的RNA，加入RT引物逆轉錄后，在qRT-PCR 96孔板中依次加入物質如下（20 μL體系）：cDNA：10 μL；dNTP mix(10 mM)：0.4 μL；5X HF buffer：4 μL；Primer (R/F,10 μM)：1 μL；DNase enzyme：0.15 μL；DNase free water：4.05μL；MgCl2：0.2 μL；SYBRGREEN：0.2 μL。qRT-PCR條件為：98 ℃，30 s；98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，15 s；55 ℃，30 s；95 ℃ 30 s，共40個cycles，最后利用2-ΔΔCT計算含量。MIR34A RT引物：5’-GG CCAGCUGUGAGUGUUUCUUUGGCAGUGU CUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUA AGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU AGAAGUGCUGCACGUUGUGGGGCCCacaa cc-3’；MIR34A正向引物：5’-UGUUGUGAGCAA UAGUAAGGAAG-3’；MIR34A反向引物：5’-cgtcc TGGCAGTGTCTTAGCT-3’；Notch1正 向 引 物：5’-CCAGCATCACCTGCCTGTTA-3’；Notch1反向引物：5’-CCAAGTCTGACGTCCCTCAC-3’；PTEN正向引物：5’-ACCCACCACAGCTAGAACTT-3’；PTEN反向引物：5’-GGGAATAGTTACTCCCTTT TTGTC-3’；Akt正向引物：5’-GGCCGAGCACCGA GC-3’，Akt反向引物：5’-CTCACGCGCTCCTCTC AG-3’；PI3K正向引物：5’-CATGCATTGTTTTGCA CCCC-3’，PI3K反向引物：5’-ATGGAAGACGGG AGATTCACAT-3’。

1.2.7 腫瘤模型建立

雄性BALB/c裸鼠（4-5周齡）共18只，隨機分成SGC7901-空載組（SGC7901-Ctrl）、SGC7901-MIR34A過表達組（SGC7901-MIR34A OE）和SGC7901-MIR34A敲低組（SGC7901-MIR34A KD），每組6只。將100 μL細胞懸液（6×106個/只）注入腋下皮膚。

1.3 觀察指標

1.3.1 細胞增殖檢測

將構建好的穩(wěn)定表達或敲低MIR34A的SGC7901細胞分別接種于96孔板中，分為空白對照組（SGC7901-Ctrl）、SGC7901-MIR34A過表達組（SGC7901-MIR34A OE）和SGC7901-MIR34A敲低組（SGC7901-MIR34A KD），每孔細胞數為5×103個/100 μL培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后每孔加入10 μL MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h，吸走上清加入150 μL DMSO，490 nm處測定吸光度（OD），計算細胞存活率，繪制生長曲線。細胞存活率（%）=100 ＊測量組OD值/ctrl組OD值。

1.3.2 細胞周期檢測

將構建好的穩(wěn)定表達或敲低MIR34A的SGC7901細胞接種于24孔板中，每孔細胞數為1×105個/1 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，棄去上清，用胰酶消化細胞，4 ℃，1200 rpm離心，預冷的PBS清洗細胞，最終用1.5 mL PBS重懸；在細胞懸液中加入3.5 mL -20 ℃預冷的無水乙醇，使乙醇的終濃度為70%，4 ℃固定過夜，PBS洗滌后加入PI染液（5 μg/mL），室溫條件下染色30 min；流式細胞儀進行細胞周期的DNA含量分析。

1.3.3 MIR34A對Notch1/PTEN/PI3K/Akt蛋白及mRNA影響

將構建好的穩(wěn)定表達或敲低MIR34A的SGC7901細胞接種于6孔板中，每孔細胞數為5×105個/2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，棄去上清，用胰酶消化細胞，利用Western blot和qRT-PCR檢測MIR34A對Notch1/PTEN/PI3K/Akt蛋白及mRNA的影響。

1.3.4 熒光素酶實驗

將穩(wěn)定表達MIR34A的SGC7901細胞接種于96孔板中，每孔細胞數為5×103個/100 μL培養(yǎng)液，按照turbofect轉染試劑相關方法將200 ng Renilla質粒 和pGL3-Basic-IRES-Luc-Notch 1 WT（0.5 μg）或pGL3-Basic-IRES-Luc-Notch 1 Mut（0.5 μg）質粒轉染到每孔SGC7901細胞中，轉染48 h后，加入細胞裂解液，按照雙熒光素酶報告基因方法，酶標儀檢測生物熒光，計算螢火蟲熒光蛋白與海腎素熒光蛋白生物熒光的比值。

1.3.5 Notch1對PTEN/PI3K/Akt蛋白及增殖蛋白的影響

將SGC7901細胞接種于6孔板中，分為Ctrl組和Notch1過表達組（Notch1 OE），每孔細胞數為5×105個/2 mL培養(yǎng)液，按照turbofect轉染試劑相關方法將2.5 μg PCDNA5.1-TO-Notch1-HA質粒轉染到SGC7901細胞中，轉染48 h后，棄上清收集細胞沉淀，利用Western blot檢測Notch1對PTEN/PI3K/Akt通路蛋白，PCNA和Ki67細胞增殖蛋白表達的影響。

1.3.6 確定MIR34A對體內GC腫瘤形成的影響

每3天對裸鼠稱重（g）一次并測量腫瘤的長（mm）和寬（mm）（腫瘤體積=0.52×長×寬2）；實驗終點，將裸鼠安樂死并手術解剖腫瘤并稱重，計算腫瘤指數，腫瘤指數=腫瘤重量（g）/裸鼠體重（g）。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用Graphpad prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，以均數±標準誤（Mean± SEM）表示，所有細胞實驗重復3次，兩組間比較采用T-test，多組間比較采用單因素或雙因素方差分析和Tukey's檢驗，P<0.05表示有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 MIR34A抑制SGC7901細胞增殖

實驗結果如圖1所示，細胞培養(yǎng)48h和72h后，過表達MIR34A組的SGC7901細胞生長出現(xiàn)抑制，而敲低MIR34A組的SGC7901細胞增加，與Ctrl組相比，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

圖1 MIR34A對SGC7901細胞的增殖影響

2.2 MIR34A阻滯SGC7901細胞的S期

利用流式細胞儀檢測MIR34A對SGC7901細胞生長周期的影響，實驗結果如圖2所示，與Ctrl組相比，MIR34A過表達可以降低S期的細胞數目，而MIR34A敲低可以增加S期細胞數目，說明MIR34A可以阻滯細胞S期。

圖2 MIR34A對SGC7901細胞周期的影響

2.3 MIR34A抑制Notch1/PTEN/PI3K/Akt 蛋白及mRNA含量

利用Western blot檢測Notch1/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白的表達，實驗結果如圖3所示，與Ctrl組相比，過表達和敲低MIR34A組Notch1、PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白變化均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

圖3 MIR34A對Notch1/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白的影響

利用qRT-PCR檢測miRN-34a的含量，實驗結果如圖4A所示，與Ctrl組相比，過表達和敲低MIR34A均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；同時利用qRT-PCR檢測Notch1/PTEN/Akt的mRNA含量，結果如圖4B所示，過表達MIR34A可以分別降低Notch1和PTEN的含量（P<0.05），而敲低MIR34A可以顯著逆轉這一變化（P<0.05），但未影響Akt mRNA的含量。

圖4 MIR34A對Notch1/PTEN/PI3K/Akt通路RNA含量的影響。

2.4 MIR34A可以結合Notch1的3’-UTR區(qū)域

為驗證miR-34a-5P是否直接調控Notch1的3’-UTR區(qū)域，利用雙熒光素酶報告基因實驗檢測熒光素強度，實驗結果如圖5所示，與negative ctrl組相比，pGL3-Basic-IRES-Luc-Notch 1 WT組過表達MIR34A可以顯著降低熒光素強度（P<0.05）；而在pGL3-Basic-IRES-Luc-Notch 1 Mut組，過表達MIR34A并未降低熒光素強度，與pGL3-Basic-IRESLuc-Notch 1 WT+MIR34A組相比，具有顯著的統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

圖5 MIR34A與Notch1直接調控的研究

2.5 Notch1促進PTEN/PI3K/Akt和PCNA、Ki67增殖蛋白表達

為進一步證明Notch1與PTEN/PI3K/Akt的上下游調控關系，在SGC7901細胞中過表達Notch1，Western blot結果（圖6）顯示，Notch1過表達組可以顯著增加PTEN、p-PI3K和p-Akt的含量（P<0.05）。

圖6 Notch1對PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白的影響

接下來，為進一步明確Notch1對GC增殖蛋白表達的影響。在SGC7901細胞中過表達Notch1，Western blot結果（圖7）顯示，Notch1過表達可以顯著增加PCNA和Ki67增殖蛋白表達（P<0.05）。

圖7 Notch1對PCNA和Ki67增殖蛋白的影響。

2.6 MIR34A抑制體內SGC7901腫瘤的生長

每間隔3d稱量裸鼠體重，結果如圖8A所示，各組別裸鼠體重無顯著性差異；游標卡尺測量腫瘤的長和寬，計算腫瘤體積，結果如圖8B所示，SGC7901-MIR34A OE組腫瘤大小顯著低于SGC7901-Ctrl組（P<0.05），而SGC7901-MIR34A KD組腫瘤大小顯著大于SGC7901-Ctrl組（P<0.05）；實驗終點，處死裸鼠，對各組別腫瘤進行拍照（圖8C），并對腫瘤稱重，計算腫瘤與體重的比值，結果如圖8D所示，SGC7901-MIR34A OE組腫瘤指數顯著低于SGC7901-Ctrl組（P<0.05），而SGC7901-MIR34A KD組腫瘤指數顯著高于SGC7901-Ctrl組（P<0.05）。

圖8 MIR34A對裸鼠體內SGC7901腫瘤生長的影響。

3 討論

GC是與癌癥相關的第二死亡率疾病[11]。目前晚期GC患者的預后仍然很差，5年生存率為5-20%，中位總生存期為10個月[12]。GC的發(fā)生與宿主、環(huán)境和細菌等多因素有關，隨著GC進展會導致基因和表觀遺傳學水平上的不同分子改變[13]。因此，探尋GC診斷的分子標記物為GC治療提供新的思路。

PTEN/PI3K/Akt通路在GC腫瘤的生長、轉移、血管生成和化學耐藥性中起決定性作用[11,14,15]。hsa-miR-34a-5p可能是一個具有抑制腫瘤功能的miRNA，但其抑瘤的分子機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-34a-5p在肝細胞癌、胰腺癌、黑色素瘤和前庭神經鞘瘤中高表達[16]。在本研究中，我們通過MTT和流式技術證實，hsa-miR-34a-5p具有抑制SGC7901細胞增殖和阻滯其在S期的作用；體內實驗進一步證明，hsa-miR-34a-5p可以抑制腫瘤生長；Western blot和qRT-PCR結果表明，hsa-miR-34a-5p可以顯著降低PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達，說明hsa-miR-34a-5p可能通過調控PTEN/PI3K/Akt通路影響GC進展。

Notch1與多種腫瘤的增殖、侵襲和遷移相關。研究表明，在GC組織，SGC7901和AGS細胞的Notch1和p-Akt水平顯著高于正常對照組；Notch 1在GC中起著促癌作用，Notch 1低表達可以抑制GC細胞的遷移和增殖[17]。Notch1通路阻斷劑DAPT和PI3K/Akt通路抑制劑LY294002可以協(xié)同抑制SGC7901細胞的遷移和侵襲能力；此外，DAPT和LY294002協(xié)同抑制GC細胞中Notch1和p-Akt的水平[18]。上述實驗證明Notch1與PTEN/PI3K/Akt通路存在必然聯(lián)系。本研究證明過表達Notch1可以激活PTEN/PI3K/Akt通路；同時，hsa-miR-34a-5p過表達可以顯著降低Notch1的mRNA和蛋白含量；雙熒光素酶報告基因實驗證實，hsa-miR-34a-5p與Notch1的3’-UTR區(qū)域直接結合。綜上所述，hsa-miR-34a-5p可能通過調控Notch1表達進而影響PTEN/PI3K/Akt通路抑制GC發(fā)生。

本研究進一步明確了miR-34a在GC發(fā)生和發(fā)展中的調控機制，為探索新的、有效的GC診斷和預后評價標記物及治療方法提供新的思路。