龔競(jìng)，尚杉，鄭茜，于新波，朱勇

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南大學(xué) 蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

滯育是生物體發(fā)育到某一特定階段停滯生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)抵抗外界不利環(huán)境的一種生理現(xiàn)象，普遍發(fā)生在線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)甚至哺乳動(dòng)物上[1-5]．當(dāng)生物體受到光照、溫度等外界信號(hào)誘導(dǎo)時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生一系列變化：呼吸減弱、代謝降低、抗逆性增強(qiáng)、發(fā)育逐漸停滯進(jìn)入滯育．不同于休眠，滯育通常發(fā)生在不利條件來(lái)臨前，在滯育過(guò)程中即使適宜的條件到來(lái)也不會(huì)立即打破滯育，需要經(jīng)歷一定時(shí)間或受到某一因子刺激后，生物體才能解除滯育．家蠶是典型的卵滯育昆蟲(chóng)，在胚胎早期進(jìn)入滯育[6]，根據(jù)滯育程度的差異可以劃分為一化性品種，自然條件下1年只孵化1次； 二化性品種，自然條件下1年只孵化2次； 多化性品種，自然條件下1年孵化多次．其中，二化性家蠶可以通過(guò)對(duì)其母代家蠶催青時(shí)期條件進(jìn)行設(shè)置來(lái)控制子代家蠶的滯育性[7]，即高溫長(zhǎng)光照催青獲得子代滯育卵，低溫黑暗獲得子代非滯育卵。

熱激蛋白(heat shock proteins，Hsps)是一種高度保守的蛋白，可防止底物蛋白的不可逆變性，從而增強(qiáng)生物體的抗逆性，廣泛存在于各種原核和真核生物中．根據(jù)Hsps的分子量和同源關(guān)系可以分為4種[8]，分別為Hsp90，Hsp70，Hsp60和sHsps(small Hsps，sHsps)．其中，sHsps的相對(duì)分子質(zhì)量在1.2×104～4.2×104之間，通常在3.0×104以下，有一個(gè)α-晶體區(qū)域包含約100個(gè)氨基酸殘基的保守序列[8-9]．Hsps最初是在果蠅的研究中被發(fā)現(xiàn)[10]，是對(duì)高溫有應(yīng)激反應(yīng)的一種蛋白，并因此得名．隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Hsps可以在寒冷、干燥、缺氧和化學(xué)藥品等應(yīng)激條件下上調(diào)表達(dá)[11]。

熱激蛋白廣泛參與到生物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控過(guò)程中．在昆蟲(chóng)滯育過(guò)程中，麥紅吸漿蟲(chóng)Sitodiplosismosellana的Hsp70和Hsp90在幼蟲(chóng)滯育和一定范圍的冷熱脅迫下表達(dá)上調(diào)，而Hsp70在滯育之前和滯育期間豐度相當(dāng)[11]； 蛀莖夜蛾Sesamianonagrioides滯育幼蟲(chóng)中Hsp90 的表達(dá)量增加，而Hsp70在滯育過(guò)程中減少[13]； 非洲棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera滯育期間腦中Hsp20.7和Hsp90的表達(dá)量下降，而Hsp21.4和Hsp70表達(dá)量升高[14]．熱激蛋白在滯育過(guò)程中含量的變化，暗示其可能在當(dāng)中發(fā)揮了重要作用，在滯育過(guò)程和應(yīng)急反應(yīng)時(shí)可能具有相似功能。

目前，有多個(gè)家蠶Hsps被研究鑒定：Fan等[15]采用鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)法對(duì)蠶卵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)Hsp蛋白； Li等[16]通過(guò)全基因組分析鑒定了16個(gè)家蠶sHsp基因，并發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)sHSPs顯示出與脊椎動(dòng)物完全不同的進(jìn)化模式．在我們前期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中[17]，通過(guò)對(duì)產(chǎn)后32 h的滯育卵和發(fā)育蠶卵進(jìn)行RNASeq測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的家蠶Hsp基因．本文中我們選取BmHsp19.5基因(BGIBMGA013545)進(jìn)行進(jìn)一步分析，完成了克隆鑒定和生物信息學(xué)分析，并對(duì)該基因在滯育卵和非滯育卵中產(chǎn)后時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了調(diào)查分析．這些結(jié)果將為揭示家蠶滯育過(guò)程中Hsps基因的表達(dá)特征及功能提供重要的研究信息，也為研究其他昆蟲(chóng)的Hsps提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的家蠶二化性品種‘大造’由西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)提供，母代家蠶通過(guò)高溫25 ℃、長(zhǎng)光照條件下催青產(chǎn)下滯育卵，低溫15 ℃、短日照條件下催青產(chǎn)下非滯育卵為實(shí)驗(yàn)材料．按照常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶，取子代蠶卵作為實(shí)驗(yàn)材料．將蠶卵置于1.5 mL離心管中，用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得的家蠶BmHsp19.5基因序列，通過(guò)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Silkdb 3.0(http：//silkworm.swu.edu.cn/silkdb/) Blast檢索，采用Primer 5.0軟件在預(yù)測(cè)序列上設(shè)計(jì)克隆引物．基因鑒定后，為調(diào)查BmHsp19.5基因在產(chǎn)后時(shí)期的表達(dá)情況設(shè)計(jì)了qPCR引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.3 基因克隆

PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性1.5 min； 94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，28個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min．?dāng)U增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐抗性的平板篩選后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.4 BmHsp19.5生物信息學(xué)分析

利用ProtParm在線(xiàn)程序(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)分析家蠶BmHsp19.5蛋白理化參數(shù)； 應(yīng)用Mega 7.0軟件、BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和(http：//silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)程序?qū)mHsp19.5蛋白序列做同源性比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)．采用SignalP在線(xiàn)程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析BmHsp19.5蛋白信號(hào)肽的功能； 使用 TMHMM在線(xiàn)程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Expasy Protscale在線(xiàn)程序(http：// web.expasy.org / protscale /l)進(jìn)行BmHsp19.5蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)和疏水性分析； 使用SMART軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.5 家蠶BmHsp19.5在蠶卵產(chǎn)后不同時(shí)期的檢測(cè)

qPCR采用ABI Step One儀器進(jìn)行兩步法反應(yīng)．反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸40 s，30個(gè)循環(huán)．每個(gè)時(shí)期設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，根據(jù)熒光定量所得到的Ct值，采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPadPrism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)采用多重T-test方法來(lái)比較不同樣品的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶BmHsp19.5克隆

目的基因以家蠶產(chǎn)下32 h的蠶卵cDNA為模板，用克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)(圖1a)，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小在504 bp，與預(yù)測(cè)編碼區(qū)序列大小一致．隨后進(jìn)行凝膠回收并驗(yàn)證(圖1b)，并將回收片段連接到載體上(圖1c)．測(cè)序結(jié)果在Silkdb 3.0網(wǎng)站比對(duì)分析后，表明BmHsp19.5基因沒(méi)有內(nèi)含子，全長(zhǎng)為732 bp，其中ORF為504 bp，編碼的氨基酸序列為167個(gè)氨基酸(圖1d)，與預(yù)測(cè)序列結(jié)果一致。

a.M：2.0×103 Marker，1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，b. M：2.0×103 Marker； 1：凝膠回收產(chǎn)物，c. M：2.0×103 Marker，1-3：pMD19- BmHsp19.5 重組克隆，d. CDS(Coding DNA Sequence)區(qū)及相應(yīng)的氨基酸序列．圖1 家蠶BmHsp19.5電泳圖和測(cè)序序列

2.2 家蠶BmHsp19.5序列分析

利用Protparam軟件對(duì)家蠶BmHsp19.5基因所編碼的目的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，其理論相對(duì)分子質(zhì)量為1.95×104，等電點(diǎn)為5.21．不穩(wěn)定指數(shù)(II)為38.29，說(shuō)明蛋白質(zhì)穩(wěn)定．利用SignalP 4.1Server軟件分析預(yù)測(cè) BmHsp19.5 蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，可能該目的蛋白為非分泌蛋白．利用 TMHMM在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)家蠶BmHsp19.5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，可知該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。

利用SMART軟件對(duì)BmHsp19.5蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該目的蛋白65-157位氨基酸為Hsp20功能結(jié)構(gòu)域(圖2a)，故該蛋白屬于小分子熱激蛋白家族．利用ProtScale軟件對(duì)家蠶BmHsp19.5蛋白進(jìn)行蛋白親疏水性預(yù)測(cè)(圖2b)，圖2b中橫坐標(biāo)表示氨基酸序列位置； 縱坐標(biāo)表示氨基酸的標(biāo)度值； 通過(guò)標(biāo)度值判定氨基酸的親疏水性，標(biāo)度值大于0表示疏水性，標(biāo)度值小于0表示親水性．從圖2b中可知最低值為-2.522，最高值為0.989，且大部分峰值位于0值以下，該目的蛋白為親水性蛋白。

圖2 BmHsp19.5蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析(a)和蛋白的疏水性預(yù)測(cè)(b)

2.3 家蠶BmHsp19.5同源基因分析判定

使用家蠶BmHsp19.5蛋白序列在NCBI(National center for biotechnology information)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastP搜索，檢索發(fā)現(xiàn)多個(gè)鱗翅目的同源物，最終選擇6個(gè)具有代表性的序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmHsp19.5與柞蠶ApHsp19.5(GenBank登錄號(hào)：APX61064.1)、小木蠹蛾EhHsp20.1(GenBank登錄號(hào)：AYA93247.1)和東方果蛾GmHsp19.6(GenBank登錄號(hào)：AKS40076.1)的氨基酸序列相似性較高，分別為94%，93%和92%，同源性分別為83%，85%和79%．BmHsp19.5與桑螟GpHsp19.5(GenBank登錄號(hào)：QGZ00457.1)、云杉芽蟲(chóng)CfHsp19.8(GenBank登錄號(hào)：AAZ14792.1)和蘋(píng)果蠹蛾CpHsp19.8(GenBank登錄號(hào)：ADX96000.1)的氨基酸序列相似性分別為62%，50%和50%，同源性分別為48%，39%和38%．所有氨基酸序列都含有一個(gè)典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域(圖3)。

雙下劃線(xiàn)表示α-晶體區(qū)域，方框表示二聚體界面位點(diǎn)，深色區(qū)域表示高度保守的氨基酸．圖3 BmHsp19.5與其他6種同源鱗翅目昆蟲(chóng)的氨基酸序列比對(duì)

利用Mega 7.0軟件對(duì)家蠶、柞蠶、小菜夜蛾等11種不同物種的小分子熱激蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示物種序列形成兩個(gè)大的分支，其中云杉蚜蟲(chóng)單獨(dú)為一支，其他10個(gè)物種序列為一支．家蠶與黑脈金斑蝶、沙棘蛾這兩類(lèi)首先聚在一起(圖4)，然后再與親緣關(guān)系最近的柞蠶聚在一起，之后與梨小食心蟲(chóng)、夏威夷紅蛺蝶、小菜蛾等聚為一支。

圖4 BmHsp19.5與其他物質(zhì)小分子熱激蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 家蠶BmHsp19.5在蠶卵產(chǎn)后的表達(dá)分析

利用qPCR技術(shù)檢測(cè)BmHsp19.5基因在滯育卵與非滯育卵不同時(shí)期的表達(dá)量(圖5)．在滯育卵中，1～3 d呈上升趨勢(shì)，在3 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，此時(shí)胚胎形態(tài)經(jīng)歷了由產(chǎn)后第1 d梨形的頭葉分化，到第2 d胚胎明顯拉長(zhǎng)、尾節(jié)分化，在產(chǎn)后第3 d不再有明顯變化，整個(gè)滯育期保持不變進(jìn)入滯育Ⅰ期[18]．通常認(rèn)為蠶卵在產(chǎn)后2～3 d開(kāi)始進(jìn)入滯育期，由此推斷BmHsp19.5基因可能在蠶卵進(jìn)入滯育的準(zhǔn)備階段發(fā)揮了重要作用。

從圖5中我們還可以看到，BmHsp19.5基因在滯育卵的表達(dá)量顯著高于非滯育卵的表達(dá)量．在非滯育卵中產(chǎn)后1 d表達(dá)量最高，到第5 d呈持續(xù)下將的趨勢(shì)，在第6 d蠶卵點(diǎn)青的時(shí)候表達(dá)量又小幅升高，孵化前第8 d略微下降； 點(diǎn)青期蟻蠶頭部黑色素開(kāi)始附著，這時(shí)蠶體充滿(mǎn)了卵殼，為孵化做著最后的準(zhǔn)備．這期間蠶卵需氧量大幅度增加[19]，同時(shí)活性氧(ROS)含量也增加[20]，BmHsp19.5基因的小幅升高似乎與這些變化有關(guān)。

圖5 家蠶BmHsp19.5在滯育卵(a)與非滯育卵中(b)的表達(dá)量分析

3 結(jié)論與討論

根據(jù)克隆測(cè)序，我們鑒定了一個(gè)新的家蠶BmHsp19.5基因，相對(duì)分子質(zhì)量為1.95×104，預(yù)測(cè)顯示該蛋白在 65-157位氨基酸為Hsp20功能結(jié)構(gòu)域，符合小熱激蛋白家族結(jié)構(gòu)特征．同源性分析顯示該序列與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的小熱激蛋白具有較高的保守性，都含有一個(gè)典型的α-晶體區(qū)域．BmHsp19.5基因和大多數(shù)sHsp基因一樣也只有一個(gè)內(nèi)含子，前人的研究認(rèn)為由于無(wú)內(nèi)含子就可以避免 mRNA剪接過(guò)程和當(dāng)中可能出現(xiàn)的障礙，從時(shí)間上優(yōu)先于其他基因，因此有利于應(yīng)激或抗逆反應(yīng)基因的及時(shí)表達(dá)[21]．家蠶的sHsp基因sHsp19.9，sHsp20.1，sHsp20.4，sHsp20.8，sHsp21.4和sHsp23.7，僅有含有內(nèi)含子的sHsp21.4在熱激反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄物沒(méi)有增加[22]．據(jù)此我們推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中BmHsp19.5基因可能在應(yīng)急反應(yīng)和滯育發(fā)育較早時(shí)期發(fā)揮作用。

熱激蛋白的上調(diào)似乎是昆蟲(chóng)在不同滯育階段的一個(gè)共同特點(diǎn)．紅尾肉蠅Sarcophagacrassipalpis在蛹滯育期間，大部分Hsp基因會(huì)在滯育開(kāi)始階段上調(diào)表達(dá)，并將持續(xù)整個(gè)越冬期，如Hsp70A，Hsp70B，Hsp60，Hsp25，Hsp23，Hsp18，SmHsp； 利用RNAi抑制熱激蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)蛹的低溫存活能力有重要影響[23]．云杉芽蟲(chóng)中有14種sHsps基因在幼蟲(chóng)進(jìn)入滯育前、滯育中、滯育后這3個(gè)階段上調(diào)表達(dá)，如Hsp19.6和Hsp22.1基因在滯育中顯著上調(diào)表達(dá)；Hsp19.2，Hsp19.7，Hsp21.5a和Hsp24.3基因在滯育前和滯育中上調(diào)表達(dá)；Hsp20.0 和Hsp21.3基因則在整個(gè)期間持續(xù)表達(dá)[24]．sHsps常作為細(xì)胞防御的第一道防線(xiàn)，在細(xì)胞受到脅迫時(shí)，作為分子伴侶防止底物蛋白的不可逆變性，反映生物體對(duì)環(huán)境中存在的某些極端應(yīng)力的響應(yīng)[25-26]．蔥蠅Deliaantiqua的Hsp23基因在蛹滯育開(kāi)始時(shí)表達(dá)量逐漸升高，到滯育維持的中后期達(dá)到峰值，在滯育終止時(shí)降到較低水平[27]．在鹵蟲(chóng)中由于缺失小熱激蛋白p26的胚胎更容易終止滯育，因此認(rèn)為該蛋白是維持滯育所必需的[28]。

家蠶滯育卵室溫條件下產(chǎn)后48～72 h開(kāi)始進(jìn)入滯育，卵色由淡黃色逐漸變成赤豆色，胚胎形態(tài)不再變化，這個(gè)時(shí)期被稱(chēng)之為前滯育期[29]．本研究的BmHsp19.5基因在這一時(shí)期上調(diào)表達(dá)，該結(jié)果與之前轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致； 根據(jù)基因表達(dá)模式推測(cè)該基因可能參與了滯育這一生理過(guò)程，可能在蠶卵進(jìn)入滯育的準(zhǔn)備階段發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也符合越冬昆蟲(chóng)滯育期間熱激蛋白上調(diào)以抗寒這個(gè)主要特征．家蠶Hsp20.8A，Hsp70，DnaJ和Hsc71基因也是在滯育蠶卵中上調(diào)表達(dá)[30]．也有報(bào)道指出家蠶中Hsp20.4，Hsp20.8，Hsp40，Hsp70和Hsp90的 mRNA在滯育期間沒(méi)有變化[31]，在家蠶滯育卵和非滯育卵中的含量大致相同[15]．這可能是由于研究者取材時(shí)間的差異所致，同時(shí)說(shuō)明滯育引起的熱激蛋白表現(xiàn)和普通應(yīng)急反應(yīng)不同，并不是所有熱激蛋白都同時(shí)參與其中，可能通過(guò)滯育相關(guān)機(jī)制調(diào)控Hsp基因及其產(chǎn)物，在不同時(shí)間增加、減少或保持不變，從而促進(jìn)昆蟲(chóng)在逆境中生存[13，32]．因此，接下來(lái)工作的重點(diǎn)是獲得BmHsp19.5較純蛋白，進(jìn)一步明確蛋白的功能，并探究其作用機(jī)理。