肖學(xué)成，邢天嫣，曹國勝，盧 山，向 蘭

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058)

糖尿病(Diebetes mellitus， DM)是一種常見的內(nèi)分泌型代謝性疾病，無論個體處于哪種社會地位或擁有哪方國籍，鑒于目前沒有根治糖尿病的特效藥，對所有患病者來說，它對健康和壽命延長都產(chǎn)生巨大威脅.2019年全球糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫顯示，目前不完全統(tǒng)計糖尿病人數(shù)超4.5億，比加拿大和美國人口總數(shù)多出幾千萬，逼近整個歐盟人口總和，從人均角度來說，全球每10個普通人中就有一位糖尿病患者[1].隨之而來的是人類作為命運共同體必須面臨為了糖尿病所承擔(dān)的醫(yī)療開支，在2019年高達(dá)一千六百多億美金，26年后這個數(shù)值將至少增長14%，逼近兩千億美金大關(guān).除5%～10%其他類型糖尿病的病者外，其余的均為2型糖尿病[1].二型糖尿病最大的問題在于體內(nèi)缺乏胰島素分泌或由此引發(fā)胰島素不足，患者長期處于血糖在高位運行狀態(tài)，直接導(dǎo)致全身血管系統(tǒng)、神經(jīng)中樞和其他組織及器官的長期慢性損傷，最終引發(fā)功能性障礙[2-4].

目前，糖尿病的治療主要采取注射胰島素及降低血糖.用于控制血糖的一線藥物主要有二甲雙胍及利格列汀等.利格列汀(linagliptin)，化學(xué)名8-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(2-丁炔基-1)-3,7-二氫-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1H-嘌呤-2,6-二酮，可溶于水中，在甲醇和乙醇中微溶.利格列汀對DDP-4抑制作用為可逆的競爭性抑制作用[5-6]，與其他列汀類藥物相比，利格列汀對DDP-4的選擇性相較于DDP-8和DDP-9高出一萬倍以上.與其他DDP-4抑制劑相比，它對葡萄糖耐受有更持久改善[7]，且肝腎功能不全2型糖尿病患者無需調(diào)整用量[8-9].但近年來美國自發(fā)呈報系統(tǒng)AERS和WHO的VigiBase數(shù)據(jù)庫均報告口服利格列汀片劑患者對腸胃道造成損害(AERS系統(tǒng)報告胃腸副反應(yīng)占首位)[10-11]，中文說明書中禁忌癥欄未強(qiáng)調(diào)此現(xiàn)象并提醒患者關(guān)注.因此，我們考慮通過改變劑型及給藥方式來改善這些臨床上的不良反應(yīng).透皮給藥可有效避免患者因口服給藥對胃腸造成損傷，且凝膠溫和有一定緩釋作用，有利于提高患者用藥順應(yīng)度.

為提高患者用藥安全度，克服利格列汀口服片劑引起胃腸道副反應(yīng),部分高齡老年患者口服吞咽困難等缺陷[12-13]，課題組前期研究顯示利格利汀自制凝膠體外透皮有緩釋效果，因此利用高效液相色譜建立大鼠血漿中利格利汀含量測定方法，以此對比利格利汀口服和凝膠給藥半衰期和體內(nèi)的平均滯留時間，為進(jìn)一步開發(fā)利格利汀透皮制劑和臨床應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(美國天地有限公司，色譜級)，甘油、三乙醇胺、羥苯乙酯、CMC-Na、三氟乙酸、乙酸乙酯、EDTA-Na、NaOH(國藥集團(tuán)有限公司，分析級)，醫(yī)用無紡布膠帶(淄博康迪醫(yī)療器械有限公司)，醫(yī)用無菌敷貼(青島海諾生物工程有限公司)，利格利汀對照品(Polpharma，批號：101071826，純度>98%)，卡波姆980(固安希星藥業(yè)有限公司)，二乙二醇單乙醚(法國嘉法獅公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜(大連伊利特分析儀器有限公司)，離心濃縮儀(太倉市科教器材廠)，超聲波(上海波龍電子設(shè)備有限公司)，循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)，電子天平(賽多利斯北京科學(xué)儀器有限公司)，高速離心機(jī)(Thermo)，電子天平(賽多利斯北京科學(xué)儀器有限公司)，-30 ℃冰箱(中科生明科技股份有限公司)，高速離心機(jī)(美國Thermo公司)，臺式低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)，渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)

1.3 實驗動物

SD大鼠，雄性，6只，體重170 g±20 g，浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)及管理均嚴(yán)格按照實驗動物的要求及相關(guān)的浙江大學(xué)飼養(yǎng)規(guī)定.飼養(yǎng)許可證號SYXK(浙)2012-0178.

2 方法與結(jié)果

2.1 利格利汀對照品純度鑒定

取利格列汀適量配成飽和溶液，20 μL移取到干燥潔凈玻璃瓶后旋干，根據(jù)參考文獻(xiàn)用CD3OD將化合物溶解后裝核磁管送樣，將所得結(jié)果與參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[14]對比后進(jìn)行判斷，見表1.

表1 利格列汀氫譜數(shù)據(jù)分析

由上述數(shù)據(jù)可知，1H NMR圖譜中除溶劑峰外并無其他明顯雜峰，實驗中所用利格利汀對照品純度如說明書中所示，純度>98%，可用于后續(xù)的生物樣品實驗測定.

2.2 利格列汀凝膠劑的制備

根據(jù)課題組探索得到的處方，稱取1 g卡波姆980在純凈水中溶脹過夜，加入混合均勻的甘油(10.0 g)和羥苯乙酯(0.1 g).精密稱取利格利汀0.1 g溶于5.9 g二乙二醇單乙醚中.上述兩相相互混合后加入三乙醇胺適量調(diào)節(jié)pH范圍在6.0±0.5內(nèi)，加水至100 g即得.

2.3 血漿中利格利汀含量測定方法

2.3.1 色譜條件

色譜柱為H&E SP ODS-TA(4.6×250 mm)；流動相A為0.1%TFA，流動相B為甲醇∶乙腈=1∶1(A∶B=55∶45)；55%流動相A，流速1.0 mL/min；檢測波長：295 nm；進(jìn)樣量：20 μL.

2.3.2 對照品溶液的制備

精密--稱取利格列汀對照品溶液17 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得；精密量取適量上述制得液體，用甲醇定量稀釋刻度為5～1 000 ng/mL的利格列汀系列對照品溶液.

2.3.3 血漿樣品前處理

取血漿樣品0.1 mL，加入100 μL 1 M氫氧化鈉溶液，渦旋30 s，在-20 ℃冰箱凍存過夜后，加入3 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，2 500 r/min離心27 min后取上清液，離心濃縮機(jī)中旋干，取出后恢復(fù)至室溫，再用100 μL甲醇復(fù)溶，超聲10 min，2 500 r/min 離心12分鐘后取上清液20 μL進(jìn)樣.

2.3.4 方法學(xué)考察

(1)專屬性考察

分別取大鼠空白血漿、利格利汀對照品溶液、大鼠口服1 h后血漿樣品，大鼠凝膠給藥后1 h血漿樣品，按2.3.3項下方法制備樣品HPLC分析，記錄色譜圖.利格利汀保留時間約為7.6 min，大鼠口服和凝膠給藥后利格利汀保留時間也在7.6 min附近，且該色譜條件樣品峰不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，專屬性強(qiáng)(見圖1).

(2)線性回歸考察

利用2.3.2項下不同濃度對照品標(biāo)準(zhǔn)液加入0.1 mL空白血漿中，樣品處理依據(jù)2.3.3項，進(jìn)行色譜分析后得到對應(yīng)峰面積，所得回歸方程式為Y=0.0438X+0.1653(R2=0.9905)，說明血漿中利格利汀濃度在5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，線性方程滿足藥動學(xué)要求.利格利汀定量下限為5 ng/mL.

(3)精密度與準(zhǔn)確度

用大鼠空白血漿配制成10 ng/mL，100 ng/mL，1 000 ng/mL的三個高中低濃度的樣品，每個濃度含3個樣本，按照血漿樣本處理方法，連續(xù)分析三天，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算質(zhì)控樣品的濃度，并得到日內(nèi)和日間精密度及相對標(biāo)準(zhǔn)差(見表2).

表2 精密度和精確性結(jié)果

利格列汀日內(nèi)精密度在93.4～98.6%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4～9.3%內(nèi)符合標(biāo)準(zhǔn).日間精密度在92.3～101.3%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.1～8.7%范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn).上述數(shù)據(jù)說明利格利汀在血漿中用此次建立的高效液相分析方法檢測，具有良好的日內(nèi)和日間精密度和精確性.

(4)回收率

取含利格列汀三個不同濃度的血漿樣品，每個濃度6樣本分析，按2.3.3項下血漿樣品處理方法進(jìn)行分析，測定利格列汀峰面積，分別與流動相配制成的相同濃度的對照品溶液峰面積進(jìn)行對比，計算利格列汀的提取回收率(見表3).

表3 提取回收率結(jié)果(n=6)Table 3 Results of extraction recovery(n=6)

利格利汀在血漿中低、中、高濃度的樣品回收率分別是80.9%，83.1%，82.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%，2.3%，3.7%.利格利汀血漿樣品的不同濃度回收率穩(wěn)定在80.9～83.1%范圍內(nèi)，證明血漿中利格利汀樣品的處理方法穩(wěn)定性良好.

(5)穩(wěn)定性

根據(jù)利格列汀特性，將含有利格列汀的三個梯度濃度的血漿樣品，每個濃度6個樣本分析，進(jìn)行室溫(25 ℃)、冰凍(-20 ℃)和凍融條件下穩(wěn)定性考察，確定利格列汀血漿樣品存放條件(見表4).

表4 穩(wěn)定性結(jié)果(n=6)

在室溫條件下利格利血漿樣品在室溫下存放24 h內(nèi)和在-20 ℃冰箱內(nèi)凍存15天利格利汀穩(wěn)定性好，未見明顯含量下降.3次凍融后利格列汀含量在血漿中保持穩(wěn)定.血漿中利格利汀回收率范圍在93.4±2.3%～102.1±5.3%內(nèi).

2.4 大鼠血漿藥代動力學(xué)參數(shù)

2.4.1 給藥方案和血樣采集

將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，口服給藥組(n=3)灌胃利格列汀1%CMC-Na懸溶液，劑量10 mg/kg，在0、0.5、1、1.5、2、4、6、12、24、48 h眼眶取血0.5 mL，置EDTA-Na抗凝管中，1.2×1 000 rpm離心15 min分離血漿，于-20 ℃保存至分析測定.

凝膠透皮給藥組(n=3)大鼠剃毛皮膚裸露后，在背臀部給予利格列汀凝膠(含量為100 g中有100 mg利格列汀原料藥)，給藥劑量為10 mg/kg，給藥面積(3 cm×4 cm)，給藥區(qū)域鼠皮表面，用敷貼后再加膠帶纏繞三圈，48 h實驗結(jié)束后除去外敷材料.經(jīng)皮給藥前取血點命名為T0，之后0.5、1、1.5、2、4、6、12、24、48 h眼眶取血0.5 mL，毛細(xì)管引流后注入含有EDTA-Na 的1.5 ml的離心管中.

口服組和凝膠組所得血樣靜置40 min后，1.2×1000 rpm離心15 min，分離血漿，精密移取100 μL血漿至5 mL離心管中，放入-20 ℃冰箱凍存.分析前按2.3.3項對樣品處理后進(jìn)樣,記錄相關(guān)數(shù)據(jù).

2.4.2 大鼠口服利格列汀藥代動力學(xué)

大鼠單次給藥灌胃劑量為10 mg/kg，測定的利格利汀血藥濃度-時間曲線如圖2所示，根據(jù)各時間點對應(yīng)的血藥濃度折線圖可知，在口服利格列汀0～1.5 h之間血藥濃度迅速上升，2 h后利格利汀血藥濃度快速下降，10 h后血藥濃度逐漸趨于平穩(wěn)，至48 h在體內(nèi)仍能檢測到血漿中含有的利格利汀.

圖2 利格利汀血藥濃度時間曲線(口服組)

利用PKsolver 2.0軟件(中國藥科大學(xué))[15]，采用非房室模型擬合大鼠單次口服利格利汀血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，計算得到相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)見表5.

表5 大鼠(n=3)口服組主要藥動學(xué)參數(shù)

如表5中所示，3只大鼠最大血藥濃度Cmax為983.212±32.263 ng/mL, AUC(0-t)為5 731.935±265.959 ng/mL*h，AUC(0-inf)為7 407.036±594.139 ng/mL*h，t1/2為29.077±4.847 h，MRT為30.415±5.310 h.

根據(jù)利格利汀口服給藥數(shù)據(jù)，說明在2小時內(nèi)藥物被動物吸收，但根據(jù)MRT數(shù)據(jù)說明體內(nèi)消除時間較長.

2.4.3 大鼠透皮(凝膠)利格列汀藥代動力學(xué)

大鼠單次凝膠給藥劑量為10 mg/kg，測定的利格利汀血藥濃度-時間曲線如圖3所示，根據(jù)各時間點對應(yīng)的血藥濃度折線圖可知，在口服利格列汀0～1.5 h之間血藥濃度迅速上升，1.5～10 h間利格利汀血藥濃度快速下降，10 h后血藥濃度逐漸趨于平穩(wěn)，至48 h在體內(nèi)仍能檢測到血漿中含有的利格利汀.

圖3 利格利汀血藥濃度時間曲線(凝膠組)Fig.3 Linagliptin concentration-time curve( gel group )

利用PKsolver 2.0軟件(中國藥科大學(xué))，采用非房室模型擬合大鼠單次口服利格利汀血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，計算得到相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)見表6：

表6 大鼠(n=3)凝膠組主要藥動學(xué)參數(shù)

如表6中所示，3只大鼠最大血藥濃度Cmax為863.011±66.053 ng/mL, AUC(0-t)為4362.826±142.086 ng/mL*h，AUC(0-inf)為5655.167±273.662 ng/mL*h，t1/2為31.231±4.197 h，MRT為31.370±4.282 h.

3 討論

此次結(jié)合文獻(xiàn)優(yōu)化出一種檢測血漿中利格列汀的HPLC方法，且100 μL血漿用量少對動物傷害較小，采用乙酸乙酯作為萃取溶劑，同時加入1M 氫氧化鈉使血漿堿化，提升了利格列汀回收率≥ 80.9 %，在選定的295 nm下無明顯干擾峰.利格列汀血漿檢測時先用HPLC收集目標(biāo)峰，再用LC-MS 295 nm下確認(rèn)其分子量，該外標(biāo)法測定利格利汀在血漿中藥物濃度流程簡潔[16-17]，且相關(guān)參數(shù)滿足藥動學(xué)參數(shù)要求[18].

由2.4項藥代動力學(xué)實驗結(jié)果可看出，利格利汀凝膠經(jīng)皮給藥，血漿中達(dá)峰時間與口服一致，但半衰期較口服組長約2小時，MRT比口服延長約1小時，說明利格利汀凝膠組在體內(nèi)吸收與常規(guī)給藥相似，但消除稍慢，可能是凝膠在角質(zhì)層或真皮層形成藥物儲庫，使得利格列汀藥物在皮內(nèi)一定深度緩慢釋放.其一，針對這一現(xiàn)象，需要進(jìn)一步利用熒光標(biāo)記等技術(shù)探索藥物確切的積蓄部位，同時著手對動物皮膚組織進(jìn)行生理學(xué)解剖，觀測一段時間內(nèi)積蓄藥物對皮膚組織產(chǎn)生的影響，比如因積蓄引發(fā)病變.其二，鑒于MRT時間延長，需要對動物體內(nèi)各組織中利格利汀濃度進(jìn)行檢測，尤其是腦、脾、心臟、肺、肝、腎、胃、小腸等組織，探索利格利汀凝膠給藥后在各組織分布與口服的差異.其三，根據(jù)上述結(jié)果，需要進(jìn)一步研究利格列汀在劑型改變導(dǎo)致體內(nèi)半衰期延長后，降糖效果是否與普通口服給藥一致.若藥效差異化較大，在保持緩釋優(yōu)勢的前提下，應(yīng)考慮進(jìn)一步優(yōu)化處方.以期能減少患者給藥頻率，提升順應(yīng)性降低患者用藥方面的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).