汪 輝，田浩琦，向 上，雷俊鋒，周青平

(西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041)

自上世紀(jì)90年代初以來，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等新學(xué)科在生命科學(xué)領(lǐng)域逐漸涌現(xiàn)并得到了快速發(fā)展.表型是由基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，通過表型組學(xué)研究獲取多尺度、多生境、多源異構(gòu)表型數(shù)據(jù)，可為研究基因型、環(huán)境因子和表型之間的聯(lián)系提供有力依據(jù)，其與以上各組學(xué)相結(jié)合應(yīng)用于復(fù)雜的系統(tǒng)生物學(xué)研究已成為熱點[1].植物表型組學(xué)是基于基因組水平系統(tǒng)研究植物在不同生長環(huán)境下所有表型的學(xué)科，可為植物育種、栽培和生產(chǎn)的關(guān)鍵性狀獲取提供基于大數(shù)據(jù)的決策支持.在植物基因組學(xué)研究過程中，使用傳統(tǒng)人工手段獲取植物生物量、根系形態(tài)、葉部特征、產(chǎn)量組分特征等表型特征，因使用儀器多、檢測速度慢、耗時費力、有損操作、環(huán)境條件等，成為制約作物功能研究的環(huán)節(jié).1996年，Steven A. Garan提出了表型組學(xué)的概念，隨后被用于作物生產(chǎn)中的資源產(chǎn)量估算[2-4]、根系表型測量[5]、病蟲害防控[6-7]、養(yǎng)分豐缺診斷[8]、雜草識別[9-10]、抗逆性評價[11-12]、種子表型測量[13-14]等方面.數(shù)字圖像技術(shù)的發(fā)展為開展植物表型組學(xué)研究提供有效途徑.目前，可見光成像、近紅外成像、多光譜成像技術(shù)、高光譜成像、熱成像、熒光成像等二維成像技術(shù)以及激光雷達(dá)成像、計算機斷層掃描成像磁共振成像等三維成像技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)無損、連續(xù)、高效、自動、高通量采集植物表型特征[15-16].根據(jù)應(yīng)用場景不同，以上成像技術(shù)可搭載傳送式、軌道式、行走式、無人機等載體實現(xiàn)溫室和田間植物表型特征數(shù)據(jù)采集.植物表型組學(xué)研究是突破未來作物學(xué)研究的關(guān)鍵領(lǐng)域，聚焦主要作物關(guān)鍵生產(chǎn)性狀的高效篩選、監(jiān)測、估算是實現(xiàn)高產(chǎn)栽培、保障食物供應(yīng)的途徑之一.

紫花苜蓿因其適應(yīng)性強、牧草品質(zhì)優(yōu)，在全球范圍內(nèi)種植面積較大.建立快速、無損、高準(zhǔn)確度的估算紫花苜蓿地上部分生物量的方法對于未來研究其表型特征、生長特性具有重要的價值.本研究選擇國內(nèi)外6個紫花苜蓿品種作為供試材料，通過使用表型分析儀拍攝其不同供水條件、不同生長階段單個植株的頂視、側(cè)視、正視二維RGB圖像，旨在選擇適宜參數(shù)，建立準(zhǔn)確度較高的估算紫花苜蓿幼苗生物量的預(yù)測模型，以豐富牧草地上部分生物量評價方法.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選取6個國內(nèi)外紫花苜蓿品種，供試種子來源見表1.

表1 供試紫花苜蓿品種種子來源

1.2 試驗設(shè)計

2020年5月25日在西南民族大學(xué)四川省抗逆牧草種質(zhì)創(chuàng)新及生態(tài)修復(fù)工程實驗室植物培養(yǎng)室播種6個品種紫花苜蓿種子，5月30日出苗，出苗后15天分栽至塑料盆(直徑15 cm，重0.075 kg)中，每盆一株，阿爾岡金和甘農(nóng)5號每個品種20盆，其余品種每個品種12盆.每盆裝營養(yǎng)土與蛭石1:1混合土0.325 kg，混合土原始含水量為33.8%.每天通過稱重法補充各盆水量，每盆澆水至0.56 kg，出苗后第30天開始對阿爾岡金和甘農(nóng)5號2個品種其中8盆進(jìn)行干旱脅迫，每盆澆水至0.40 kg.出苗后第30、40、50天(分別縮寫為30 d、40 d、50 d)使用Lab Scananlyzer表型分析儀(德國，LemnaTec GmbH)對紫花苜蓿植株進(jìn)行拍照，每個處理重復(fù)4次.

1.3 指標(biāo)測定

每次拍照后，使用卷尺量取每盆培養(yǎng)土面至植株自然垂直高度，記為株高；將每盆植株地上部分為莖部和葉部，分別稱重，記為莖鮮重、葉鮮重；將莖部和葉部鮮樣放入鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃殺青30 min，65 ℃烘至恒重，稱量，記為莖干重、葉干重.

1.4 圖片數(shù)據(jù)分析

采集每盆植株表型時，使用Lab Scananlyzer表型分析儀頂視相機和側(cè)視相機拍攝照片，然后水平移動植株90°，再使用側(cè)視相機拍攝照片，即為正視(圖1).使用自帶軟件獲取相應(yīng)表型指標(biāo)頂視面積、側(cè)視面積、正視面積、最小外接圓直徑，按照以下公式[17]計算綠色面積(Green area)，并使用每個最小外接圓直徑值和綠色面積值分別除以其中最大值，求得相對最小外接圓直徑和相對綠色面積(Relative green area).

圖1 使用Lab Scananlyzer表型分析儀所拍攝的頂視、側(cè)視和正視圖片F(xiàn)ig. 1 Images taken using the top, side and front camera of the Lab Scananlyzer

綠色面積2=(頂視面積2+側(cè)視面積2+正視2)

(1)

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計分析軟件R(版本3.3.2)分析供試紫花苜蓿品種株高、莖鮮重、葉鮮重、總鮮重、莖干重、葉干重、總干重等指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)、最大值、最小值、平均值、變異系數(shù)(CV).使用Excel(版本2010)繪制株高與最小外接圓直徑、總鮮重與相對綠色面積、總干重與相對綠色面積、預(yù)測總干重與總干重散點圖及線性相關(guān)擬合直線.其中，使用WL343、阿爾岡金、甘農(nóng)3號和甘農(nóng)5號的莖鮮重、葉鮮重、總鮮重、莖干重、葉干重、總干重等指標(biāo)與相對綠色面積訓(xùn)練線性模型，并使用WL319和馴鹿的數(shù)據(jù)驗證所擬合的線性模型，并使用以下公式計算真實值與預(yù)測值擬合模型的決定系數(shù)R2、均方根誤差(Root mean square error，RMSE)、相對誤差(Relative error, RE).

(2)

(3)

(4)

2 結(jié)果分析

供試紫花苜蓿品種的葉干重、莖稈重和總干重具有較高變異，變異系數(shù)分別為54.887%、54.695%和52.844%，其中總干重為0.111～1.305 g/株(表2).株高的變異系數(shù)較低，為23.399%，株高為19.0～55.5 cm.

表2 株高及生物量統(tǒng)計分析描述

對6個紫花苜蓿品種3個生長階段的株高與相對最小外接圓直徑作線性相關(guān)分析，出苗后30、40、50天植株株高和總數(shù)據(jù)與相對最小外接圓直徑相關(guān)系數(shù)分別為0.51、0.61、0.72和0.55，均達(dá)到顯著水平(圖2).

圖2 株高與相對最小外接圓直徑線性相關(guān)分析

葉鮮重、莖鮮重、總鮮重、葉干重、莖干重和總干重等生物量指標(biāo)均與相對綠色面積有較強的線性相關(guān)關(guān)系，均達(dá)到極顯著水平(表3).其中，相對綠色面積與出苗后30、40、50天和總數(shù)據(jù)的總鮮重的相關(guān)系數(shù)分別為0.79、0.92、0.83和0.88，與總干重的相關(guān)系數(shù)分別為0.69、0.86、0.82、0.84.

表3 生物量指標(biāo)與相對綠色面積線性相關(guān)的相關(guān)系數(shù)

將6個品種中WL343、阿爾岡金、甘農(nóng)3號和甘農(nóng)5號等4個品種生物量指標(biāo)數(shù)據(jù)用于建模，剩下的WL319和馴鹿的數(shù)據(jù)用于驗證模型精度，并使用R2、RMSE和RE進(jìn)行精度評定(表4).其中，相對綠色面積估算莖干重的模型精度最高，R2為0.82，RMSE為0.06 g，RE為25.2%.使用相對綠色面積估算總鮮重的模型R2為0.78，關(guān)系為y=4.4826x+0.6128；用于估算總干重的R2為0.75，關(guān)系為y=1.2184x+0.069(其中y為總鮮重或總干重，x為相對綠色面積，圖3).實測總鮮重和總干重均分別與估算總鮮重和總干重之間具有較高一致性(圖4).

表4 相對綠色面積預(yù)測生物量指標(biāo)的線性模型驗證Table 4 Validation of linear model for estimating biomass parameters using relative green area

圖3 相對綠色面積預(yù)測總鮮重(A)和總干重(B)的線性模型

圖4 總鮮重和總干重預(yù)測值與真實值比較

3 討論

在分析植物功能生態(tài)和長勢時，生物量是最為重要的指標(biāo)之一，同時也是研究植物異速生長關(guān)系中的關(guān)鍵參數(shù)[18-19].地上部分生物量是在植物某一生育時期測定的所有地上部分的總重量.反復(fù)測量植物地上部分生物量是研究植物初級生產(chǎn)和生長速率的基本工作，尤其是在研究以收獲營養(yǎng)枝為目的牧草生產(chǎn)過程中的一項重要工作.通常情況下，測定植物地上部分生物量是在確定留茬高度后，刈割并稱量鮮重或者是使用烘箱烘干后測定干重.刈割、稱量、烘干等過程需要花費大量的時間和人力，尤其是在研究植物生物量分布、適應(yīng)性評價和異速生長時，需要測定大量植株個體數(shù)據(jù)[20].并且這種有損測量生物量的方法是無法實現(xiàn)監(jiān)測同一植株個體的整個生長動態(tài)過程.本研究使用LabScananlyzer表型分析儀可實現(xiàn)連續(xù)、無損監(jiān)測同一株紫花苜蓿植株的生長過程.

目前，已有一些研究報道了無損測定植物生物量的方法，例如使用植物表型分析儀拍攝數(shù)碼照片并使用相應(yīng)軟件分析圖片數(shù)據(jù)，計算葉面積、投影面積[21-23]或者單子葉植物的多邊形面積[24-25]，最后估算植物生物量，該方法快速、精準(zhǔn)、無損.本研究已證實，通過使用相機拍攝紫花苜蓿植株的RGB圖像，獲取植株的頂視面積、側(cè)視面積、正視面積，計算得到的相對綠色面積與植株莖或者葉片的鮮重、干重之間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系.同樣，使用無損技術(shù)可以可靠的估算擬南芥[26]、煙草[27]、土豆[28]、麥類作物[29-30]和豌豆[17]的地上部分鮮重或者干重，且數(shù)字面積(Digital area)和地上部分生物量之間的相關(guān)程度較高.然而，植株葉片重疊、卷曲、皺縮以及旋轉(zhuǎn)運動等現(xiàn)象會影響數(shù)字面積的準(zhǔn)確測定，尤其是使用只具有一個相機的表型分析儀拍攝照片測定數(shù)字面積時，誤差更大.當(dāng)使用頂視相機獲取植物照片估算擬南芥農(nóng)藝性狀時，無法應(yīng)用到估算垂直生長相關(guān)的指標(biāo)[23]，增加側(cè)視相機可以解決該問題.Golzarian等[29]通過使用表型分析儀拍攝小麥和大麥植株正視、側(cè)視和頂視二維圖像，建立線性預(yù)測模型，可地上生物量能夠得到準(zhǔn)確預(yù)測鹽脅迫下單個植株的地上部分生物量.本研究中使用的表型分析儀同時安裝有頂視和側(cè)視2個相機，可以降低系統(tǒng)誤差，較準(zhǔn)確地估算地上部生物量.

4 結(jié)論

使用Lab Scananlyzer表型分析儀拍攝紫花苜蓿幼苗不同生長階段RGB圖像，并從圖像中提取的最小外接圓直徑與幼苗株高之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)線性關(guān)系，從頂視、側(cè)視和正視圖像中提取綠色面積，經(jīng)計算得到的相對綠色面積與莖或葉片鮮重及干重之間存在顯著的正相關(guān)線性關(guān)系，可用于無損估算紫花苜蓿地上部分生物量.