劉 怡，陳敏琪，張 翼,3，千忠吉,3

海洋土曲霉C23-3代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的活性機(jī)制

劉 怡1，陳敏琪2，張 翼2,3，千忠吉1,3

（廣東海洋大學(xué)1.化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 / 2.食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120）

【目的】探究海洋土霉菌代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A（EAA）對(duì)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生的作用?！痉椒ā坑肅CK法檢測(cè)細(xì)胞活力，DCFH-DA法測(cè)定活性氧（ROS）的含量，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成管能力，酶聯(lián)免疫吸附法ELISA試劑盒檢測(cè)LOX-1和VEGF蛋白表達(dá)情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)MAPK通路、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的蛋白的表達(dá)情況，分子對(duì)接模擬EAA與LOX-1蛋白的相互作用?！窘Y(jié)果】CCK法證明EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用（> 0.05）；與空白組相比，EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞的遷移和血管生成起到顯著抑制作用（< 0.001）；與對(duì)照組相比，隨著實(shí)驗(yàn)組EAA濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著減少（< 0.001），LOX-1、VEGF、MAPK通路蛋白p38、JNK、ERK的磷酸化和ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)也顯著降低（< 0.001）；此外EAA能與LOX-1形成穩(wěn)定的相互作用。【結(jié)論】EAA能清除ROS，抑制HUVEC細(xì)胞炎性因子的表達(dá)和血管生成。

土曲霉；代謝產(chǎn)物；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；血管生成；抗炎；氧化型低密度脂蛋白

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosc1erosis，As）是一種炎癥性心血管疾病，是引起冠心病、腦梗死、血栓塞性疾病等多種疾病主要原因[1]。其典型特征之一是斑塊內(nèi)氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL）的積累，這些脂蛋白可通過(guò)特定受體，即凝集素型氧化LDL受體(LOX-1)[2]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量積累，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和凋亡。由ox-LDL引起的AS主要由內(nèi)皮受體LOX-1介導(dǎo)，而LOX-1過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致內(nèi)皮激活和損傷[3]，同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)AS疾病中的斑塊形成[4]。研究表明[5]，低氧環(huán)境對(duì)AS疾病發(fā)展有促進(jìn)作用，使低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的蛋白表達(dá)增加，而后能對(duì)VEGF的蛋白分泌激活誘導(dǎo)，從而刺激其生長(zhǎng)最終導(dǎo)致血管新生[6]。VEGF作為主要的一種人體內(nèi)血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，是促進(jìn)血管新生被研究最多的關(guān)鍵蛋白[7]。血管生成在AS疾病進(jìn)展中有重大意義，缺氧和炎癥狀態(tài)會(huì)使血管生成和炎癥因子過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)AS病變區(qū)域的斑塊發(fā)展，穩(wěn)定性降低，從而引起斑塊出血、破裂或其他病變衍生[8]。AS同時(shí)會(huì)引起VEGF下游通路MAPKs的過(guò)表達(dá)[9]，也會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞血管新生因子和包括黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）的過(guò)度表達(dá)[10]，又會(huì)引起進(jìn)一步刺激血管新生因子和炎癥因子，激發(fā)正反饋機(jī)制，動(dòng)脈粥樣硬化中形成不穩(wěn)定斑塊，出血或破裂后造成急性冠狀動(dòng)脈綜合征[11-12]。但目前已有抗血管生成藥物在臨床應(yīng)用中副作用極大[13-14]。因此，需要找到更好應(yīng)用于抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管生成特效藥物。

近年來(lái)對(duì)內(nèi)生真菌和海洋真菌的研究越來(lái)越多，這些真菌為篩選新的高活性低毒性天然產(chǎn)物提供了一線(xiàn)希望[15]。epi-aszonalenin A（EAA）是一種從廣東徐聞的牡丹珊瑚()內(nèi)分離的土曲霉C23-3代謝產(chǎn)物。海洋真菌土曲霉C23-3(GDMCC No.60316)采自徐聞珊瑚自然保護(hù)區(qū)，現(xiàn)保存于廣東省微生物菌種保藏中心。土曲霉()屬于子囊菌門(mén)內(nèi)，是廣泛存在于海洋和陸地的一種真菌[16]。

有許多研究發(fā)現(xiàn)并證明土曲霉衍生化合物具有抗炎、抗氧化活性[17-18]，但是未見(jiàn)關(guān)于抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性成果報(bào)道。生物堿EAA目前為止也未見(jiàn)研究報(bào)道，是一種未被開(kāi)發(fā)活性的潛在可利用生物堿。因此，本研究以抗動(dòng)脈粥樣硬化疾病中斑塊病變的方向來(lái)研究EAA的抗炎、抗血管生成作用機(jī)制，從而為海洋土曲霉代謝產(chǎn)物在海洋藥物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC（蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；低密度脂蛋白o(hù)x-LDL（上海源葉生物科技有限公司）；LOX-1 ELISA試劑盒、VEGF ELISA試劑盒（武漢酶免生物科技有限公司）；小鼠多克隆抗體p38(sc-535)、p-p38(sc-166182)、JNK(sc-7345)、p-JNK(sc-6254)、ERK(sc-94)、p-ERK(sc-81492)、ICAM-1(sc-107)、VCAM-1(sc-13106)、羊抗鼠IgG-HRP(sc-2005)（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology）。

酶標(biāo)儀（Bioteck儀器公司）；顯微鏡（廣州吉迪有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Bioteck儀器公司）；小型垂直電泳槽和電轉(zhuǎn)槽（Bio-Rad公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土曲霉代謝物提取與分離 土曲霉C23-3菌株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)中在1 L燒瓶中在28℃、150 r/min的搖床上發(fā)酵7 d。完成后，將培養(yǎng)物過(guò)濾，分離出上清液和菌絲體，分別用乙酸乙酯和乙酸乙酯加氯仿-甲醇（體積分?jǐn)?shù)1∶1），混合液提取。合并兩種提取物并真空濃縮成粗提取物。該提取物在Sephadex LH-20柱上分離，用氯仿-甲醇（體積分?jǐn)?shù)1∶1）洗脫，得到不同餾分。Fr6通過(guò)Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化，由甲醇洗脫，然后通過(guò)制備型RP-18 HPLC以體積分?jǐn)?shù)70∶30甲醇-水洗脫，得到純化合物epi-aszonalenin A[19]。

Epi-aszonalenin A, 白色無(wú)定型粉末，1H結(jié)果(CDCl3):H6.04 (1H, s, H-2)，7.32 (1H, dd,= 7.4, 1.8 Hz, H-5)，7.10 (1H, m, H-6), 7.20 (1H, m, H-7)，7.84 (1H, m, H-8)，3.05 (1H, d,=13.1 Hz, H-10a)，2.49 (1H, dd,= 13.1, 9.7 Hz, H-10b)，4.02 (1H, d,= 9.7 Hz, H-11)，6.75 (1H, d,= 8.0Hz, H-15)，7.39 (1H, td,= 7.2, 1.4 Hz, H-16)，7.20 (1H, m, H-17)，7.98 (1H, d,= 7.0Hz, H-18)，5.81 (1H, dd,= 17.4, 10.9Hz, H-23)，5.10 (1H, d,= 17.4 Hz, H-24)，5.07 (1H, d,= 10.9 Hz, H-24)，1.11 (3H, s, H-25)，0.88 (3H, s, H-26)，2.66 (3H, s, H-28) (1)，分子質(zhì)量為415 u。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞在Eagle DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清（FBS）和體積分?jǐn)?shù)1％青霉素-鏈霉素，并在含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中恒溫37 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞接種在96孔板中培養(yǎng)，生長(zhǎng)穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設(shè)置為0、1、5和10 μmol/L。繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄其上清，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞后加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的值并記錄分析。

1.2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞接種在24孔板上培養(yǎng)，生長(zhǎng)穩(wěn)定后用200 μL的槍頭在孔板中劃出邊緣整齊的傷口，用PBS溶液去除細(xì)胞碎片后，生長(zhǎng)穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設(shè)置為0、1和10 μmol/L。分別于0、12 和24 h用顯微鏡對(duì)細(xì)胞向創(chuàng)面邊緣遷移的情況進(jìn)行拍照并記錄分析。

1.2.4 Western blot 將HUVEC細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，生長(zhǎng)穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設(shè)置為0、1和10 μmol/L。1 h后加入10 μL的Ox-LDL（50 μg/mL）。設(shè)置空白組和陽(yáng)性對(duì)照組，空白組中不加EAA和ox-LDL，陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA。培養(yǎng)24 h后棄其上清后，加入適量裂解液，將用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞掛下，并在12 000 r/min，4℃離心15 min取上清液。BCA蛋白定量，并調(diào)整各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE電泳后，根據(jù)蛋白分子大小將凝膠分切，置于NC膜上通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白印跡轉(zhuǎn)移，在體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶中封閉2 h，用TBST清洗條帶3次，每次10 min。分別加入對(duì)應(yīng)的一抗溶液常溫孵育4 h，用TBST清洗條帶3次后加入對(duì)應(yīng)的二抗溶液常溫孵育2 h后再次清洗。利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯色觀(guān)察并拍照記錄。分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積、寬度和灰度值，做統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附 通過(guò)ELISA試劑盒測(cè)定HUVEC細(xì)胞中LOX-1蛋白的表達(dá)量。將HUVEC細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，生長(zhǎng)穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設(shè)置為0、1和10 μmol/L。1 h后加入10 μL的Ox-LDL（50 μg/mL）。設(shè)置空白組和陽(yáng)性對(duì)照組，空白組不加EAA和ox-LDL，陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA。棄其上清后，加入PBS溶液，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞掛下，細(xì)胞懸浮液收集于無(wú)菌試管中反復(fù)凍融裂解蛋白后，12 000 r/min，4℃離心15 min得上清液，再根據(jù)試劑盒中的方案分析LOX-1蛋白的表達(dá)量。

1.2.6 血管生成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)所用槍頭和96孔板進(jìn)行?20 ℃預(yù)冷，在冰上每孔加入60 μL基質(zhì)膠，放入培養(yǎng)箱中靜置30 min。將HUVEC懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀確定最終所需濃度（1 × 106cell/mL）后，每孔共加入EAA（0、1和10 μmol/L）和細(xì)胞懸液混合液200 μL，并設(shè)置一組陽(yáng)性對(duì)照組，加入10 μLOx-LDL（50 μg/mL）。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后用顯微鏡拍照記錄。

1.2.7 ROS分析 將HUVEC細(xì)胞接種于24孔板中。生長(zhǎng)穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設(shè)置為0、1和10 μmol/L。1 h后加入10 μL的Ox-LDL（50 μg/mL）。設(shè)置空白組和陽(yáng)性對(duì)照組，空白組中不加EAA和ox-LDL，陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖溶液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入200 μL DCFH-DA試劑(10 μmol/L)后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。于熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察并拍照記錄分析。

1.2.8 分子對(duì)接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0畫(huà)出化合物EAA的結(jié)構(gòu)（圖1），然后用ChemBio3D Ultra 14.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體（LOX-1）的三維結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)下載得到，選取LOX-1與其抑制劑Dioxane共晶的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID: 1YPQ）作為本課題對(duì)接所用的蛋白。LOX-1和化合物EAA均使用AutodockTools 1.5.6[20]轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。本研究采用Autodock vina 1.1.2[21]進(jìn)行分子對(duì)接研究。根據(jù)配體Dioxane位置，確定LOX-1活性位點(diǎn)的坐標(biāo)為：center_= 10.008，center_= 5.816，center_= 20.360；size_= 20，size_= 20，size_= 20。為增加計(jì)算準(zhǔn)確度，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為100。除特別說(shuō)明，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用PyMoL 1.7.6進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Image J、Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及制圖。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA分析）。與對(duì)照組相比，< 0.05代表有差異，< 0.01代表差異顯著，< 0.001代表差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞活力的影響

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)EAA濃度為1、5和10 μmol/L時(shí)，與同條件下空白組相比，HUVEC的細(xì)胞活性均無(wú)顯著差異（> 0.05）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明濃度為0～10 μmol/L的EAA對(duì)HUVEC在無(wú)細(xì)胞毒性作用，該濃度范圍可進(jìn)行后續(xù)活性探究，因此后續(xù)選用低濃度1 μmol/L和高濃度10 μmol/L進(jìn)行活性研究。

2.2 EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞中LOX-1和VEGF蛋白表達(dá)的影響

由圖3、4可見(jiàn)，Ox-LDL可顯著性誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞中受體蛋白LOX-1和血管生成關(guān)鍵蛋白VEGF的表達(dá)（< 0.01），而當(dāng)EAA濃度為1、10 μmol/L時(shí)可以有效對(duì)其表達(dá)起到抑制作用（< 0.001），并且高濃度組的實(shí)驗(yàn)組抑制效果顯著。因此可推論，EAA以劑量依賴(lài)方式減少HUVEC細(xì)胞中LOX-1和VEGF蛋白的表達(dá)及抑制Ox-LDL對(duì)細(xì)胞的影響。

陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對(duì)照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對(duì)照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.3 EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞中ROS活性氧的影響

由圖6可見(jiàn)AA濃度為0 μmol/L時(shí)，熒光較少，而與空白組相比ox-LDL組顯著誘導(dǎo)了HUVEC細(xì)胞的ROS水平（<0.001）。當(dāng)EAA濃度為1、10 μmol/L時(shí)可有效對(duì)ROS的產(chǎn)生起到抑制作用（<0.001），且高濃度組的實(shí)驗(yàn)組抑制效果顯著。該結(jié)果表明高濃度ETT以劑量依賴(lài)方式顯著減輕了HUVEC中的ROS產(chǎn)生。

圖5 HUVEC的ROS熒光圖

陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對(duì)照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.4 EAA 對(duì)HUVEC細(xì)胞的遷移的影響

根據(jù)圖8的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，當(dāng)EAA濃度為1、10 μmol/L時(shí)可以有效對(duì)細(xì)胞遷移起到抑制作用（< 0.001），并且高濃度組的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移被抑制的效果顯著。根據(jù)12 h和24 h的對(duì)比可見(jiàn)，抑制效果可持續(xù)24 h，且效果隨時(shí)間呈正比。結(jié)果表明EAA在細(xì)胞水平上具有抑制HUVEC細(xì)胞的遷移作用且是以劑量依賴(lài)的方式。

2.5 EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞血管形成的影響

根據(jù)圖9的血管形成實(shí)驗(yàn)圖分析，EAA濃度為0 μmol/L時(shí)，HUVEC呈連接網(wǎng)狀較多，而對(duì)照組中Ox-LDL顯著性誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的血管形成，細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)密集。EAA實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞集合明顯少于空白組和對(duì)照組，HUVEC細(xì)胞主要呈單一分散排布的狀態(tài)。該結(jié)果表明EAA以劑量依賴(lài)的方式抑制HUVEC細(xì)胞血管形成。

圖7 EAA的細(xì)胞劃痕圖片

與空白組相比,* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

圖9 EAA對(duì)HUVEC的血管生成影響

2.6 EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞中MAPK通s路表達(dá)影響

由圖10和11免疫印跡條帶結(jié)果分析，Ox-LDL可顯著誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞MAPK通路蛋白的表達(dá)（<0.01），當(dāng)EAA的濃度為1、10 μmol/L時(shí)可以有效對(duì)p38、JNK和ERK的磷酸化起到抑制作用（<0.001），并且高濃度組的實(shí)驗(yàn)組抑制效果顯著。因此可推論，EAA以劑量依賴(lài)的方式減少HUVEC細(xì)胞中MAPK通路蛋白的表達(dá)及抑制其活性以達(dá)到抑制細(xì)胞遷移生長(zhǎng)的作用。

“－”表示不添加，“＋”表示添加

陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對(duì)照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.7 EAA對(duì)HUVEC細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響

由圖12和13的蛋白免疫印跡條帶結(jié)果分析，Ox-LDL可顯著誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)（<0.01），當(dāng)EAA濃度為1、10 μmol/L時(shí)可以有效對(duì)ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)起到抑制作用（<0.001），并且高濃度實(shí)驗(yàn)組抑制效果顯著。因此可推論，EAA以劑量依賴(lài)的方式減少HUVEC細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)以達(dá)到抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成作用。

“－”表示不添加，“＋”表示添加

陽(yáng)性對(duì)照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對(duì)照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.8 EAA與LOX-1分子模擬對(duì)接

為從分子水平闡明LOX-1與化合物EAA的作用模式，將化合物EAA對(duì)接至LOX-1的活性口袋，其親和力為-26.37 kJ/mol，理論結(jié)合模式如圖14和15所示。由圖14可以看出，化合物EAA的活性口袋中呈現(xiàn)出緊湊的結(jié)合模式。EAA處于一個(gè)由氨基酸Asp-147、Trp-148、Leu-157、Phe-158、Ser-159、Ser-160、Leu-175、Gln-193和Tyr-197所組成的腔袋，形成強(qiáng)烈的疏水性相互作用（圖15）。EAA的可以與氨基酸Phe-158形成長(zhǎng)為5.3×10-10m的氫鍵作用（圖15），這是EAA和LOX-1之間最主要作用力。

圖14 EAA對(duì)接至LOX-1的活性口袋的整體圖

圖15 EAA對(duì)接至LOX-1的活性口袋的細(xì)節(jié)圖

總之，上述的分子對(duì)接研究對(duì)EAA和LOX-1的相互作用給予了合理的解釋?zhuān)瑸檫M(jìn)一步研究LOX-1抑制劑奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，主要涉及內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、脂質(zhì)代謝和血管平滑肌肉細(xì)胞（VSMC）。而在這些因素中，血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）損傷是動(dòng)脈粥樣硬化病變開(kāi)始的早期步驟[22]。Ox-LDL通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和進(jìn)展，包括誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞和破壞抗氧化能力[2]。因此，本研究以O(shè)x-LDL處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，研究EAA抗動(dòng)脈粥樣硬化疾病中血管生成病變的作用機(jī)制。有研究表明，LOX-1是Ox-LDL主要的內(nèi)皮受體，可被Ox-LDL誘導(dǎo)引起過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮激活和傷害，進(jìn)而導(dǎo)致氧化和炎癥反應(yīng)，各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子不平衡表達(dá)[23-24]。本研究中EAA在無(wú)細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上，能夠抑制HUVEC細(xì)胞的遷移和血管生成行為，這說(shuō)明EAA具有抗細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管生成的潛力。同時(shí)，EAA能顯著降低由Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞LOX-1和VEGF蛋白表達(dá)，因此EAA具有減少炎癥反應(yīng)和斑塊內(nèi)血管生成的活性。

細(xì)胞內(nèi)積累過(guò)量的ROS被視為氧化應(yīng)激的根本原因之一，ROS可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)和功能障礙[25]。EAA能夠降低由Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞ROS產(chǎn)生，減少內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)發(fā)生的可能。黏附分子ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族（IGSF）的成員，是重要的一種炎癥因子，能夠促進(jìn)炎癥部位的黏連性[26]。MAPK通路是調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化中的關(guān)鍵通路之一，參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，能夠通過(guò)生長(zhǎng)、炎癥凋亡等多種方式調(diào)控細(xì)胞[27]。VEGF作為血管的有效促分裂原，是血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)劑之一，MAPK信號(hào)通路同時(shí)也是VEGF的下游通路之一，能夠被VEGF調(diào)節(jié)從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成[9]。EAA表現(xiàn)出對(duì)MAPK信號(hào)通路、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)具有顯著的抑制作用，這些結(jié)果說(shuō)明EAA能夠通過(guò)抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥和血管新生，表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性。分子對(duì)接結(jié)果顯示，EAA與LOX-1產(chǎn)生穩(wěn)定的氫鍵，具有相互作用，這表明EAA具有有效減少黏附分子、血管生成因子和炎癥因子表達(dá)的活性。因?qū)嶒?yàn)條件，本研究沒(méi)能對(duì)其他炎癥通路和侵襲、血管生成通路進(jìn)行驗(yàn)證，這將是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

綜上所述，海洋土曲霉代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A（EAA）能抑制氧化型低密度脂蛋白Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中LOX-1、VEGF、MAPK信號(hào)通路、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)，從而使HUVEC細(xì)胞炎癥、遷移和血管生成得到抑制。分子對(duì)接預(yù)測(cè)分析進(jìn)一步證實(shí)EAA與LOX-1具有穩(wěn)定的結(jié)合位點(diǎn)。這為海洋土曲霉代謝產(chǎn)物EAA成為潛在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管生成預(yù)防功能性產(chǎn)品或治療藥物提供理論依據(jù)。

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Activie Mechanism of Epi-aszonalenin A Derived fromC23-3 on Endothelial Cells

LIU Yi1, CHEN Min-qi2, ZHANG Yi2,3, QIAN Zhong-ji1,3,

（1./ 2.,,524088,; 3.,518120,）

【Objective】To analyze the effect of epi-aszonalenin A (EAA), a metabolite of coral-derived fungus, on angiogenesis in atherosclerotic plaques induced by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL).【Methods】CCK method was used to detect cell viability; DCFH-DA was used to detect ROS content; scratch test was used to analyze the migration ability of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC); angiogenesis was used to detect tube capacity; ELISA kit was used to detect the LOX-1 and VEGF proteins; western blotting was used to detect the expression of MAPK pathway, ICAM-1, VCAM-1 proteins; Molecular docking was used to simulate the interaction of EAA with LOX-1 protein.【Results】CCK method showed that EAA had no significant toxic effect on HUVEC (> 0.05). Compared with the blank control, EAA significantly inhibited cell migration and angiogenesis. Compared with the control group, ETT concentration in the experimental group increased. ROS content decreased significantly (< 0.001). LOX-1 and VEGF the expression of phosphorylation of p38, JNK, and ERK in MAPK pathway and ICAM-1 and VCAM-1 decreased gradually (< 0.001). Moreover, it can form a stable interaction with LOX-1. 【Conclusion】EAA can clear ROS and inhibit the expression of inflammatory factors and angiogenesis in HUVEC.

; metabolite; human umbilical vein endothelial cell; angiogenesis; anti-inflammatory;human oxidized low density lipoprotein

R915

A

1673-9159（2022）01-0059-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.009

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2021-11-03

深圳市國(guó)際合作研究項(xiàng)目協(xié)同創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（GJHZ20190823111601682）；南海海洋生物醫(yī)藥資源研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（XM-202008-01B1）；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（2020A1515011075）

劉怡（1998－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ蠡钚晕镔|(zhì)研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：Sioney61@163.com

張翼（1978－），男，博士，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊晃锘瘜W(xué)。E-mail:hebeizhangyi@163.com

千忠吉（1978－），男，博士，副教授，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)的研究與利用。E-mail：zjqian78@163.com

（責(zé)任編輯：劉嶺）