瞿瑜杉，吉宏武,2，宋文奎，彭 爍，詹蘇泓，韋柳益，陳 銘，張 迪，劉書成,2

扁舵鰹抗氧化肽分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

瞿瑜杉1，吉宏武1,2，宋文奎1，彭 爍1，詹蘇泓1，韋柳益1，陳 銘1，張 迪1，劉書成1,2

（1. 廣東海洋大學食品科學學院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋生物制品工程實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心 // 廣東省高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088；2. 大連工業(yè)大學海產(chǎn)品深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

【目的】從扁舵鰹（）的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中分離鑒定具有較高1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率的抗氧化肽?！痉椒ā坑媚竟系鞍酌杆獗舛骣?，以DPPH自由基清除能力為檢測指標，通過超濾、凝膠過濾層析和反向高效液相色譜分離抗氧化肽，再經(jīng)過超高效液相/三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC / Xevo G2-XS QTOF）進行結(jié)構(gòu)鑒定?！窘Y(jié)果】從酶解產(chǎn)物中獲得3種抗氧化肽，其氨基酸序列分別為-丙氨酸-1-甲基--組氨酸（241 u）、Gly-Ala-Gly-Gly-Pro（357 u）和Val-Glu（246 u）。【結(jié)論】扁舵鰹的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物含有抗氧化活性的肽類，可為其抗氧化肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

扁舵鰹；抗氧化肽；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

扁舵鰹（）廣泛分布于太平洋、大西洋、印度洋地區(qū)。因其腥味重、口感差，普通肉一般加工成罐頭，暗色肉直接丟棄或者加工成魚粉，經(jīng)濟價值極低。但是，扁舵鰹肉富含蛋白質(zhì)，氨基酸組成豐富[11]。研究表明，扁舵鰹蛋白酶解物富含抗氧化性氨基酸、芳香族氨基酸[12]，這些氨基酸在抗氧化方面中起著至關重要的作用[13]。同時，鰹魚含有豐富的肌肽和鵝肌肽[14]，具有抗氧化[15]、降尿酸[16]等多種功效。因此，扁舵鰹蛋白可以作為抗氧化肽的新來源。目前還未見用扁舵鰹制備抗氧化肽報道。

蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物復雜多樣，包含游離氨基酸、不同分子質(zhì)量的肽、未完全酶解的蛋白質(zhì)等，這些均會影響多肽的抗氧化能力，因此需要采用多種分離手段得到活性更強的抗氧化肽。目前蛋白質(zhì)水解物分離通常采用超濾和色譜分離相結(jié)合，將其高活性部分通過質(zhì)譜鑒定出目標抗氧化肽序列。例如于輝等[17]將細點圓趾蟹（）含肉下腳料酶解物通過超濾、Sephadex G-15凝膠色譜、半制備RP-HPLC，分離得到2種抗氧化肽。Hye等[18]將日本叉牙魚（）酶解產(chǎn)物通過超濾、制備型高效液相和反相高效液相色譜，分離純化出1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH自由基清除活性大于66%的抗氧化肽Ala-Thr-Ser-His-His。O’Keeffe等[19]通過超濾和半制備反相高效液相色譜對乳清蛋白濃縮水解物進行連續(xù)分離，得到Val-Ala-Gly-Thr、Met-Ala-Ala和Met-Pro-Ile３種新型肽。

本研究通過木瓜蛋白酶水解扁舵鰹獲得抗氧化肽，用超濾、體積排阻色譜和反相高效液相色譜進行連續(xù)分離和純化抗氧化肽，最后通過超高效液相/三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC/Xevo G2-XS QTOF）鑒定抗氧化肽，為扁舵鰹多肽在功能食品上的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扁舵鰹（），購于中國廣東興億海洋生物工程有限公司，全程冷鏈運輸至實驗室，-20 ℃保存至使用。木瓜蛋白酶（200 U/mg），購自廣西南寧龐博生物科技有限公司；DPPH試劑盒，購自中國南京建成生物工程研究所；葡聚糖凝膠G-15，購自上海源葉生物；乙腈、甲醇、三氟乙酸（色譜級），均購自美國Sigma公司；反相C18色譜柱（COSMOSIL C18-MS-II），購自日本Nacalai Tesque公司。

1.2 扁舵鰹水解物的制備

在溫度60 ℃，pH 6，添加木瓜蛋白酶600 μ/g，質(zhì)量（mg）體積（mL）比1∶3，將扁舵鰹魚肉流水解凍后勻漿、均質(zhì)，酶解4 h。酶解后，在沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，4 ℃（8 000 r/min、20 min）離心，取上清液冷凍干燥，儲存于-20 ℃待進一步分析。

1.3 DPPH自由基清除活性的測定

取400 μL的樣品溶液與600 μL的10-4mol/L DPPH工作液混勻，在室溫下避光孵育20 min，用分光光度計在517 nm下測光密度值?？瞻讓φ沼玫润w積的蒸餾水替代樣品，其他以相同方式進行[20]。DPPH自由基清除率（%）計算如下：

DPPH自由基清除率 = 1 -（1-2）/0,

其中，1是樣品 + DPPH；2是樣品+甲醇；0是甲醇+DPPH。

1.4 抗氧化肽純化

1.4.1 超濾 將扁舵鰹酶解產(chǎn)物通過孔徑200 nm的無機陶瓷膜分離，再將收集液依次通過10 ku、5 ku、1 000 u的超濾膜過濾，分別收集>10 ku、5 ～ 10 ku、1 000 u ～ 5 ku、<1 000 u四個組分并且濃縮、冷凍干燥得到干粉，保存于-20 ℃，測試每個組分的DPPH自由基清除能力，谷胱甘肽（GSH）用作陽性對照。

1.4.2 Sephadex G-15凝膠柱層析 取適量的Sephadex G-15凝膠干粉在熱水中溶脹2 h，每0.5 h攪拌一次，去除水表面的漂浮物。然后將溶脹好的Sephadex G-15凝膠倒入柱中。用水作為流動相并以2.5 mL/min的流速壓柱，直到得到穩(wěn)定的凝膠柱（26 mm×60 cm）。7 mL樣品溶液（30 mg/mL）通過凝膠柱純化，用超純水以2.5 mL/min洗脫。在220 nm處檢測流出物光密度。使用自動收集器收集每個洗脫峰并濃縮、冷凍干燥得到干粉，保存于-20 ℃，然后測定其DPPH自由基清除能力。

(2)錨索、錨桿設計巖土工程參數(shù)參考值。根據(jù)《建筑邊坡工程技術(shù)規(guī)范》(GB 50330—2002)推薦值并結(jié)合實際綜合考慮，推薦砂漿與螺紋鋼筋的粘結(jié)強度為2 000 kPa，砂漿與鋼絞線的粘結(jié)強度為2 500 kPa，砂漿與片麻巖的粘結(jié)強度為1 000 kPa。

1.4.3 反相高效液相色譜分離 將通過Sephadex G-15凝膠獲得最高DPPH清除活性的組分溶于超純水中，使用COSMOSIL C18-MS-II色譜柱（內(nèi)徑4.6 mm，長250 mm）通過半制備高效液相色譜分離出抗氧化活性最高的組分。以乙腈和超純水作為流動相，在質(zhì)量濃度5 mg/mL，流動相為水和乙腈體積比 = 85%∶15%的混合液，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃的條件下，將凝膠過濾得到的最高DPPH清除活性組分進行反向液相色譜分離。在220 nm條件下，按峰收集合并后濃縮、冷凍干燥，保存于-20 ℃，然后測定其DPPH自由基清除能力。

1.4.4 氨基酸序列分析 將2.4.3中純化得到的扁舵鰹魚蛋白肽溶于去離子水中，通過Xevo G2-XS QTOF（Waters，USA）分析具有最高抗氧化能力的肽的氨基酸序列。操作條件如下：進樣量100 μL，流速0.2 mL/min。毛細管電壓2.5 K，樣品錐40，偏差控制180，正離子模式，噴霧溫度400 ℃，MS/MS電壓源25 kV。

1.5 統(tǒng)計分析

本實驗采用JMP14.0軟件進行顯著性分析，采用Origin9.0軟件繪圖。采用檢驗分析組間差異，以< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾分離及各組分的抗氧化活性

將扁舵鰹酶解液連續(xù)通過10 ku、5 ku、1 ku的膜分離，得到4組不同分子質(zhì)量的組分：ATH-I（>10 ku）、ATH-II（5 ～ 10 ku）、ATH-III（1 ～ 5 ku）、ATH-IV（<1 ku），其DPPH自由基清除活性如圖1所示。ATH-IV表現(xiàn)出最高的自由基清除活性（半抑制濃度（IC50）= 3.61 mg/mL），而ATH-I對DPPH自由基清除能力最弱（IC50= 6.79 mg/mL）。結(jié)果表明，多肽的分子質(zhì)量與其抗氧化性密切相關，即低分子質(zhì)量的組分可能含有更有效的抗氧化肽。類似的，Ahn等[21]從鮭（）水解物中分離出的低分子質(zhì)量肽具有更高的抗氧化活性；Wang等[22]發(fā)現(xiàn)，藍貽貝（）水解產(chǎn)物<1 ku組分具有更高的DPPH自由基清除力。分子質(zhì)量較低的肽能更有效的與氧化過程的自由基相互作用[23]。因此，選擇組分ATH-IV進行下一步的分離。

凡含一個相同字母表示差異不具統(tǒng)計學意義（P > 0.05）

2.2 凝膠過濾色譜分離及各組分抗氧化活性

圖2(A)所示，ATH-IV組分經(jīng)過Sephadex G-15凝膠柱分離出4個不同的級分，分別記為F1、F2、F3、F4。如圖2(B)所示，F(xiàn)1對DPPH自由基的清除活性最高，其IC50值為3.43 mg/mL。因此，選擇F1進行進一步分離純化。

凡含一個相同字母表示差異不具統(tǒng)計學意義（P > 0.05）

2.3 反相高效液相色譜進一步分離及各組分的抗氧化活性

在檢測波長220 nm下進行多次反復驗證，得到分離色譜圖（圖3）。結(jié)果顯示，F(xiàn)1-1的活性（IC50= 1.53 mg/mL）遠高于F1-2（IC50= 54.19 mg/mL）。經(jīng)鑒定F1-3為氨基酸，而單個氨基酸的抗氧化活性遠遠低于肽[24]，因此選擇F1-1進行下一步結(jié)構(gòu)特征鑒定。

2.4 UPLC－MS／MS鑒定抗氧化肽氨基酸序列

肽的抗氧化活性與分子質(zhì)量、氨基酸組成與排列有關[25]。通過超高效液相色譜中觀察到3個主要峰（如圖4(A)）。通過QTOF-MS分析肽的分子質(zhì)量，再通過QTOF-MS-MS分析肽的表征。圖4(B-D)為峰1、2、3的MS圖，其中質(zhì)荷比m/z依次為241.1、357.3、246.2離子峰最高。因此選擇m/z = 241.1、357.3和246.2為母離子進行MS/MS分析。

圖3 F1液相分離色譜

圖5(A)為來自母離子（m/z = 241.1）的MS/MS圖。結(jié)合分子質(zhì)量以及在MS/MS圖中的碎片峰，發(fā)現(xiàn)其與wang等[26]報道的鵝肌肽MS/MS圖一致，因此斷定峰1為鵝肌肽。

圖5(B)為母離子（m/z = 357.3）二級質(zhì)譜圖。結(jié)果顯示，該系列的m/z值分別為5= 357.3，4= 301.1，3= 230.2，2= 173.1，1= 116.1。母離子m/z為357.3，通過五個系列離子相減，依此為5-4= 56.2、4-3= 70.9、3-2= 57.1、2-1= 57.0、1= 116.1。除1其余加上18（H2O），顯示相應的氨基酸殘基分別為Gly、Ala、Gly、Gly。y1缺失一個H+正好對應氨基酸殘基為Pro。因此推測前體離子氨基酸序列為Gly-Ala-Gly-Gly-Pro。通過計算GAGGP相對分子質(zhì)量發(fā)現(xiàn)與質(zhì)譜中的一致。

圖5(C)為母離子（m/z = 246.2）的二級質(zhì)譜圖。根據(jù)結(jié)果所示，該系列的m/z值分別為3= 246.2，2= 229.2，1= 130.1。母離子的m/z為246.2，通過3個系列離子相減，依此為3-2= 17、2-1= 99.1、1= 130.1，由此可推斷為二肽。對應y2端氨基酸殘基為Val，纈氨酸脫去一個H2O，m/z = 99。1- 1= 129，谷氨酸得到一個H2O，m/z=147，因此1端對應的氨基酸殘基為Glu。計算相對分子質(zhì)量VE，結(jié)果為117 + 147 - 18=246，與質(zhì)譜給出的值一致，故母離子（m/z = 246.2）的氨基酸序列為Val-Glu。

含有2 ～ 10個氨基酸的寡肽比其他大多數(shù)多肽或者蛋白質(zhì)具有更高抗氧化潛力[27]。多肽活性不僅取決于分子質(zhì)量，還與氨基酸組成和結(jié)構(gòu)中序列有關[28]。研究報道表明，Tyr、Pro、Val等疏水性氨基酸在清除食品自由基方面發(fā)揮了顯著作用[29-30]。Ranathunga等[31]發(fā)現(xiàn)，星康吉鰻（）蛋白水解物中純化的抗氧化肽由55%的疏水殘基組成肽中的疏水性氨基酸對其抗氧化作用有很大貢獻。Mendis等[32]從柔魚（）皮明膠中純化抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)肽序列含有的Pro、Gly、Ala、Val、Leu等氨基酸具有強抗氧化活性。通過扁舵鰹蛋白水解液純化出的３種抗氧化肽分別為鵝肌肽、五肽（由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸組成）以及二肽（由纈氨酸和谷氨酸組成）。鵝肌肽是一種主要分布在動物體內(nèi)的組氨酸二肽，已被證明其具有多種功能，如抗氧化[33]、抗糖化[34]以及改善運動能力[35]的作用。GAGGP中甘氨酸、脯氨酸為疏水性氨基酸，占總肽的80%，這能增強肽的抗氧化活性，使多肽與脂質(zhì)雙層膜相互作用，抑制脂肪過氧化[36]，脯氨酸的吡咯環(huán)可以增加肽的柔韌性，并且由于其具有較低的電離勢，可以猝滅單線態(tài)氧[37]。VE中也含有疏水性氨基酸，并且其位于N端被認為通過增加水-脂質(zhì)界面處的密度而有助于抗氧化活性[38]，谷氨酸在去除過氧化氫過程中通過產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽來提供抗氧化活性[39]。

（A）F1-1的UPLC色譜圖；（B-D）峰1、2、3 MS圖

圖5 F1-1各肽段的二級質(zhì)譜

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶對扁舵鰹進行酶解，酶解產(chǎn)物通過膜分離和色譜分離相結(jié)合的方法分離得到3個抗氧化肽，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，３個抗氧化肽的氨基酸序列分別為β-丙氨酸-1-甲基-L-組氨酸（241 u）、Gly-Ala-Gly-Gly-Pro（357 u）和Val-Glu（246 u）。

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（責任編輯：劉朏）

Isolation, Purification and Structural Identification of Antioxidant Peptides from

QU Yu-shan1, JI Hong-wu1,2, SONG Wen-kui1, PENG Shuo1, ZHAN Su-hong1, WEI Liu-yi1, CHEN Ming1, ZHANG Di1, LIU Shu-cheng1,2

（1.,////////,524088,; 2.,,116034,）

【Objective】To isolate and identify antioxidant peptides with high DPPH free radical scavenging ability from papain hydrolysate of.【Method】Antioxidant peptides in the hydrolysates were initially purified using ultrafiltration, gel filtration chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Then, the antioxidant activities of each component were determined by DPPH free radical scavenging ability. Their peptide sequences were identified by ultra-performance liquid chromatography / triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC / Xevo G2-XS QTOF). 【Results】Three antioxidant peptides were purified from the hydrolysates, and their peptide sequence were-alanine-1-methyl-L-histidine (241 u), Gly-Ala- Gly-Gly-Pro (357 u) and Val-Glu (246 u), respectively. 【Conclusion】Antioxidant peptides existed in papin hydrolysate of, which provides a theoretical basis for the development of its antioxidant peptides.

; antioxidant peptide; isolation and purification; structure identification

S931.4

A

1673-9159（2022）01-0113-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.015

瞿瑜杉，吉宏武，宋文奎，等. 扁舵鰹抗氧化肽分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：113-119.

2021-11-20

國家重點研發(fā)計劃（2019YFD0902004）

瞿瑜杉（1995―），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：quys@foxmail.com

吉宏武（1962―），男，博士，教授，研究方向為水產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：jihw62318@163.com