陳麗娟，張 斌

（湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199）

大豆[Glycine max（Linn.）Merr.]是豆科大豆屬一年生草本植物，種子中富含大豆蛋白、活性肽、脂肪、異黃酮和皂苷等生物活性成分，具有抗高血壓、抗氧化、抗癌、降血脂等生理保健功能[1]，尤其是大豆皂苷具備降血糖血脂、抗誘變、抗衰老、抗凝血等作用，對癌細胞也有一定的抑制作用[2]。熱激蛋白HSP （Heat Shock Proteins）是一類高度保守的蛋白質(zhì)，具有幫助多肽正確折疊、轉(zhuǎn)運和修復(fù)的功能，在植物生 長發(fā)育和抗脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[3]。HSP大 體可分為小分子HSP、HSP10、HSP40、HSP60、HSP70、 HSP90和HSP100這7類[4-5]。其中，小分子HSP的分 子量在15~42 kD之間，通常被稱為蛋白錯誤折疊的第一道防線，也被稱為“細胞衛(wèi)士”[6]。HSP基因轉(zhuǎn)入大豆可以提高其抗逆性[7]，但是，目前為止，關(guān)于GmHSP20家族基因的研究還非常有限。大豆基因組的成功測序為大豆基因功能研究提供了有力條件，筆者對GmHSP20家族基因進行了鑒定，并對其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化、啟動子原件以及表達模式進行了分析，為探究GmHSP20家族基因的功能打下了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GmHSP20家族基因相關(guān)數(shù)據(jù)來自Ensembl數(shù)據(jù)庫；擬南芥HSP20蛋白家族基因相關(guān)數(shù)據(jù)來自擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（TAIR）；HSP20蛋白隱馬爾可夫模型（pf 00011）來自PFAM數(shù)據(jù)庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 HSP20蛋白家族基因成員的鑒定首先，從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載基因組序列、CDS和蛋白序列，建立本地數(shù)據(jù)庫。第二，以pf 00011為參考序列，設(shè)置e值≤1E-20，用HMME軟件在本地數(shù)據(jù)庫搜索HSP20結(jié)構(gòu)域，建立GmHSP20的隱馬爾可夫模型，搜索GmHSP20序列，e值≤0.001；將GmHSP20序列提交到NCBI進一步確認結(jié)構(gòu)域，去除假陽性。第三，使用MEGA6.0軟件鄰接法（NJ）構(gòu)建大豆和擬南芥HSP20蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設(shè)置值為1000。通過http://web.expasy.org/compute_pi/獲得GmHSP20的長度、分子量和等電點。第四，從Phytozome數(shù)據(jù)庫中提取GmHSP20起始密碼子上游1500 bp基因組序列，利用PlantCARE預(yù)測其順式作用元件，用TBtools軟件繪制啟動子順式元件圖。第五，通過CDS找出GmHSP20基因在染色體上的位置，將信息提交到http://gsds.cbi.pku.edu.cn/生成基因結(jié)構(gòu)。

1.2.2 HSP20蛋白家族基因的表達從大豆數(shù)據(jù)庫SoyKB（http://soykb.org/）下載GmHSP20基因表達數(shù) 據(jù)，利用TBtools軟件繪制基因的表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1GmHSP20蛋白家族基因的篩選、鑒定和染色體定位

該研究在大豆基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出56個GmHSP20蛋白家族基因。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小命名，相同分子量命名為A、B等，結(jié)果（表1）顯示， 基因的氨基酸長度不一，分子量和等電點變化范圍比較大。GmHSP20的氨基酸長度為136~372（aa），最長的為GmHSP41.8，最短的為GmHSP15.6；GmHSP20 相對分子質(zhì)量為15.2~41.8 Da，最大的為GmHSP41.8，最小為GmHSP15.2；蛋白質(zhì)的等電點為4.49~10.28，最高為GmHSP17.8，最低為GmHSP17.5B。大豆全基因組共含有20條染色體，而56個GmHSP20基因分布在18條染色體上（圖1）。不同染色體含有不同的GmHSP20基因數(shù)目，1、11、12、17和19號只有1個基因，5、9、16號有2個基因；6、10、18、20號有3個基因；其中2、4、7、8、13、14號染色體上有基因成簇存在。

圖1 GmHSP20基因的染色體定位

表1 GmHSP20基因家族信息

2.2GmHSP20基因進化樹構(gòu)建

根據(jù)HSP20家族基因在銀杏中的分組方法，GmHSP20基因可分為11個亞家族，如圖2所示，分別是CⅠ、CⅡ、CⅢ（細胞質(zhì)或細胞核），MⅠ、MⅡ（線粒體），P（質(zhì)體），Po（過氧化物酶體），ER（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和UN1、UN2、UN3（位置未知）。對比擬南芥系統(tǒng)的進化分析發(fā)現(xiàn)，大豆和擬南芥HSP20基因家族成員具有高度的同源性。在各個亞族中，成員數(shù)量不一，CI有26個成員，CⅡ有2個，CⅢ有2個，P有7個，ER有6個，MI有4個，MⅡ有2個，Po有3個，未知功能的UN1亞族有2個，UN2有2個，UN3有13個。大多數(shù)GmHSP20基因分布在細胞質(zhì)或細胞核中，少量分布在細胞器內(nèi)。

圖2 GmHSP20基因進化樹

2.3GmHSP20基因啟動子原件分析

為了研究GmHSP20基因在進化過程中的多樣性變化，對基因結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果（圖3左）表明，家族基因在結(jié)構(gòu)上較為保守，雖然56個GmHSP20基因長短差異較大，但內(nèi)含子主要為0~2個。CⅠ和ER亞族基因長度比較短，都只含有1個內(nèi)含子；UN1亞族含有5個內(nèi)含子，而且外顯子和內(nèi)含子相對位置高度相似；其余絕大部分基因都只含有2個內(nèi)含子。值得注意的是，P亞族中GmHSP26.1和UN3亞族中GmHSP26.7比較特殊，基因結(jié)構(gòu)較長，內(nèi)含子超過了4 kb。

圖3 大豆GmHSP20基因結(jié)構(gòu)（左）和啟動子原件（右）

對GmHSP20基因的啟動子（圖3右）進行分析，發(fā)現(xiàn)所有GmHSP20基因都含有與植物脅迫相關(guān)的元件，例如ARE、LTR、MBS和TC-rich。ARE元件在GmHSP20基因中普遍存在，表現(xiàn)為1~4個重復(fù)。

2.4GmHSP20基因表達模式分析

研究對56個GmHSP20基因的表達模式進行了分析，結(jié)果如圖 4所示。整體上，GmHSP20基因在種子發(fā)育第42天表達水平較高，其中GmHSP17.3A、GmHSP17.7A、GmHSP17.9和GmHSP18.5B在種子發(fā)育第35天和第42天表達最高。值得注意的是，同一亞族GmHSP18.5A和GmHSP18.5B在大豆不同生長部位和生長發(fā)育階段都有表達，而且表達水平均較高，表現(xiàn)出相似的表達模式。

圖4 GmHSP20基因表達模式圖

3 討 論

HSP蛋白廣泛存在于植物體內(nèi)，參與植物生長發(fā)育、非生物脅迫響應(yīng)等多種生物學(xué)過程[8]。關(guān)于HSP20蛋白家族基因的分析報道比較多，擬南芥有19個Hsp20[9]，楊樹有36個[10]，水稻有39個[11]，銀杏有39個[12]，可以分成了不同的亞族，并且在基因數(shù)量、亞細胞定位、功能和序列方面體現(xiàn)出多樣性。但是，到目前為止，關(guān)于GmHSP20基因的研究十分有限。該研究從大豆全基因組中鑒定出56個GmHSP20基因，分為11個亞族，大多數(shù)分布在細胞質(zhì)或細胞核中，少量分布在細胞器內(nèi)，說明細胞質(zhì)可能是GmHSP20基因的主要功能區(qū)，這與銀杏中的研究一致；但是，銀杏中只有10個亞族，這可能與銀杏和大豆基因組具有不同的系統(tǒng)發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[12]。GmHSP20蛋白的氨基酸長度不一、分子量和等電點變化范圍比較大，推測可能與這些蛋白是在不同亞細胞中發(fā)揮作用有關(guān)。18條染色體含有不同的GmHSP20基因數(shù)目，有的基因成簇存在，這些成簇的基因可能對某一生物學(xué)功能有加強作用。GmHSP20基因在在種子發(fā)育第42天表達量比較高，暗示這些基因在種子發(fā)育過程中發(fā)揮了一定的作用，其中GmHSP17.3A、GmHSP17.7A、GmHSP17.9和GmHSP18.5B在種子發(fā)育第35天和第42天表達最高，說明這4個基因在種子發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用。GmHSP18.5A和GmHSP18.5B在大豆不同生長部位和各生長發(fā)育階段都有表達，表現(xiàn)出相似的表達模式，提示著這2個基因可能具有相同的功能，還需要進一步的研究確定。綜上所述，該研究結(jié)果為GmHSP20基因在大豆生長發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)過程中的功能研究提供了參考。