楊旭,孟祥玉,宋麗麗,張志平,馬歌麗,魏濤*

1(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州,450002) 2(鄭州市代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450002)

農(nóng)業(yè)廢棄物屬于木質(zhì)纖維原料(lignocellulosic biomass,LCB),水解過程是厭氧消化(anaerobic digesters,AD)的限速步驟[1]。為此,大多數(shù)工藝通過兩相AD提高沼氣生產(chǎn)效率[2]。然而,WU等[3]發(fā)現(xiàn)底物水解易受高濃度酸化產(chǎn)物的抑制。LI等[4]和DALKILIC等[5]也報(bào)道了類似的結(jié)果：過量有機(jī)酸不僅反饋抑制酸化相中有機(jī)酸和氨氮,而且還會(huì)破壞產(chǎn)甲烷相的最適條件。因此,有必要對(duì)兩相AD工藝進(jìn)行優(yōu)化以提高原料適應(yīng)性和工程穩(wěn)定性操作。在酸化過程中適當(dāng)通風(fēng)可以顯著提高木質(zhì)纖維素的降解效率,增加有機(jī)酸的產(chǎn)生,同時(shí)加速底物分解,提高產(chǎn)沼氣效率,并且還可減少有毒氣體,如H2S和NH3的產(chǎn)生[6-7]。為了提高降解效率,通常通過物理、化學(xué)或者生物強(qiáng)化方法對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理,以提高沼氣產(chǎn)率[8]。然而,苛刻的預(yù)處理?xiàng)l件和化學(xué)試劑的使用導(dǎo)致機(jī)械能耗和投資成本的增加,而且復(fù)雜的處理過程限制了項(xiàng)目的進(jìn)一步應(yīng)用。近年來,農(nóng)業(yè)廢棄物特別是干秸稈的微貯預(yù)處理技術(shù)已成為研究的熱點(diǎn),其基本原理是在厭氧條件下利用乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)生物轉(zhuǎn)化可溶性碳水化合物產(chǎn)生大量有機(jī)酸,降低原料pH值,殺死或抑制其他有害細(xì)菌,可達(dá)到長(zhǎng)期保存和預(yù)處理的目的[9]。干秸稈原料經(jīng)過微貯處理后,干物質(zhì)損失可低至1%～5%,可生化降解性能得到提高[10],主要是因?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)碳水化合物的降解降低了LCB的生物抗性[11]。微貯處理可以解決秸稈大規(guī)模收集、保存和預(yù)處理的問題,與傳統(tǒng)物理和化學(xué)方法相比,該技術(shù)不需要消耗大量能量和回收化學(xué)試劑,也不會(huì)在反應(yīng)體系中產(chǎn)生抑制劑。由于在微貯預(yù)處理過程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸,微貯處理過程可以取代兩相AD的酸化過程,從而實(shí)現(xiàn)單相AD。

在AD過程中,原料的特性決定了AD時(shí)間和沼氣產(chǎn)量[12]。例如,單一LCB的AD存在碳氮不平衡的問題,由于LCB的C/N比接近70∶1,而AD的最佳C/N比為(20∶1)～(30∶1)[13]；由于豬糞原料C/N比低,AD過程中容易產(chǎn)生氨氮抑制,使得難以達(dá)到AD微生物群所需的最佳生長(zhǎng)狀態(tài)[14]；剩余污泥(excess sludge,ES)的AD過程水解預(yù)處理是一個(gè)限制步驟,ES細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)抑制細(xì)胞內(nèi)可降解物質(zhì)的水解,常規(guī)污泥消化通常需要較長(zhǎng)的停留時(shí)間[15]。為解決上述問題,越來越多的AD過程采用多種原料復(fù)配進(jìn)行厭氧共消化,不僅可以有效調(diào)節(jié)單一原料的營(yíng)養(yǎng)不平衡問題,還可以提高沼氣轉(zhuǎn)化效率[16]。

本文以干玉米秸稈(dry corn stover,DCS)為研究對(duì)象,深入研究了不同微生物厭氧預(yù)處理DCS過程中微生物的動(dòng)態(tài)變化及DCS成分改變情況。在此基礎(chǔ)上,比較分析了DCS兩相AD(微好氧酸化+厭氧消化)與微貯DCS單相AD沼氣產(chǎn)量的差異。最后,研究了微貯DCS和廢棄物(豬糞或ES)單相厭氧共消化沼氣發(fā)酵效率,以探索農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用的高效途徑。

1 材料與方法

1.1 原料

DCS由河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司提供,成分分析結(jié)果為：總固形物(total solid,TS)：87.52%；揮發(fā)性固體(volatile solid,VS)：82.19%；纖維素[以葡聚糖(glucan)含量計(jì)]：33.82%；半纖維素[以木聚糖(xylan)含量計(jì)]：24.99%；總氮(total nitrogen,TN)：0.94%；灰分：2.24%。實(shí)驗(yàn)中用到的微生物：糞鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌等由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

ES由鄭州市五龍口污水處理廠提供(TS：32.51%；VS：15.51%；纖維素：2.80%；半纖維素：2.07%；TN：4.16%；灰分：17.00%),實(shí)驗(yàn)室冷凍保存,使用前在85 ℃水浴條件下保溫1 h后加入發(fā)酵裝置中進(jìn)行厭氧消化。

豬糞(pig manure,PM)：由南陽(yáng)市臥龍牧原養(yǎng)殖有限公司提供(TS：31.02%；VS：19.53%；纖維素：11.93%；半纖維素：12.42%；TN：1.90%；灰分：11.49%),實(shí)驗(yàn)室冷凍保存,使用前在85 ℃水浴條件下保溫1 h后加入發(fā)酵裝置中進(jìn)行厭氧消化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干玉米秸稈微貯

微貯容器采用玻璃壇子。微貯過程如圖1所示,活化種子液倒入1.5 kg DCS中裝入壇子,控制最終含水量為30%。微貯實(shí)驗(yàn)分3組：芽孢桿菌組DCS-S1(枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶納豆芽孢桿菌=1∶1∶1)、混合組DCS-S2(糞鏈球菌∶發(fā)酵乳桿菌∶干酪乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶納豆芽孢桿菌=1∶1∶1∶1∶1∶1)和乳酸菌組DCS-S3(糞鏈球菌∶發(fā)酵乳桿菌∶干酪乳桿菌=1∶1∶1),每個(gè)微生物的接種量為1.0×106個(gè)/g DCS。裝填完畢后蓋上玻璃碗,在壇子頂部加入適量水密封達(dá)到厭氧發(fā)酵的目的。發(fā)酵時(shí)間為28 d,每隔7 d取樣進(jìn)行分析測(cè)定。

圖1 干玉米秸稈微貯過程及取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置Fig.1 The production diagram of silage used in this study with the sampling points indicated

1.2.2 厭氧消化

本研究共設(shè)置2種AD工藝(圖2-a和2-b)：兩相(微好氧酸化相+甲烷相)AD和單相AD。

兩相AD酸化相(圖2-a)：本實(shí)驗(yàn)采用自制微好氧水解酸化裝置(酸化罐采用密閉裝置,過程中通入空氣,采用溶氧電極監(jiān)控以維持反應(yīng)體系溶氧濃度接近1 mg/L),反應(yīng)器有效容器為5 L。實(shí)驗(yàn)原料為DCS,酸化相固形物濃度為8% TS,采用AD罐放出的過濾沼液配料。每天間歇機(jī)械攪拌(50 r/min 開啟20 min,關(guān)閉20 min,循環(huán))使反應(yīng)體系混合均勻。酸化相溫度為(35±2)℃,周期為2 d(每一批次加料120 g絕干原料)。酸化結(jié)束后,取出酸化液總量80%加入AD罐發(fā)酵沼氣,余下20%作為下一批次酸化接種物。

a-兩相AD;b-單相AD圖2 兩相AD和單相AD工藝流程圖Fig.2 Process flow charts of two-phase AD and single-phase AD

兩相AD甲烷相(圖2-a)：本實(shí)驗(yàn)厭氧消化反應(yīng)器為實(shí)驗(yàn)室自制反應(yīng)裝置,反應(yīng)器體積為100 L,反應(yīng)器內(nèi)溫度為(45±2)℃,整個(gè)消化試驗(yàn)采用半連續(xù)方式。每隔2 d加入酸化液,放出等量沼液,采用100目篩網(wǎng)過濾后液體用于酸化配料(沼渣烘干)。每日通過空氣流量計(jì)讀數(shù)記錄沼氣產(chǎn)量,并定時(shí)取樣進(jìn)行CH4含量分析。

單相AD(圖2-b)：本實(shí)驗(yàn)厭氧消化反應(yīng)器為實(shí)驗(yàn)室自制反應(yīng)裝置,反應(yīng)器體積為100 L,反應(yīng)器內(nèi)溫度為(45±2)℃,整個(gè)消化試驗(yàn)采用半連續(xù)方式。每隔2 d加入微貯DCS[或微貯DCS+ES/PM混合物進(jìn)行厭氧共消化,每一批次加料120 g絕干物料。其中,微貯DCS∶ES=6∶1(絕干質(zhì)量比)；微貯DCS∶PM=4∶1(絕干質(zhì)量比),以平衡混合原料C/N],提前放出等量沼液,采用100目篩網(wǎng)過濾后液體用于配料(沼渣烘干),固形物濃度為8% TS。每日通過空氣流量計(jì)讀數(shù)記錄沼氣產(chǎn)量,并定時(shí)取樣進(jìn)行CH4含量分析。

1.3 分析方法

1.3.1 DNA提取、基因測(cè)序及序列分析

DNA具體提取過程參照OMEGA試劑盒Soil DNA Kit的使用說明書。通過Qubit3.0熒光計(jì)監(jiān)測(cè)DNA濃度。文庫(kù)制備和上機(jī)測(cè)序委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3.2 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定及分析方法

干物質(zhì)的測(cè)定采用105 ℃烘干3 h至恒重,差重法測(cè)定；TS的測(cè)定采用105 ℃烘干24 h,差重法測(cè)定；VS的測(cè)定采用550 ℃灼燒4 h,差重法測(cè)定；TN采用微量凱氏定氮法測(cè)定；纖維素和半纖維素采用美國(guó)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)提供的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定；將原料與水料液比1∶10(g∶mL)于100 r/min 振蕩30 min,濾液用于pH 值、有機(jī)酸和游離糖含量測(cè)定；有機(jī)酸和游離糖含量采用高效液相色譜儀(Agilent technologies 1260 Infinity)分析檢測(cè)；CH4和CO2含量采用氣相色譜儀分析檢測(cè)(GC7980)[12]。

TS產(chǎn)氣率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：m,原料質(zhì)量,g；w(TS),預(yù)處理原料的總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；V,累積產(chǎn)氣量,mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 微貯干玉米秸稈成分分析

微貯樣品的pH值、發(fā)酵時(shí)間和乳酸含量可作為微貯是否成功的重要指標(biāo)[17]。由于發(fā)酵過程中乳酸和乙酸的產(chǎn)生,微貯樣品pH值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)(圖3-a),特別是DCS-S2在發(fā)酵28 d后pH值為4.08,可抑制發(fā)酵過程不良微生物的代謝活動(dòng)[18]。微貯樣品中游離葡萄糖含量較低,說明在厭氧發(fā)酵過程中游離葡萄糖被微生物代謝產(chǎn)生乙酸和乳酸等有機(jī)酸類物質(zhì)[19]。

a-pH值；b-乳酸濃度；c-乙酸濃度；d-木糖濃度圖3 DCS微貯過程物化性質(zhì)分析Fig.3 Physicochemical changes in DCS samples

芽孢桿菌發(fā)酵組DCS-S1樣品中乙酸含量高,乳酸發(fā)酵組DCS-S3樣品中乳酸含量高(圖3-b、圖3-c)。發(fā)酵28 d后,DCS-S3中乳酸和乙酸的含量分別為3.60%和0.45%。DCS微貯過程中木糖含量的提高(圖3-d)表明原料半纖維素發(fā)生了降解。據(jù)報(bào)道,半纖維素水解可提高木質(zhì)纖維素生化降解效率[20],因此,微貯可作為一種潛在的纖維原料預(yù)處理方法。對(duì)DCS進(jìn)行微貯預(yù)處理,需要28 d才能達(dá)到穩(wěn)定,因此本文采用微貯28 d的樣品進(jìn)行后續(xù)AD實(shí)驗(yàn)。

目前,由于季節(jié)性因素,生物質(zhì)工廠收集到秸稈的存儲(chǔ)方式一般為干儲(chǔ)存。在干儲(chǔ)存過程中要綜合考慮降雨量、平均主導(dǎo)風(fēng)向等氣象因素,不過室外儲(chǔ)存過程干物質(zhì)損失大,需要較大的場(chǎng)地堆放秸稈,秸稈容易霉變和起火[21]。因此采用溫和條件下的生物預(yù)處理方式(微貯)是十分必要的。由表1可知,微貯對(duì)結(jié)構(gòu)性碳水化合物纖維素(以葡聚糖計(jì))含量影響較小,說明微貯過程可以有效保存DCS。半纖維素(以木聚糖計(jì))和木質(zhì)素(酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素)有適量降解,可能是物料可消化性高于干儲(chǔ)存的主要原因[22],對(duì)原料后續(xù)生化轉(zhuǎn)化也能起到一定的預(yù)處理作用[23]。

表1 DCS微貯前后主要成分變化情況Table 1 Compositions of DCS and DCS silage of DM

2.2 微貯干玉米秸稈細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

就相對(duì)豐度而言,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是所有樣品中主要門類(圖4)。特別是DCS-S1樣品中,變形菌門最豐富,相對(duì)豐度達(dá)到89.37%。厚壁菌門在DCS樣品中的含量(0.14%)遠(yuǎn)低于樣品DCS-S3(32.71%)。相比之下,DCS中擬桿菌門相對(duì)豐度(12.53%)比DCS-S2(1.99%)高。

圖4 DCS微貯前后原料細(xì)菌門水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial composition in DCS samples at phylum level

在屬水平上(圖5),泛菌屬(Pantoea)是所有樣品中最豐富的分類屬,占19.16%～23.21%。DCS-S3中優(yōu)勢(shì)微生物鑒定為腸球菌屬(Enterococcus),其相對(duì)豐度為35.47%,而在DCS中相對(duì)豐度僅為0.14%,表明接種的LAB可促進(jìn)腸球菌的增殖。在微貯過程中,腸球菌能降低原料pH值并增加乳酸的量,特別是在發(fā)酵早期[24]。在低pH值,特別是4.00以下,可避免腐敗微生物的繁殖代謝,微貯過程接近停止。香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon index)結(jié)果表明,細(xì)菌群落的多樣性從DCS的3.787提高到DCS-S1的3.983,但DCS-S2(3.670)和DCS-S3(3.368)的細(xì)菌多樣性下降,主要是由于發(fā)酵后期LAB成為優(yōu)勢(shì)菌群,抑制了其他細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。乳桿菌屬在DCS中為0.00%,但在DCS-S2中顯著增加至14.76%,高于DCS-S3中的7.66%。因此,通過添加混合LAB和芽孢桿菌比單獨(dú)添加LAB可以更多地增加乳酸桿菌數(shù)量。寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)(17.34%)和鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)(11.61%)是DCS的主要屬,但它們?cè)谖①A樣品中變得不那么豐富。在DCS中未檢測(cè)到芽孢桿菌,雖然在DCS-S1和DCS-S2中有所添加,但微貯DCS-S1中芽孢桿菌的豐度較低(0.02%)。

圖5 DCS微貯前后原料細(xì)菌組成屬水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of bacterial composition in DCS samples at genus level

基于細(xì)菌OTU相對(duì)豐度的相似性分析結(jié)果表明(圖6)：所有樣品可以分成2類,一類由DCS和DCS-S1樣本組成。一類由DCS-S2和DCS-S3樣本組成。這種分類與微貯接種物是否添加LAB一致。因此,微貯通常依靠微生物(主要是LAB)將生物質(zhì)中的可溶性碳水化合物(water soluable carbohydrate,WSC)轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸(圖3-b)[25]。有機(jī)酸的產(chǎn)生將原料的pH值降低到4.00以下(圖3-a),抑制了其他微生物的生長(zhǎng),從而有效保存生物質(zhì)[26]。

圖6 基于DCS微貯前后原料細(xì)菌OTUs相對(duì)豐度 的相似性分析Fig.6 Analysis of similarity among DCS samples fermented by microorganism based on the relative abundance of bacterial OTUs

2.3 厭氧消化

本實(shí)驗(yàn)以DCS和微貯DCS-S3(28 d)為原料,比較不同AD工藝對(duì)DCS微貯前后的沼氣產(chǎn)量的影響,并考察微貯DCS-S3和ES/PM混合厭氧共消化對(duì)發(fā)酵沼氣的提高作用。由圖7結(jié)果可知,DCS經(jīng)過微貯后產(chǎn)生適量有機(jī)酸(特別是乳酸和乙酸)作為甲烷的前體物質(zhì),可以取代兩相AD的酸化過程,原料每天產(chǎn)氣率有了一定程度地提高；微貯DCS和廢棄物(ES/PM)厭氧共消化可有效緩解單一原料AD過程C/N不平衡問題,有效提高沼氣產(chǎn)率。

圖7 原料產(chǎn)氣率統(tǒng)計(jì)Fig.7 Statistics of dairy biogas yield with materials

由圖8結(jié)果可知,采用兩相AD對(duì)DCS進(jìn)行沼氣發(fā)酵,原料累積產(chǎn)氣量為292.06 mL/g TS,可超過傳統(tǒng)玉米秸稈完全混合式厭氧反應(yīng)器沼氣發(fā)酵水平[27]。這應(yīng)該是微好氧酸化過程中通氣有利于木質(zhì)纖維素成分的快速降解。有報(bào)道指出水解酸化細(xì)菌在通氣條件下可大量分泌纖維素酶,而在厭氧環(huán)境中,水解細(xì)菌產(chǎn)酶能力下降,且易受到反饋抑制的影響,分解率降低[28-29]。DCS微貯預(yù)處理可以取代兩相厭氧消化過程中的酸化過程,并對(duì)DCS起到一定的預(yù)處理作用。微貯DCS單相AD結(jié)果表明原料累積產(chǎn)氣量可達(dá)到411.46 mL/g TS,較DCS兩相AD提高了40.88%。

圖8 原料累積沼氣產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)Fig.8 Statistics of cumulative biogas yield with materials

提高反應(yīng)器性能和穩(wěn)定性的一種策略是多底物厭氧共消化[30]。本文將微貯DCS和ES/PM按照一定比例混合進(jìn)行單相厭氧共消化,累積沼氣產(chǎn)量分別達(dá)到500.97和599.39 mL/g TS(圖8),較單一原料AD有明顯提高。因此,有機(jī)廢棄物(含氮量高)和LCB(含碳量高)共同厭氧共消化是平衡底物成分的有利策略。重要的是,2種容易獲得的低成本原料含有互補(bǔ)的C和N含量,使其成為AD和可再生能源生產(chǎn)的理想底物[31]。將DCS、ES和PM混合厭氧共消化可以突破歐盟國(guó)家用帶穗玉米秸稈青貯作為主要原料的局限,使用干秸稈和各種有機(jī)廢棄物,適合中國(guó)國(guó)情,對(duì)徹底解決焚燒秸稈、剩余污泥填埋以及畜禽糞便面源污染問題有重要意義。

3 結(jié)論

通過對(duì)DCS進(jìn)行微貯預(yù)處理,考察了不同接種微生物組合對(duì)原料的主要成分影響及微貯樣品的細(xì)菌多樣性分析,比較了DCS兩相AD及微貯DCS單相AD在沼氣產(chǎn)量上的差異,探討了微貯DCS和ES/PM混合厭氧共消化對(duì)沼氣產(chǎn)率的提高作用,得出如下主要結(jié)論：

(1)微貯可以作為秸稈沼氣發(fā)酵的有效預(yù)處理方式之一。不同微生物組都能達(dá)到相應(yīng)的微貯效果,只是原料中的代謝產(chǎn)物(如乳酸、乙酸等)含量不同,不過LAB是較適合接種物,有利于產(chǎn)生有機(jī)酸,降低體系pH值；

(2)DCS經(jīng)過微貯后產(chǎn)生適量有機(jī)酸(特別是乳酸和乙酸)作為甲烷的前體物質(zhì),可以取代兩相AD的酸化過程,加快AD速度。另外,適量有機(jī)酸有利于維持AD體系緩沖能力(本實(shí)驗(yàn)裝置運(yùn)行2年來反應(yīng)體系pH值一直維持在7.2～7.5之間)；

(3)微貯DCS和廢棄物(ES/PM)厭氧共消化可有效緩解單一原料AD過程C/N不平衡問題,有效提高沼氣產(chǎn)率。