何菲,段佳文,蔣英麗,沈毅,李賀賀*,孫寶國

1(北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京,100048) 2(北京工商大學 中國輕工業(yè)釀酒分子 工程重點實驗室,北京,100048) 3(四川郎酒股份有限公司,四川 瀘州,646000)

白酒是由谷物發(fā)酵、蒸餾得到的高度飲料酒,含有種類眾多、組成復雜的風味物質(zhì),如醛、酸、酯和高級醇類等,這些微量成分決定了酒體的風格和特點[1]。醬香型白酒因其生產(chǎn)周期長、工藝復雜,風味成分非常豐富。貯存時間是保證醬香風格的重要工藝措施,通過貯存老熟能夠使新酒的異雜味減少,口感變得醇厚、柔和,香氣也得到改善[2-4]。

由于白酒常用的儀器設(shè)備,如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等,精密性較高,樣品大部分需要通過復雜的前處理才可進樣分析[5-8],這不僅造成風味成分的損失,而且耗時耗力。因此,開發(fā)一種簡單、快速、準確、無損的白酒分析方法是十分必要的。離子遷移色譜(ion mobility spectrometry,IMS)技術(shù)起源于20世紀60年代末70年代初,它是基于不同的氣相離子在電場中遷移速度的差異來對物質(zhì)進行表征的一項分析技術(shù)[9-10]。作為一種化學物質(zhì)檢測方法,IMS具有前處理簡單、檢測速度快、靈敏度高、體積小、成本低且無需真空系統(tǒng),在常壓下就可進行分析檢測等優(yōu)點[11-14],早期常用于防化偵察、應急反恐和緝毒緝私等[15]。近年來,隨著氣相色譜和離子遷移色譜的逐漸發(fā)展,將二者串聯(lián)的儀器應運而生,氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)結(jié)合了氣相色譜和離子遷移色譜技術(shù)的特點,具有雙重分離及檢測能力,已廣泛應用于食品領(lǐng)域,如肉蛋類制品、油脂類、水產(chǎn)品、面包等[16-20]。

由于受乙醇的影響,IMS技術(shù)在酒類方面的研究多局限于低度酒,如葡萄酒、韓國真露燒酒、黃酒、荔枝酒、青梅酒等[21-25]。最早將其應用于白酒等高度酒的研究始于2014年,彭麗英等[26]利用實驗室自制的離子遷移譜儀器建立了快速檢測白酒中痕量鄰苯二甲酸酯的方法。文獻調(diào)研顯示,GC-IMS應用于白酒等高度酒類的研究尚處于初步階段,且相關(guān)實驗條件并未優(yōu)化。因此,本文利用模擬酒樣探究了鹽離子、酒精度、平衡體積、平衡溫度和平衡時間對儀器分析效果的影響,選出了最優(yōu)實驗條件,并將其應用于不同貯存年限的醬香型白酒物質(zhì)變化的研究,為GC-IMS更好地應用于白酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

酒樣：同一輪次不同貯存時間的郎酒樣品各10 mL,詳見表1。

乙醇,色譜級,美國Sigma-Aldrich公司；超純水,德國Milli-Q公司；乙酸乙酯、乙酸丁酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇、正己醇、乙酸、糠醛均為色譜純95%以上,Sigma-Aldrich公司；2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮均為分析純,北京國藥集團化學試劑有限公司,用于校準保留指數(shù)；NaCl,分析純,薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司。

表1 不同貯存時間郎酒樣品信息表Table 1 Information of Langjiu Baijiu samples with different storage time

LAL 1T型酒精濃度計,廣州市速為電子科技有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、DB-FFAP毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent 科技有限公司；FlavourSpec?離子遷移色譜,德國 G.A.S Dortmund公司；Acrichi自動頂空進樣器、20 mL頂空進樣瓶,北京聚芯追風科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬酒樣配制

考慮到白酒在蒸餾過程中餾酒前段基酒乙醇含量較高,約為70%～80%[27-28],因此,用色譜級乙醇和超純水配制80%模擬酒樣,添加化合物及濃度如表2所示。

表2 模擬酒樣中揮發(fā)性化合物信息表Table 2 Information of volatile compounds in simulated Baijiu samples

這些物質(zhì)均為白酒中含量較高的重要風味物質(zhì),其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯為構(gòu)成酒體的四大酯類,約占白酒總酯含量的 90%～95%,戊酸乙酯,乙酸丁酯、異丁酸乙酯為白酒貢獻了重要的花果香及甜香；異戊醇和正己醇為白酒中重要的醇類物質(zhì),其中異戊醇對維持白酒風格具有重要作用,含量過低,會失去白酒固有風格；乙酸為白酒主要的揮發(fā)性酸,主要起呈味作用；糠醛在各類白酒中含量均較高,為白酒帶來了焦糊風味[29-30]。因此,選擇以上物質(zhì)作為模擬酒樣的添加物質(zhì)。

1.2.2 前處理條件優(yōu)化

首先考慮鹽離子對酒樣中物質(zhì)檢測的影響,以30%模擬酒樣作為樣品,對不加鹽與加鹽至飽和樣品進樣分析,確定酒樣的檢測是否需要加鹽處理。其次,對酒精度進行優(yōu)化,以80%模擬酒樣作為母液,分別用超純水稀釋配制成酒精度為80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%和10%的一系列模擬酒樣,分別取1 mL于潔凈頂空瓶中,在60 ℃下平衡10 min進樣分析,探究酒精度對實驗結(jié)果的影響；其次,以30%作為節(jié)點,配制相同物質(zhì)含量、不同酒精度(30%、20%、10%、7%、5%)的模擬酒樣,采用同上相同的分析方法,找出最適合GC-IMS分析的酒精度。最后,以最優(yōu)酒精度配制模擬酒樣作為樣品,對平衡體積(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL)、平衡溫度(20、30、40、50、60、65 ℃)、平衡時間(0、2、4、6、8、10 min)進行優(yōu)化,以上實驗均平行3次。

1.2.3 真實酒樣制備

取適量樣品于10 mL離心管中,用超純水對酒樣進行稀釋處理。

1.2.4 GC-IMS條件

自動進樣器條件：爐溫設(shè)定(平衡溫度)依實驗情況而定,管溫設(shè)定為90 ℃,閥溫設(shè)定為85 ℃；取樣時間20 s,進樣時間20 s,加壓時間30 s,反吹時間1 min,分析周期50 min。

GC條件：DB-FFAP色譜柱,分析時間50 min；載氣為N2(純度≥99.999%)；升溫程序：初始溫度40 ℃,保持5 min；以2 ℃/min升溫至80 ℃,保持3 min；最后以10 ℃/min升溫至230 ℃,不保持；以240 ℃后運行3 min。

IMS條件：β射線,3H為放射源；漂移氣為N2(純度≥99.999%)；漂移氣流速150 mL/min；漂移管溫度45 ℃；正離子化模式。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

通過儀器自帶分析軟件LAV(Laboratory Analytical Viewer)、定性軟件GC×IMS Library Search(NIST-2014、IMS數(shù)據(jù)庫) 進行化合物定性。運用LAV中插件Reporter進行樣品GC-IMS譜圖對比,用插件Gallery Plot進行GC-IMS指紋圖譜的對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽離子

圖1為GC-IMS分析鹽離子對模擬酒樣檢測影響的結(jié)果圖,所有圖均經(jīng)過歸一化處理。其中圖1-a為二維譜圖,遷移時間1.0處的垂直紅線表示反應離子峰(reaction ion peak,RIP),RIP兩側(cè)的每個點代表一種化合物,點的顏色深淺及面積表示物質(zhì)含量大小,紅色越深、面積越大表示含量越高。圖1-b為差譜圖,以不加鹽的模擬酒樣作為參照樣品,若其他酒樣中的物質(zhì)含量高于參照樣品,則顯示為紅點,反之為藍點。

a-二維譜圖；b-差譜圖圖1 鹽離子對模擬酒樣影響的GC-IMS分析譜圖Fig.1 GC-IMS spectrum showing the effect of salt ions on simulated liquor samples

從圖1-a對比可知,樣品中不加鹽與加鹽至飽和,物質(zhì)的出峰情況基本相同,即物質(zhì)含量基本相同。圖1-b對比可知,加鹽至飽和的模擬酒樣中物質(zhì)的含量較不加鹽稍低,因此,確定對于酒樣的分析采取不加鹽的措施,直接取樣分析。

2.2 酒精度

圖2為GC-IMS分析不同酒精度的模擬酒樣結(jié)果圖。其中,圖2-a二維譜圖上方紅色曲線表示化合物峰體積之和變化情況,圖2-b、圖2-d和圖2-f差譜圖分別以酒精度為30%、30%和10%的模擬酒樣作為參照樣品。

a-10%～80%模擬酒樣二維譜圖；b-10%～80%差譜圖；c-10%～30%模擬酒樣二維譜圖； d-10%～30%差譜圖；e-5%～10%模擬酒樣二維譜圖；f-5%～10%差譜圖圖2 不同酒精度模擬酒樣GC-IMS分析譜圖Fig.2 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different alcohol contents

從圖2-a對比可知,隨著酒精度的上升,即稀釋倍數(shù)的減小,多數(shù)化合物的含量呈先上升后下降的變化趨勢,當酒樣酒精度為30%時化合物含量達到最大值,說明酒精度為30%是GC-IMS正常工作所能承受的最大酒精度,當酒樣酒精度≥40%時,一些物質(zhì)的峰強度明顯減小,物質(zhì)總含量顯著下降。同理,圖2-b中酒精度<30%的模擬酒樣,隨酒精度的升高,藍色面積逐漸減小,即物質(zhì)含量逐漸增加；酒精度>30%的樣品,隨酒精度的升高,藍色逐漸加深且面積逐漸增大,即物質(zhì)含量逐漸降低。分析顯示主要有以下2個原因:首先,在有限空間的頂空瓶中,高濃度的乙醇揮發(fā)至頂空,占據(jù)了大量空間,當蒸氣壓達到飽和時,便抑制了其他化合物的揮發(fā),因此,乙醇含量越高,對其他物質(zhì)的揮發(fā)抑制作用越大；其次,酒精度過高也會對IMS檢測造成影響,此時乙醇含量對儀器的影響不可忽略。所以,為保證實驗結(jié)果的準確性,需將樣品稀釋后再進樣分析。

最后,以酒精度30%作為節(jié)點,分析酒精度<30%時不同酒精度、相同物質(zhì)含量下物質(zhì)的出峰情況,以期找到最優(yōu)的酒樣稀釋度數(shù)。結(jié)果如圖2-c～圖2-f所示,當酒精度>10%時,隨酒精度的升高,物質(zhì)的含量呈逐漸減小的趨勢；當酒精度<10%時,隨酒精度的降低,物質(zhì)含量稍有降低,后幾乎不變,說明酒精度10%為最佳稀釋度數(shù)。

2.3 平衡體積

圖3為GC-IMS分析不同平衡體積的模擬酒樣結(jié)果。

a-二維譜圖；b-三維譜圖圖3 不同平衡體積GC-IMS 分析譜圖Fig.3 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different equilibrium volumes

從圖3-a和圖3-b對比可知,隨樣品平衡體積的增加,物質(zhì)的總含量呈現(xiàn)先上升后緩慢波動下降的趨勢,到1和2 mL時達到最大值。從圖3-b也可知,當平衡體積為1和2 mL時,酒樣中被檢測到的化合物最多,含量最高。由于1和2 mL樣品中被檢測到的物質(zhì)濃度相近,根據(jù)綠色、節(jié)約原則,選則1 mL作為最優(yōu)平衡體積。

2.4 平衡溫度

圖4為GC-IMS分析不同平衡溫度的模擬酒樣的結(jié)果圖,其中圖4-b和圖4-d差譜圖均以平衡溫度為60 ℃的模擬酒樣作為參照樣品。

a-10～60 ℃二維譜圖；b-10～60 ℃差譜圖；c-60和65 ℃二維譜圖； d-60和65 ℃差譜圖圖4 不同平衡溫度GC-IMS分析譜圖Fig.4 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different equilibrium temperatures

圖4-a和圖4-b對比可知,隨平衡溫度的增加,物質(zhì)的總含量呈逐漸增加的趨勢,到60 ℃時達到最大值。其次,補充了平衡溫度60和65 ℃的物質(zhì)出峰情況對比(圖4-c和圖4-d),當平衡溫度為65 ℃時,物質(zhì)的總含量明顯低于60 ℃,因此,60 ℃為平衡溫度的拐點,低于或高于此溫度,物質(zhì)的出峰均有減弱的趨勢。綜合來看,當平衡溫度為60 ℃時,總的物質(zhì)濃度最高,因此確定最優(yōu)的平衡溫度為60 ℃。

2.5 平衡時間

圖5為GC-IMS分析不同平衡時間的模擬酒樣結(jié)果圖。其中,圖5-b差譜圖以平衡時間為0 min的模擬酒樣作為參照樣品。從圖5-a和圖5-b對比可知,隨樣品平衡時間的增加,物質(zhì)的總含量呈現(xiàn)逐漸上升的變化趨勢,到10 min時達到最大值?？傮w來說,平衡時間為10 min時物質(zhì)的總含量最高。

a-二維譜圖；b-差譜圖圖5 不同平衡時間GC-IMS分析譜圖Fig.5 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different equilibrium times

2.6 同一輪次不同貯存時間的醬香型白酒分析

利用上述最優(yōu)實驗條件,對同一輪次不同貯存時間的醬香型白酒樣品進行分析,包括單體和二聚體共積分了143個峰,其中通過譜庫檢索共定性出65個峰,45種化合物,如表3所示,包括15種酯類、8種醇類、1種酸類、9種醛類、8種酮類、2種含氮化合物、1種含硫化合物和1種其他。

利用LAV軟件對樣品及物質(zhì)進行對比分析,結(jié)果如圖6所示,其中圖6-a為不同貯存時間酒樣的二維遷移譜圖,圖6-b為指紋圖譜,圖中每一行代表1個樣品,每個樣品列出了平行2次的結(jié)果,每一列代表1個物質(zhì),后綴“M(Monomer)”表示物質(zhì)的單體,“D(Dimer)”表示物質(zhì)的二聚體,當物質(zhì)濃度較高時,會出現(xiàn)2個化合物共用1個水合離子(或電子)的情況。二維譜圖對比了不同酒樣間物質(zhì)數(shù)量及含量的差異情況,從圖中可以發(fā)現(xiàn)15及20年的酒樣中物質(zhì)濃度顯著高于其他酒樣,結(jié)合指紋圖譜可以發(fā)現(xiàn),位于綠色框中的物質(zhì)乙酸丁酯、己酸丙酯等在15及20年酒樣中含量顯著升高,可能與這2個樣品貯存后期酸和醇的酯化反應有關(guān)。橘色框中2-庚酮、2-甲基丁酸乙酯等在不同貯存時間的酒樣中隨貯存時間的延長呈逐漸增長的趨勢,說明這些化合物在貯存較久的酒樣中有一定的積累,且年份越長的酒樣中含量越高,其中酯類物質(zhì)的增長與酯化反應及貯存過程酒體中金屬離子形成膠體有關(guān),減少了酯的揮發(fā)和水解；丁醇、糠硫醇、2-丙酮、2-庚酮等沸點高、極性大、不易揮發(fā),隨貯存時間延長逐漸積累；醛類物質(zhì)的升高與醇類物質(zhì)的氧化有關(guān)。紅色框中乳酸乙酯、乙酸乙酯等隨貯存時間的延長呈降低的趨勢,這與其在貯存過程中逐漸水解有關(guān)；芳樟醇和2-丙醇沸點低、易揮發(fā)；辛醛的減少與酒中的溶解氧氧化有關(guān)。黑色框中2-甲基丙醇、異戊醇等隨貯存時間的延長呈先上升后下降的變化趨勢,這類物質(zhì)可能是內(nèi)部物質(zhì)合成或者是分解的產(chǎn)物,后期的降低可能與其參與氧化反應有關(guān)。此外,除了已定性的化合物剩余未知化合物有待于進一步鑒定研究。

表3 通過GC-IMC對同一輪次不同貯存時間醬香型白酒 揮發(fā)性化合物的定性結(jié)果Table 3 Volatile compounds of sauce flavor Baijiu with different storage times by GC-IMS

續(xù)表3

續(xù)表3

a-二維譜圖；b-指紋圖譜圖6 同一輪次不同貯存時間醬香型白酒GC-IMS分析譜圖Fig.6 GC-IMS spectrum of sauce-flavor Baijiu in the same round and different storage time

3 結(jié)論與討論

實驗利用模擬酒樣探究了GC-IMS應用于白酒研究的最優(yōu)條件。首先,確定了酒樣不需要加鹽處理；其次,確定了GC-IMS正常工作所能檢測酒樣的最高酒精度為30%,最優(yōu)酒樣稀釋度數(shù)為10%；最后,確定了最優(yōu)平衡體積、平衡溫度和平衡時間,分別為1 mL、60 ℃和10 min。在最優(yōu)條件下,對同一輪次不同貯存時間的郎酒樣品進行分析,發(fā)現(xiàn)貯存時間不超過10年的樣品中,物質(zhì)含量緩慢變化,多數(shù)物質(zhì)在不同貯存時間的樣品中隨貯存時間的延長呈現(xiàn)增長的趨勢,其中乙酸丁酯、己酸甲酯、戊醇、戊酸乙酯、庚酸乙酯、異己酸乙酯、己酸丙酯、己醇、辛酸乙酯、2-戊酮、戊醛在貯存時間為15及20年的酒樣中含量顯著高于其他貯存時間的酒樣。

通過對酒精度、平衡體積及平衡溫度等條件的優(yōu)化建立了快速、無損、痕量的白酒檢測新方法,為GC-IMS應用于白酒等高度酒領(lǐng)域提供理論與方法借鑒。但是,由于儀器自帶數(shù)據(jù)庫中化合物數(shù)量有限,定性方面還存在一定的不足,因此,建立完整成熟的數(shù)據(jù)庫和實驗方法是GC-IMS應用于各個領(lǐng)域的必要基礎(chǔ)。