玉米秸稈汽爆料生產(chǎn)纖維素酶

王蓓,陳吉寶*,閻振麗,趙子高,李超

1(南陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,河南 南陽(yáng),473000) 2(天冠南陽(yáng)纖維乙醇有限公司,河南 南陽(yáng),473000) 3(河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司 車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室,河南 南陽(yáng),473000)

我國(guó)已明確提出2030年實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰,非化石能源占一次能源消費(fèi)比重達(dá)到25%左右的碳減排目標(biāo)。據(jù)報(bào)道,纖維素乙醇全生命周期的溫室氣體排放相對(duì)于等熱值汽油具有明顯的碳減排效應(yīng)；而在纖維乙醇生產(chǎn)的纖維質(zhì)原料水解糖化過(guò)程中,酶水解法以其條件溫和、環(huán)境污染小的優(yōu)勢(shì)具有巨大的應(yīng)用潛力。目前運(yùn)行的纖維乙醇生產(chǎn)多以外購(gòu)酶為主,發(fā)酵生產(chǎn)出來(lái)的粗酶液加工成可儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)纳唐访钢苿┬枰獜?fù)雜的后加工工藝過(guò)程,在增加生產(chǎn)費(fèi)用的同時(shí)還造成一定的損耗,加上包裝、運(yùn)輸?shù)荣M(fèi)用,顯著增加了纖維乙醇生產(chǎn)企業(yè)用酶的成本[1-3]。傳統(tǒng)的纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)多以富含纖維素的微晶纖維素或高誘導(dǎo)性的乳糖為碳源,導(dǎo)致纖維素酶的發(fā)酵成本居高不下。本文以玉米秸稈汽爆料為發(fā)酵原料,通過(guò)就地利用秸稈汽爆預(yù)處理料作為培養(yǎng)基碳源生產(chǎn)纖維素酶,并對(duì)其進(jìn)行原位水解糖化,不僅降低了原料成本,同時(shí)生產(chǎn)出的纖維素酶具有良好的作用效果,極具推廣價(jià)值[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

工業(yè)用里氏木霉菌株(Trichodermareesei)TGC521,保藏編號(hào)CGMCC No.9537,由實(shí)驗(yàn)室自主分離選育。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：100 g/L麩皮汁培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：天冠集團(tuán)玉米秸稈汽爆料30、玉米漿1.5,KH2PO41.0、MgSO40.5、(NH4)2SO45。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：玉米秸稈汽爆料100、(NH4)2SO420。

1.1.3 試劑及儀器

玉米秸稈汽爆料取自河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司,其他原料均為市購(gòu),試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。

SHA-C型恒溫振蕩器,常州國(guó)華電器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-BM-8CA型光學(xué)顯微鏡,上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司；TDL-5A型低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；50 L全自動(dòng)發(fā)酵罐,上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)方法

搖瓶實(shí)驗(yàn)：從里氏木霉固體斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)孢子,接種于裝液量為50 mL/250 mL三角瓶麩皮汁培養(yǎng)基,29 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。按5%體積分?jǐn)?shù)接種量接種至裝液量100 mL/500 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃,250 r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5 d,發(fā)酵液離心,取上清液測(cè)定纖維素酶活力。

發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)：50 L發(fā)酵罐中裝液量35 L,以10%接種量接入菌液,于28～30 ℃,200～400 r/min,以氨水調(diào)節(jié)pH值維持4.5～4.8條件下培養(yǎng)5～7 d,發(fā)酵72 h后每隔12 h取樣1次,測(cè)定酶活力；發(fā)酵過(guò)程中將補(bǔ)料培養(yǎng)基以3 500 mL/5 000 mL瓶裝量滅菌后置于磁力攪拌器上攪拌,通過(guò)蠕動(dòng)泵將物料泵入發(fā)酵罐內(nèi),調(diào)整蠕動(dòng)泵流速控制補(bǔ)料量,以達(dá)到控制還原糖濃度、溶氧的目的。

初始碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響：以汽爆秸稈中纖維素含量為標(biāo)準(zhǔn),設(shè)置20、30、40、50 g/L纖維素質(zhì)量濃度梯度,考察不同初始碳源濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

初始氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響：選擇5 g/L硫酸銨、20 g/L蛋白胨、20 g/L酵母粉、20 g/L玉米漿等有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源,考察不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

麩皮對(duì)產(chǎn)酶的影響：設(shè)置2.5、5.0、7.5、10.0 g/L麩皮質(zhì)量濃度梯度,考察麩皮對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)對(duì)影響產(chǎn)酶的各因子水平及交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳濃度為中心點(diǎn),進(jìn)行4因素3水平的實(shí)驗(yàn)。

溶解氧對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和通氣比控制發(fā)酵過(guò)程相對(duì)溶氧在一定范圍內(nèi),考察溶氧對(duì)產(chǎn)酶的影響。

還原糖濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響：通過(guò)補(bǔ)料調(diào)整發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量在一定范圍內(nèi),考察還原糖含量對(duì)產(chǎn)酶的影響。

水解實(shí)驗(yàn)：設(shè)置800 mL酶解體系,秸稈汽爆料為水解對(duì)象,固形物含量20%；以秸稈汽爆料為原料生產(chǎn)的纖維素酶為水解酶進(jìn)行水解糖化,纖維素酶添加量為15 U/g絕干物料；于(50±0.5)℃、pH 4.8～5.0條件下進(jìn)行水解,初始投料量為全部投料量的1/4,其余3/4分5次投入,初始加入酶的劑量為全部酶添加量的2/3,補(bǔ)料3次后,加入余下的1/3纖維素酶繼續(xù)酶解。酶解時(shí)間48～60 h,測(cè)定終產(chǎn)物葡萄糖含量。

1.1.5 分析方法

濾紙酶活力的測(cè)定：參照康東亮等[5]方法。

還原糖含量及葡萄糖含量測(cè)定：參照龔愛(ài)姣[6]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

以蒸汽爆破處理后的玉米秸稈為碳源,以汽爆秸稈中纖維素含量為標(biāo)準(zhǔn),設(shè)置不同纖維素含量濃度梯度,考察碳源濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)碳源質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí),酶活力水平最高,達(dá)28.24 U/mL。分析認(rèn)為,碳源濃度低,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,不利于菌絲生長(zhǎng)[7]；濃度過(guò)高,由于汽爆后的秸稈吸水性強(qiáng),導(dǎo)致培養(yǎng)基流動(dòng)性差,發(fā)酵過(guò)程供氧不足,極易形成大量孢子,亦不利于菌絲正常生長(zhǎng),更不利于產(chǎn)酶[8]。綜合考慮,秸稈蒸汽爆破料碳源質(zhì)量濃度(以纖維素含量計(jì))以40 g/L最為適宜。

圖1 碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon source concentration on enzyme production

2.1.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同種類的氮源對(duì)產(chǎn)酶有極大的影響[9],如圖2所示,以有機(jī)氮酵母粉和無(wú)機(jī)氮(NH4)2SO4為主要氮源時(shí)的酶活力最高,這與發(fā)酵過(guò)程中速效氮源與緩效氮源配合使用利于菌絲生長(zhǎng)密切相關(guān),同時(shí)也有利于酶的分泌,然而酵母膏價(jià)格昂貴不利于規(guī)?；a(chǎn)[10],玉米漿相對(duì)便宜,且富含菌絲生長(zhǎng)所需氨基酸等,與硫酸銨配合使用更具經(jīng)濟(jì)性,最適宜氮源組合為 5 g/L(NH4)2SO4+20 g/L玉米漿。

圖2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on enzyme production 注：1-(NH4)2SO4；2-蛋白胨；3-酵母粉；4-玉米漿； 5-(NH4)2SO4+酵母粉；6-(NH4)2SO4+玉米漿

2.1.3 麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

麩皮作為粗纖維原料在絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程中,一方面利于菌絲附著成團(tuán),避免發(fā)酵過(guò)程中攪拌的剪切作用對(duì)菌絲的破壞,另一方面也為菌絲生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)因子。但麩皮本身含有一定量的淀粉,用量過(guò)大增加了發(fā)酵液黏度,不利于氧的溶解,易造成發(fā)酵初期孢子的大量形成,不利于產(chǎn)酶；麩皮中本身含有糖分,對(duì)于木霉菌株產(chǎn)酶可能存在反饋抑制,亦不利于產(chǎn)酶。因而適量的麩皮有助于酶活力的提高[11]。如圖3所示,當(dāng)麩皮質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L時(shí),酶活力最低,這可能與麩皮用量過(guò)大,發(fā)酵初期菌絲生長(zhǎng)過(guò)旺,耗氧量大,加之發(fā)酵液黏稠,溶氧明顯不足,導(dǎo)致孢子過(guò)早形成,加速菌絲衰老,最終酶活力低。而麩皮質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí)又表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)因子缺乏,不利于菌絲生長(zhǎng),結(jié)果顯示5 g/L麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶最為有利。

圖3 麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of adding amount of bran on enzyme production

2.1.4 利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Box-Behnken進(jìn)行培養(yǎng)基組合優(yōu)化

利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)軟件對(duì)影響產(chǎn)酶水平各因子的水平及交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)。以單因素試驗(yàn)確定的最佳濃度為中心點(diǎn),進(jìn)行4因素3水平的實(shí)驗(yàn)。各因素水平的選取和結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1結(jié)果,以酶活力(Y)為響應(yīng)值,利用Design-Expert.V 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到酶活力Y關(guān)于X1、X2、X3、X4這4個(gè)顯著因素的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=-79.97 + 4.56X1+0.68X2+ 0.87X3+2.20X4+0.01X1X2+0.008X1X3-0.034X1X4-0.011X1X3-0.026X1X4+0.067X3X4-0.06X12-0.072X22-0.020X32-0.090X42,對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次響應(yīng)方差分析得到的結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而且4個(gè)因素之間存在交互作用,各交互項(xiàng)交互作用不顯著。模型P<0.001,表明該模型具有較高的顯著性；而模型的失擬項(xiàng)不顯著(P=0.520 5),因此可利用該模型對(duì)酶活力進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Response surface experiment design and result

表2 響應(yīng)面方差分析Table 2 Response surface variance analysis

2.1.5 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸模型繪制交互作用等高線圖和曲面圖(圖4)。響應(yīng)面圖形開(kāi)口均朝下,玉米秸稈汽爆料、(NH4)2SO4濃度、玉米漿濃度和麩皮濃度均存在極值點(diǎn),響應(yīng)面覆蓋了最大值所在區(qū)域。由圖4-a、圖4-b可知,在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件范圍內(nèi),隨著汽爆料濃度、(NH4)2SO4濃度及汽爆料濃度、玉米漿濃度的不斷增大,發(fā)酵酶活力均呈先升后降趨勢(shì),當(dāng)汽爆料質(zhì)量濃度為40 g/L、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為5.0 g/L、當(dāng)玉米漿質(zhì)量濃度為30 g/L酶活力水平有最大值。由圖4-c、圖4-d可以看出,當(dāng)麩皮質(zhì)量濃度為5.0 g/L時(shí),酶活力水平有最大值。

a-汽爆料與(NH4)2SO4濃度交互作用；b-汽爆料與玉米漿濃度交互作用； c-汽爆料與麩皮濃度交互作用；d-(NH4)2SO4濃度與麩皮濃度交互作用圖4 各因素交互作用Fig.4 Diagram of interaction between diffirent factors

2.1.6 回歸模型的驗(yàn)證

根據(jù) Design-Expert 軟件預(yù)測(cè),根據(jù)最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的因素條件確定最佳培養(yǎng)條件為：玉米秸稈汽爆料38.6 g/L、(NH4)2SO44.8 g/L、玉米漿質(zhì)量濃度29.7 g/L、麩皮質(zhì)量濃度5.3 g/L；在該條件下模型預(yù)測(cè)酶活力最大值為28.50 U/mL。采用上述最優(yōu)培養(yǎng)基重復(fù)實(shí)驗(yàn),酶活力均值為28.76 U/mL,實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值相符,說(shuō)明該模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2.1 溶氧對(duì)產(chǎn)酶的影響

真菌纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)酶是一個(gè)典型的好氧過(guò)程,其產(chǎn)酶和菌絲生長(zhǎng)對(duì)氧需求量極大,溶氧不足菌絲生長(zhǎng)緩慢,且極易形成孢子,加速菌絲衰老死亡,酶活力迅速下降。溶氧過(guò)多則易造成菌絲旺長(zhǎng),消耗大量營(yíng)養(yǎng)及能量,反而不利于產(chǎn)酶[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,當(dāng)發(fā)酵過(guò)程溶氧相對(duì)值控制在40%～50%,酶發(fā)酵水平最低,鏡檢表明,在高溶氧條件下菌絲密度大,菌絲細(xì)長(zhǎng),發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酶總體一直處于較低水平；當(dāng)降低發(fā)酵過(guò)程溶氧控制范圍后,發(fā)酵產(chǎn)酶活力水平呈升高趨勢(shì),但當(dāng)溶氧控制范圍降至10%～20%,發(fā)酵中期即有大量孢子形成,發(fā)酵酶活力增加幅度降低,表現(xiàn)為菌絲發(fā)酵產(chǎn)酶后勁不足。當(dāng)溶氧在20%～30%或30%～40%時(shí),菌絲生長(zhǎng)密度合適,菌絲粗壯成團(tuán),分枝多,酶活力水平高。綜合考慮發(fā)酵能耗及成本效應(yīng),溶氧控制以20%～30%最為適宜。

圖5 不同溶氧控制范圍對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Influence of different dissolved oxygen control ranges on enzyme production

2.2.2 還原糖濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是誘導(dǎo)酶,必須在誘導(dǎo)劑的作用下才能大量表達(dá)。不同的誘導(dǎo)劑對(duì)里氏木霉表達(dá)纖維素酶的誘導(dǎo)效果存在差異,誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的物質(zhì)主要是一些糖類,包括低聚糖、寡糖和單糖等。其中以槐糖的誘導(dǎo)效果最好,纖維素次之,乳糖和纖維二糖也有較好的誘導(dǎo)效果。由于純纖維素價(jià)格高,實(shí)際應(yīng)用中受到產(chǎn)酶成本的限制,不宜在規(guī)?；a(chǎn)中使用。而秸稈經(jīng)過(guò)蒸汽爆破處理后,物料中纖維素可作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)酶,同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中以分批補(bǔ)料方式不斷提供纖維素可實(shí)現(xiàn)持續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)酶,在增加碳源的同時(shí)提供誘導(dǎo)物可大大提高產(chǎn)酶活力[13-14]。補(bǔ)料過(guò)程中必然造成發(fā)酵液中還原糖的變化,如圖6所示,還原糖濃度過(guò)高則菌絲旺長(zhǎng),反饋抑制增強(qiáng),不利于產(chǎn)酶；濃度過(guò)低則導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足,菌絲生長(zhǎng)緩慢,極易衰老死亡；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),通過(guò)補(bǔ)料控制發(fā)酵過(guò)程還原糖含量,使得菌絲處于“半饑餓”狀態(tài)最利于產(chǎn)酶；比較分析認(rèn)為,當(dāng)發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度控制在2.0～3.0 g/L時(shí),發(fā)酵產(chǎn)酶酶活力水平最高。

圖6 不同還原糖濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Influence of different reducing sugar concentrations on enzyme production

2.3 纖維素酶原位水解糖化的應(yīng)用

以玉米秸稈蒸汽爆破物料為碳源生產(chǎn)的纖維素酶粗酶液用于蒸汽爆破料的原位水解糖化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)與文獻(xiàn)報(bào)到一致[15]。在酶解條件為50 ℃、pH 4.8,以15 U/g絕干汽爆物料添加量,附加一定量的木聚糖酶,在固形物含量為200 g/L酶解液中,葡萄糖含量可達(dá)75 g/L,纖維素轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%以上,該纖維素酶作用效果極佳,兼具產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的成本優(yōu)勢(shì)和性能優(yōu)勢(shì)。

表3 酶解作用結(jié)果Table 3 Results of enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)纖維素酶原位生產(chǎn)工藝發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究表明：對(duì)產(chǎn)酶影響最大的因素為玉米秸稈汽爆料、其次為玉米漿,這與菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性密切相關(guān),經(jīng)驗(yàn)證酶活力可達(dá)28.76 U/mL。確定最佳培養(yǎng)基配方為：汽爆料質(zhì)量濃度38.6 g/L,(NH4)2SO44.8 g/L,玉米漿質(zhì)量濃度29.7 g/L,麩皮質(zhì)量濃度5.3 g/L；KH2PO41.0 g/L、MgSO40.5 g/L。最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵相對(duì)溶氧控制范圍20%～30%；還原糖含量2.0～3.0 g/L；發(fā)酵時(shí)間144 h,不同發(fā)酵批次下纖維素酶活力水平保持在35～39 U/mL。

以該發(fā)酵工藝生產(chǎn)的纖維素酶原位水解糖化效果顯示,在低酶載量條件下可實(shí)現(xiàn)纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)85%以上。