劉旭東，朱思潔，劉良禹，張玉超，楊旭

1. 茅臺學(xué)院食品科學(xué)與工程系，仁懷 564507 2. 茅臺學(xué)院釀酒工程系，仁懷 564507 3. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)，是一類能夠顯著增加塑料制品柔韌性和拉伸性的持久性有機(jī)污染物，由于具有強(qiáng)烈的內(nèi)分泌干擾作用，目前已經(jīng)被多個國家和地區(qū)限制使用[1]。乙酰檸檬酸三丁酯(acetyl tributyl citrate, ATBC)由于其極低的內(nèi)分泌干擾作用被認(rèn)為是PAEs的替代物，美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)ATBC可在食品包裝材料中限量使用[2]。但是與PAEs類似，ATBC依然可以從包裝材料中遷移至產(chǎn)品中，遷移速率甚至高于PAEs[3]，人們可以通過多種途徑暴露于ATBC中。

目前對于ATBC的動物實(shí)驗(yàn)研究證明，250～1 000 mg·kg-1·d-1的ATBC暴露未對實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生明顯的生殖發(fā)育毒性，因此認(rèn)為ATBC是一類相對安全的增塑劑，安全暴露劑量可達(dá)250 mg·kg-1·d-1以上[4-5]，而對于其非生殖發(fā)育毒性的研究相對較少。雖然目前認(rèn)為ATBC的安全暴露濃度比較高，但是對于一些敏感性特殊人群，這些看似安全的暴露劑量可能并不安全。

一些基于實(shí)驗(yàn)動物的研究顯示，圍產(chǎn)期的污染物暴露會引起子代神經(jīng)遞質(zhì)的水平異常、腦組織損傷、神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)行為異常[6-7]。對于PAEs的毒性研究證明PAEs暴露后引起的氧化應(yīng)激是其重要的致?lián)p傷機(jī)制之一[8]，而腦組織作為耗氧量高、脂質(zhì)含量高而抗氧化系統(tǒng)薄弱的組織，很容易受到氧化應(yīng)激的影響[9]。研究表明，PAEs暴露會導(dǎo)致小鼠腦組織中活性氧(ROS)含量顯著升高，抗氧化性物質(zhì)含量/活性下降，引起生物大分子的損傷，持續(xù)高水平的氧化應(yīng)激可誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促炎癥因子表達(dá)量上升，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，動物認(rèn)知能力出現(xiàn)下降[10-11]。而對于ATBC圍產(chǎn)期暴露對于子代認(rèn)知能力及腦組織的影響尚未見報道。

本研究通過對子代小鼠的認(rèn)知能力和腦組織病理變化進(jìn)行檢測，研究在看似安全的暴露劑量下(<250 mg·kg-1·d-1)，圍產(chǎn)期ATBC暴露是否會對子代小鼠造成腦組織損傷，認(rèn)知能力是否會受到影響。同時對子代小鼠腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞活化、腦組織氧化應(yīng)激和促炎癥因子水平進(jìn)行檢測，探討可能的致?lián)p傷機(jī)制，為全面了解ATBC的安全性，確保ATBC的安全應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6小鼠雄性60只，雌性30只，6～8周齡，(22±2) g，購自于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物房中，小鼠置于無病原專用鼠籠內(nèi)，每天12 h光照和12 h黑暗，允許自由進(jìn)食和飲水。動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，室內(nèi)相對濕度為50%～70%，保持室內(nèi)安靜，避免強(qiáng)光照。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按雄性∶雌性數(shù)量為2∶1的比例進(jìn)行合籠過夜，次日以發(fā)現(xiàn)陰栓作為雌性小鼠受孕的標(biāo)準(zhǔn)，記為妊娠第1天(E1)，將每只孕鼠置于一個單獨(dú)的鼠籠中進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：酶標(biāo)儀(ELx800，Bio-Tek，美國)，多功能熒光酶標(biāo)儀(Hide Chameleon V，Hidex，芬蘭)，低溫冷凍離心機(jī)(5424R，Eppendorf，德國)，顯微鏡(DP73，Olympus，日本)，熒光顯微鏡(BZ-X，KEYENCE，日本)，Morris水迷宮分析軟件(ANY-MazeTM，Stoeling Co.，美國)，小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)(JLBehv-SD，上海吉量軟件科技有限公司，中國)，Image Pro Plus (IPP) 6.0(Media Cybernetics，美國)。

主要試劑及試劑盒：ATBC(純度>99%)、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)和硫代巴比妥酸(TBA)均購于美國Sigma-Aldrich公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。兔抗小鼠-膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體，兔抗小鼠-巨噬細(xì)胞特異性蛋白(Iba1)抗體和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購于美國Abcam公司。小鼠還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、5-羥基色胺(5-HT)檢測試劑盒和乙酰膽堿(ACh)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所(中國)。小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒和白介素17(IL-17)檢測試劑盒購于藍(lán)基生物公司(上海，中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與染毒

將孕鼠隨機(jī)分為4組，每組至少5只孕鼠，對孕鼠進(jìn)行連續(xù)的ATBC灌胃暴露，染毒濃度以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及增塑劑研究常用染毒劑量作為參考[12]，選擇在以往的ATBC毒性研究中對正常小鼠相對安全的暴露濃度作為本研究的暴露劑量[4-5]，將暴露劑量設(shè)定為2、20和200 mg·kg-1·d-1，以生理鹽水灌胃作為對照組(0 mg·kg-1·d-1)。將親代小鼠生產(chǎn)記為產(chǎn)后第1天(P1)，繼續(xù)對親代小鼠進(jìn)行灌胃暴露一直持續(xù)到子代小鼠斷乳(產(chǎn)后第21天，P21)。為排除行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中由于小鼠體力消耗對結(jié)果帶來的干擾，選擇體力相對較好的雄性子代小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從每個暴露組的雄性子代小鼠中隨機(jī)選擇10只，作為實(shí)驗(yàn)對象。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

在P15～P21，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對不同暴露組子代小鼠的認(rèn)知能力進(jìn)行檢測[13]，實(shí)驗(yàn)前5天(P15～P19)為定向航行實(shí)驗(yàn)，主要用來測試子代小鼠的學(xué)習(xí)能力，通過對比不同暴露組子代小鼠在水池中找到目標(biāo)平臺所花費(fèi)的時間，即逃逸潛伏期來判斷不同暴露組子代小鼠的學(xué)習(xí)能力強(qiáng)弱。每天對每只子代小鼠進(jìn)行3次訓(xùn)練，記錄每只子代小鼠的逃逸潛伏期。實(shí)驗(yàn)的第6天(P20)停止實(shí)驗(yàn)，為遺忘期。第7天(P21)開始空間探索實(shí)驗(yàn)，旨在測定不同暴露組子代小鼠的記憶能力，撤去逃逸平臺，讓子代小鼠在迷宮中游滿60 s，記錄子代小鼠在目標(biāo)平臺所在象限的時間和進(jìn)入次數(shù)及游泳軌跡。

1.5 跳臺實(shí)驗(yàn)

在P19～P21，通過跳臺實(shí)驗(yàn)對不同暴露組的子代小鼠的認(rèn)知能力進(jìn)行檢測[14]。P19～P20為訓(xùn)練期，訓(xùn)練時將小鼠輕輕置于金屬網(wǎng)上的木制平臺上，給小鼠2 min適應(yīng)周圍環(huán)境。2 min后對金屬網(wǎng)通電(36 V, 50 Hz)，通電持續(xù)5 min。一旦小鼠跳下平臺就會受到電擊，小鼠通常會再次跳回平臺。通過2 d的訓(xùn)練，在P21對小鼠的記憶能力進(jìn)行測定。記錄小鼠從置于平臺開始到第1次跳下平臺所持續(xù)的時間，即潛伏期；以及整個通電過程中小鼠跳下平臺的次數(shù)，即錯誤次數(shù)。

1.6 腦組織樣品的制備

在P22，用頸椎脫臼法處死子代小鼠，取小鼠全腦組織。每組隨機(jī)選擇3只小鼠全腦置于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定，制作組織切片進(jìn)行病理觀察，其余全腦組織用于制備腦組織勻漿。將小鼠腦組織置于冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.5)中洗凈，用吸水紙吸干水分，然后放至玻璃勻漿器中，加入冷的PBS制成10%的組織勻漿，然后在4 ℃下以10 000 r·min-1離心10 min，腦組織勻漿中蛋白質(zhì)含量采用Lowry法進(jìn)行測定[15]，將上清液分裝置于-80 ℃冰箱待用。

1.7 腦組織病理切片制作及免疫熒光觀察

對子代小鼠腦組織進(jìn)行石蠟包埋和切片，進(jìn)行H&E和Nissl染色[16]，隨后在顯微鏡下進(jìn)行切片觀察。對Nissl染色切片在腦海馬區(qū)隨機(jī)選擇5個視野區(qū)域，使用Image Pro Plus(IPP)6.0(Media Cybernetics，美國)軟件測出Nissl染色每張切片的光密度值(OD)進(jìn)行圖像定量分析[17]。采用抗體稀釋液將兔抗小鼠GFAP和Iba1抗體進(jìn)行稀釋(1∶200)作為一抗，F(xiàn)ICT標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，對腦切片進(jìn)行免疫熒光染色[18]，隨后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，同樣使用IPP 6.0對熒光強(qiáng)度進(jìn)行OD值測定。

1.8 5-HT和ACh含量測定

取1.6中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用5-HT和ACh檢測試劑盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.9 ROS含量測定

用PBS將1.6中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液稀釋100倍，采用DCFH-DA法檢測ROS含量[19]，利用熒光酶標(biāo)儀在485 nm激發(fā)光、525 nm發(fā)射光的條件下測定熒光強(qiáng)度，反映樣品中含有ROS的水平。

1.10 MDA含量測定

取1.6中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用TBA法測定丙二醛(MDA)的含量[20]，MDA能夠與TBA反應(yīng)縮合形成紅色產(chǎn)物，分別在532、600和450 nm波長下測定光吸光度值，按照公式：MDA (μmol·L-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450計(jì)算MDA的含量。

1.11 GSH含量測定

取1.6中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用GSH檢測試劑盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.12 SOD活性測定

取1.6中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用SOD活性檢測試劑盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.13 TNF-α和IL-17含量測定

取1.6中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用TNF-α和IL-17測試劑盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.14 統(tǒng)計(jì)分析

采用方差分析(ANOVA)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad Prism 8.0(San Diego，美國)生成，用SPSS 13.0(SPSS，美國)分析數(shù)據(jù)。采用多重ANOVA進(jìn)行水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，使用t檢驗(yàn)確定各暴露組之間的差異性，其他數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA，使用t檢驗(yàn)分析差異性。P<0.05和P<0.01表示兩組相比具有顯著性差異，分別使用“*”和“**”標(biāo)示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 子代小鼠認(rèn)知能力的變化

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過為期5 d的定向航行訓(xùn)練，各暴露組子代小鼠的逃逸潛伏期都在變短。在P18和P19，200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠逃逸潛伏期和對照組相比均出現(xiàn)了顯著性的下降(表1)。經(jīng)過P20的遺忘期，P21的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠在目標(biāo)平臺所在象限滯留時間(圖1(a))及進(jìn)入次數(shù)(圖1(b))顯著低于空白組子代小鼠。如圖1(c)所示，對照組子代小鼠游泳軌跡目的性強(qiáng)，這些小鼠的游泳軌跡相對集中于目標(biāo)平臺所在象限，而200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠游泳的無規(guī)則性較強(qiáng)，軌跡混亂。

跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露對子代小鼠跳臺潛伏期和錯誤次數(shù)均有顯著性影響。與對照組子代小鼠相比，200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠跳臺潛伏期顯著性下降(圖2(a))而錯誤次數(shù)顯著上升(圖2(b))。

2.2 子代小鼠腦組織病理學(xué)觀察

圍產(chǎn)期ATBC暴露之后子代小鼠腦海馬組織結(jié)構(gòu)的變化如圖3所示。H&E染色(圖3(a))結(jié)果顯示，空白對照組子代小鼠腦海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞整齊排列，細(xì)胞形態(tài)完整，呈多角形，錐體細(xì)胞頂狀樹突明顯可見，表現(xiàn)清晰。隨著暴露濃度增加至200 mg·kg-1·d-1，子代小鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散，混亂，細(xì)胞腫脹變圓，頂狀樹突消失。同時Nissl染色(圖3(b))結(jié)果顯示，20 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠CA1區(qū)還出現(xiàn)了Nissl染色顏色變淺，OD值顯著下降(圖4)，Nissl小體數(shù)量下降。

2.3 子代小鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

本研究選用星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP及小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1對圍產(chǎn)期ATBC暴露后子代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度進(jìn)行測定。如圖5(a)所示，對照組子代小鼠大腦皮層區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，胞體小，樹突細(xì)長，而隨著ATBC暴露濃度的升高細(xì)胞的胞體變大，樹突變短變粗，GFAP表達(dá)量也出現(xiàn)了明顯的上升(圖6(a))。如圖5(b)所示，對照組子代小鼠大腦皮層區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，樹突纖細(xì)，未有顯著的Iba1表達(dá)，而隨著暴露濃度升高，細(xì)胞胞體變大，樹突變短變粗，且出現(xiàn)刺棘，Iba1表達(dá)量也明顯上升(圖6(b))。

表1 不同暴露組子代小鼠每天的逃逸潛伏期Table 1 The escape latency of offspring mice of each training day in different groups (s)

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：(a)目標(biāo)象限停留時間；(b)進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)；(c)游泳軌跡；ATBC表示乙酰檸檬酸三丁酯；*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 1 The results of Morris water mazeNote: (a) The target quarter retention; (b) The number of target quarter entries; (c) The swimming route of each group offspring mice; ATBC means acetyl tributyl citrate; P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

圖2 跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：(a)跳臺潛伏期；(b)錯誤次數(shù)；*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 2 The results of step-down passive avoidance testNote: (a) Step down latency; (b) Number of errors; P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

2.4 子代小鼠腦組織5-HT和ACh含量的變化

子代小鼠腦組織中5-HT和ACh含量變化如圖7所示。200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露后子代小鼠腦組織中5-HT和ACh含量均出現(xiàn)了顯著性的下降。

2.5 子代小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的變化

子代小鼠腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化如圖8所示。20 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露后子代小鼠腦組織中ROS水平均顯著性升高(圖8(a))。200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露組子代小鼠還出現(xiàn)了腦組織MDA含量顯著升高(圖8(b))。20 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露組子代小鼠腦組織中GSH含量顯著性下降(圖8(c))。同時，200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露組子代小鼠腦組織SOD活性也出現(xiàn)了顯著性的下降(圖8(d))。

圖3 各暴露組子代小鼠腦組織病理觀察(10×40；bar=50 μm) 注：(a)H&E染色；(b)Nissl染色。Fig. 3 Offspring mice brain histopathological observation of each group (10×40; bar=50 μm)Note: (a) H&E stains; (b) Nissl stains.

圖4 各暴露組子代小鼠腦組織Nissl染色光密度值注：*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 4 The optical density of Nissl staining of offspring mice brain in different groupsNote: P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

2.6 子代小鼠腦組織TNF-α和IL-17含量的變化

子代小鼠腦組織中TNF-α和IL-17含量變化如圖9所示。200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露后子代小鼠腦組織中TNF-α和IL-17含量均有顯著性的升高。

3 討論(Discussion)

環(huán)境污染物暴露已被證明和很多疾病的發(fā)生有關(guān)[21]，雖然ATBC具有極低的生殖發(fā)育毒性，安全暴露劑量被認(rèn)為可達(dá)250 mg·kg-1·d-1，但是對于正常群體安全的ATBC暴露劑量對于特殊群體是否依然安全尚待研究，對于系統(tǒng)性評價ATBC安全性尤為重要。本研究選擇對于正常實(shí)驗(yàn)動物相對安全的暴露劑量(2、20和200 mg·kg-1·d-1)，對圍產(chǎn)期的小鼠進(jìn)行暴露，探究這些看似安全的暴露劑量對于特殊群體是否安全。

圖5 各暴露組子代小鼠腦組織免疫熒光染色觀察(10×40；bar=200 μm)注：(a) GFAP；(b) Iba1。Fig. 5 Offspring mice brain immunofluorescence staining observation of each group (10×40; bar=200 μm)Note: (a) GFAP; (b) Iba1.

圖6 各暴露組子代小鼠腦組織免疫熒光光密度值注：(a) GFAP光密度值；(b) Iba1光密度值；*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 6 The optical density of offspring mice brain immunofluorescence staining in different groupsNote: (a) OD of GFAP; (b) OD of Iba1; P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

圖7 各暴露組子代小鼠腦組織5-羥基色胺(5-HT)(a)和乙酰膽堿(Ach)(b)含量的變化注：*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 7 Serotonin (5-HT) (a) and acetylcholine (Ach) (b) content in offspring mice brain of each groupNote: P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

在Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)中，親代小鼠圍產(chǎn)期200 mg·kg-1·d-1的ATBC暴露導(dǎo)致子代小鼠需要花費(fèi)更多的時間才能找到逃逸平臺，訓(xùn)練第4天和第5天的逃逸潛伏期與對照組相比均出現(xiàn)了顯著性上升，說明子代小鼠的學(xué)習(xí)能力出現(xiàn)了下降。而在隨后的空間探索實(shí)驗(yàn)中，200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠在目標(biāo)平臺所在象限中停留的時間以及進(jìn)入該象限的次數(shù)與對照組相比都出現(xiàn)了顯著性的下降，游泳軌跡同樣體現(xiàn)出該組子代小鼠游泳具有盲目性，說明子代小鼠的記憶能力受到了影響。在跳臺實(shí)驗(yàn)中，200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠表現(xiàn)出了跳臺潛伏期顯著下降，而錯誤次數(shù)顯著上升，同樣說明子代小鼠的記憶力受到影響。神經(jīng)行為學(xué)檢測結(jié)果表明，親代小鼠圍產(chǎn)期200 mg·kg-1·d-1的ATBC暴露會導(dǎo)致子代小鼠認(rèn)知能力下降，而其他暴露組的子代小鼠并未出現(xiàn)顯著性變化。

腦海馬組織在認(rèn)知能力的形成中扮演著重要角色。當(dāng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元對信息進(jìn)行訪問時，神經(jīng)元會傳遞信息到海馬體，海馬會產(chǎn)生反應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)信息持久存在，形成記憶[22]。Nissl小體是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的重要物質(zhì)，很多蛋白質(zhì)包括神經(jīng)遞質(zhì)合成所需要的很多酶類都由Nissl小體合成，所以Nissl小體在很多神經(jīng)細(xì)胞損傷的研究中被視為一個重要指標(biāo)[23]。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。是腦組織中2種重要的膠質(zhì)細(xì)胞，以往的研究顯示，二者的高度活化會產(chǎn)生大量的ROS和細(xì)胞因子，這與很多神經(jīng)疾病以及神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)，而ROS、細(xì)胞因子和損傷的細(xì)胞等又可以進(jìn)一步激活這2類主要的膠質(zhì)細(xì)胞，以此循環(huán)反復(fù)，最終可能導(dǎo)致疾病和損傷的發(fā)生[24-25]。神經(jīng)遞質(zhì)在大腦的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，包括神經(jīng)發(fā)生、遷移和突觸的形成。它們還參與了正常大腦功能的許多方面，包括學(xué)習(xí)和記憶[9]。本研究的結(jié)果顯示，200 mg·kg-1·d-1暴露組子代小鼠腦海馬組織椎體神經(jīng)元形態(tài)改變，Nissl小體含量下降，同時腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和Ach含量出現(xiàn)了顯著性下降。隨著暴露濃度的提高，子代小鼠腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度也顯著上升。子代小鼠認(rèn)知能力的下降與以上變化有一定的聯(lián)系。

圖8 各暴露組子代小鼠腦組織活性氧(ROS)水平(a)、丙二醛(MDA)含量(b)、還原性谷胱甘肽(GSH)含量(c)、 超氧化物歧化酶(SOD)活性(d)的變化注：*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 8 The reactive oxygen species (ROS) level (a), malondialdehyde (MDA) content (b), glutathione (GSH) content (c) and superoxide dismutase (SOD) activity (d) in offspring mice brain of each groupNote: P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

圖9 各暴露組子代小鼠腦組織TNF-α(a)、IL-17(b)含量的變化注：*P<0.05、**P<0.01，與對照組相比。Fig. 9 TNF-α content (a) and IL-17 content (b) in offspring mice brain of each groupNote: P<0.05, **P<0.01, compared with control group.

氧化應(yīng)激是引起機(jī)體細(xì)胞損傷、死亡的重要機(jī)制之一，ROS含量增加會導(dǎo)致生物大分子的損傷[26-27]，在PAEs類塑化劑的毒性研究中已被證實(shí)[6]。本研究的結(jié)果顯示，親代小鼠圍產(chǎn)期200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露會導(dǎo)致小鼠腦組織中ROS的大量積累，脂質(zhì)過氧化程度增加，MDA含量顯著升高，而GSH和SOD等還原性物質(zhì)的含量/活性則出現(xiàn)了相應(yīng)的下降。這說明，親代小鼠圍產(chǎn)期200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露會導(dǎo)致子代小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平顯著性提高。根據(jù)氧化應(yīng)激分級模型，持續(xù)的高水平氧化應(yīng)激會進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，激活炎癥信號通路，可以將氧化應(yīng)激信號轉(zhuǎn)換成多種細(xì)胞內(nèi)活動的信號，其中就包含增加促炎癥因子表達(dá)量[28]。在本研究中，親代小鼠圍產(chǎn)期200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露會導(dǎo)致子代小鼠腦組織促炎癥因子TNF-α和IL-17含量顯著性提高，說明子代小鼠腦組織中高水平的氧化應(yīng)激誘發(fā)了炎癥水平的提高。

綜上所述，親代小鼠圍產(chǎn)期200 mg·kg-1·d-1ATBC暴露會引起子代小鼠腦組織氧化應(yīng)激，導(dǎo)致認(rèn)知能力下降、腦組織出現(xiàn)病理改變。200 mg·kg-1·d-1的ATBC暴露劑量在以往的研究中雖未能導(dǎo)致生殖發(fā)育毒性，但在本研究中，200 mg·kg-1·d-1的ATBC圍產(chǎn)期暴露對子代小鼠顯示出了一定程度的神經(jīng)毒性，而2 mg·kg-1·d-1和20 mg·kg-1·d-1的ATBC圍產(chǎn)期暴露對子代小鼠則相對安全。該研究結(jié)果為全面評價ATBC的安全性，確保其在人類生活中的安全使用提供了一定的參考。